相关申请本申请要求于2018年3月29日提交的美国专利申请15/940,901的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术：
：：使用过继性转移的肿瘤浸润淋巴细胞(til，tumorinfiltratinglymphocyte)治疗大体积、难治性的癌症代表了一种治疗预后不良患者的有效方法。gattinoni等，nat.rev.immunol.，2006，6，383-393。成功的免疫治疗需要大量的til，商业化需要稳健可靠的方法。由于细胞扩增的技术、物流和监管问题，这是一项需要实现的挑战。由于其速度和效率，基于il-2的til扩增随后进行“快速扩增过程”(rep，rapidexpansionprocess)已成为til扩增的优选方法。dudley等，science，2002，298，850-54；dudley等，j.clin.oncol.，2005，23，2346-57；dudley等，j.clin.oncol.，2008，26，5233-39；riddell等，science1992，257，238-41；dudley等，j.immunother.，2003，26，332-42。rep可以在14天内使til扩增1000倍，尽管它需要通常来自多个供体的、大量过量(例如200倍)的经辐照的同种异体外周血单核细胞((pbmc，peripheralbloodmononuclearcell)，也称为单核细胞(mnc))作为饲养细胞(饲养细胞)，以及抗cd3抗体(okt3)和高剂量的il-2。dudley等j.immunother.2003,26,332-42。经历rep程序的til在黑色素瘤患者的宿主免疫抑制后产生了成功的过继性细胞治疗。目前的输注接受参数(infusionacceptance参数)依赖于til组成的读数(例如cd28、cd8或cd4阳性)以及rep产物的倍数扩增和活力。目前的til生产方法受到时长、成本、无菌问题以及本文所述的其他因素的限制，使得此类方法商业化的潜力受到严重限制，并且由于这些和其他原因，目前尚无商业方法可用。迫切需要提供til生产方法和基于此种方法的治疗，其适用于商业规模生产，并获得在多个临床中心用于人类患者的监管批准。技术实现要素：本发明提供了改进的和/或缩短的扩增til和产生治疗性til群的方法。本发明提供了将肿瘤浸润淋巴细胞(til)扩增为治疗性til群的方法，该方法包括以下步骤：(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，从患者切除的肿瘤中获得第一til群；(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；(c)通过在包含il-2和可选的okt-3的细胞培养基中培养第一til群来进行第一次扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)通过向第二til群的细胞培养基中补充另外的il-2、可选的okt-3和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；其中，第三til群是治疗性til群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)收获从步骤(d)获得的治疗性til群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(f)将从步骤(e)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生。在一些实施方式中，该方法还包括以下步骤：使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的til群的输液袋。在一些实施方式中，冷冻保存方法使用1：1比率的收获的til群与冷冻保存培养基进行。在一些实施方式中，抗原呈递细胞是外周血单核细胞(pbmc)。在一些实施方式中，pbmc是经辐照且同种异体的。在一些实施方式中，在步骤(d)的第9天至14天中的任何一天将pbmc添加到细胞培养基中。在一些实施方式中，抗原呈递细胞是人工抗原呈递细胞。在一些实施方式中，步骤(e)中的收获使用基于膜的细胞处理系统进行。在一些实施方式中，步骤(e)中的收获使用lovo细胞处理系统进行。在一些实施方式中，多个碎片包括约4个至约50个碎片；其中，每个碎片的体积为约27mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约30个至约60个碎片，碎片总体积为约1300mm3至约1500mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总体积为约1350mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总质量为约1克至约1.5克。在一些实施方式中，在选自g容器和xuri细胞袋的容器中提供细胞培养基。在一些实施方式中，步骤(d)中的细胞培养基还包含il-15和/或il-21。在一些实施方式中，il-2浓度为约10,000iu/ml至约5,000iu/ml。在一些实施方式中，il-15浓度为约500iu/ml至约100iu/ml。在一些实施方式中，il-21浓度为约20iu/ml至约0.5iu/ml。在一些实施方式中，步骤(f)中的输液袋是含有hypothermosol的输液袋。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含二甲基亚砜(dmso)。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含7％至10％的二甲基亚砜(dmso)。在一些实施方式中，步骤(c)中的第一阶段和步骤(e)中的第二阶段各自在10天、11天或12天内进行。在一些实施方式中，步骤(c)中的第一阶段和步骤(e)中的第二阶段各自在11天内进行。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行约10天至约22天。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行约20天至约22天。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行约15天至约20天。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行约10天至约20天。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行约10天至约15天。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行22天以下。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行20天以下。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行15天以下。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行10天以下。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)和冷冻保存进行22天以下。在一些实施方式中，在步骤(e)中收获的治疗性til群包含足以达到til的治疗有效剂量的til。在一些实施方式中，足以达到治疗有效剂量的til的数量为约2.3×1010至约13.7×1010。在一些实施方式中，步骤(b)至步骤(e)在单个容器中进行；其中，与在超过一个的容器中进行步骤(b)至步骤(e)相比，在单个容器中进行步骤(b)至步骤(e)使得每个切除的肿瘤的til产量增加。在一些实施方式中，在步骤(d)的第二阶段期间，在不打开系统的情况下将抗原呈递细胞添加到til中。在一些实施方式中，当给受试者施用时，步骤(d)中的第三til群提供增加的疗效、增加的干扰素-γ产量、增加的多克隆性(polyclonality)、增加的平均ip-10和/或增加的平均mcp-1。在一些实施方式中，当给受试者施用时，步骤(d)中的第三til群提供至少5倍以上的干扰素-γ产量。在一些实施方式中，步骤(d)中的第三til群是治疗性til群，相对于第二til群，该治疗性til群包含增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，该治疗性til群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出选自下组的一种以上特征：cd27+表达、cd28+表达、端粒更长、cd57表达增加和cd56表达降低。在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，获自第三til群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出：cd57表达增加和cd56表达降低。在一些实施方式中，与开放系统相比，所述方法降低了微生物污染的风险。在一些实施方式中，将来自步骤(g)的til输注到患者体内。在一些实施方式中，多个碎片包括约4个碎片。本发明还提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(til)，包括以下步骤：(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，从患者切除的肿瘤中获得第一til群；(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；(c)通过在包含il-2和可选的okt-3的细胞培养基中培养第一til群来进行第一次扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)通过向第二til群的细胞培养基中补充另外的il-2、可选的okt-3和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；其中，第三til群是治疗性til群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)收获从步骤(d)获得的治疗性til群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(f)将从步骤(e)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；(g)可选地，使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的til群的输液袋；以及(h)给患者施用治疗有效剂量的第三til群，该第三til群来自步骤(g)的输液袋。在一些实施方式中，在步骤(e)收获的治疗性til群包含足以达到til在步骤(h)中施用的治疗有效剂量的til。在一些实施方式中，足以达到til在步骤(h)中施用的治疗有效剂量的til的数量为约2.3×1010至约13.7×1010。在一些实施方式中，抗原呈递细胞(apc)是pbmc。在一些实施方式中，在步骤(d)的第9天至14天中的任何一天将pbmc添加到细胞培养基中。在一些实施方式中，在步骤(h)中施用治疗有效剂量的til细胞之前，已给患者施用了非清髓性(non-myeloablative)淋巴细胞耗竭(lymphodepletion)方案。在一些实施方式中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨5天。在一些实施方式中，该方法还包括以下步骤：在步骤(h)中给患者施用til细胞后的第二天开始用高剂量il-2方案治疗患者。在一些实施方式中，高剂量il-2方案包括每8小时以15分钟静脉推注(bolusintravenousinfusion)方式施用600,000iu/kg或720,000iu/kg，直至耐受。在一些实施方式中，步骤(d)中的第三til群是治疗性til群，相对于第二til群，该治疗性til群包含增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，该治疗性til群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出选自下组的一种以上特征：cd27+表达、cd28+表达、端粒更长、cd57表达增加和cd56表达降低。在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，治疗性til群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出：cd57表达增加和cd56表达降低。在一些实施方式中，癌症选自：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(nsclc)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(hnscc))、肾癌和肾细胞癌(renalcellcarcinoma)。在一些实施方式中，癌症选自黑色素瘤、hnscc、宫颈癌和nsclc。在一些实施方式中，癌症是黑色素瘤。在一些实施方式中，癌症是hnscc。在一些实施方式中，癌症是宫颈癌。在一些实施方式中，癌症是nsclc。本发明还提供一种将肿瘤浸润淋巴细胞(til)扩增为治疗性til群的方法，该方法包括以下步骤：(a)将来自患者切除肿瘤的经处理的肿瘤碎片加入封闭系统中，获得第一til群；(b)通过在包含il-2和可选的okt-3的细胞培养基中培养第一til群来进行第一次扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(a)到步骤(b)的转变在不打开系统的情况下发生；(c)通过向第二til群的细胞培养基补充另外的il-2、可选的okt-3和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；其中，第三til群是治疗性til群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)收获从步骤(c)获得的治疗性til群；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(e)将步骤(d)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生。在一些实施方式中，在步骤(d)中收获的治疗性til群包含足以达到til的治疗有效剂量的til。在一些实施方式中，足以达到治疗有效剂量的til的数量为约2.3×1010至约13.7×1010。在一些实施方式中，该方法还包括以下步骤：使用冷冻保存方法冷冻保存包含收获的til群的输液袋。在一些实施方式中，冷冻保存方法使用1：1比率的收获的til群与冷冻保存培养基进行。在一些实施方式中，抗原呈递细胞是外周血单核细胞(pbmc)。在一些实施方式中，pbmc是经辐照且同种异体的。根据权利要求68的方法，其中，在步骤(c)的第9天至14天中的任何一天将pbmc添加到细胞培养基中。在一些实施方式中，抗原呈递细胞是人工抗原呈递细胞。在一些实施方式中，使用lovo细胞处理系统进行步骤(d)中的收获。在一些实施方式中，多个碎片包括约4个至约50个碎片；其中，每个碎片的体积为约27mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约30个至约60个碎片，碎片总体积为约1300mm3至约1500mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总体积为约1350mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总质量为约1克至约1.5克。在一些实施方式中，多个碎片包括约4个碎片。在一些实施方式中，在选自g容器和xuri细胞袋的容器中提供第二细胞培养基。在一些实施方式中，步骤(e)中的输液袋是含有hypothermosol的输液袋。在一些实施方式中，步骤(b)中的第一阶段和步骤(c)中的第二阶段各自在10天、11天或12天内进行。在一些实施方式中，步骤(b)中的第一阶段和步骤(c)中的第二阶段各自在11天内进行。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(e)进行约10天至约22天。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(e)进行约10天至约20天。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(e)进行约10天至约15天。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(e)进行22天以下。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(e)和冷冻保存进行22天以下。在一些实施方式中，步骤(b)至步骤(e)在单个容器中进行；其中，与在超过一个的容器中进行步骤(b)至步骤(e)相比，在单个容器中进行步骤(b)至步骤(e)使得每个切除的肿瘤的til产量增加。在一些实施方式中，在步骤(c)的第二阶段期间，在不打开系统的情况下将抗原呈递细胞添加到til中。在一些实施方式中，步骤(d)中的第三til群是治疗性til群，相对于第二til群，该治疗性til群包含增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，获自治疗性til群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出选自下组的一种以上特征：cd27+表达、cd28+表达、端粒更长、cd57表达增加和cd56表达降低。在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，获自治疗性til群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出：cd57表达增加和cd56表达降低。在一些实施方式中，与开放系统相比，所述方法降低了微生物污染的风险。在一些实施方式中，将来自步骤(e)的til输注到患者体内。在一些实施方式中，封闭容器包括单个生物反应器。在一些实施方式中，封闭容器包括g-rex-10。在一些实施方式中，封闭容器包括g-rex-100。在一些实施方式中，在步骤(d)中，以apc：til为25：1至100：1的比率，将抗原呈递细胞(apc)加到第二til群的细胞培养基中。在一些实施方式中，细胞培养基具有2.5×109apc比100×106til的比率。在一些实施方式中，在步骤(c)中，以apc：til为25：1至100：1的比率，将抗原呈递细胞(apc)添加至第二til群的细胞培养基中。在一些实施方式中，细胞培养基具有2.5×109apc比100×106til的比率。本发明还提供一种用于治疗患有癌症的受试者的扩增的til群；其中，该扩增的til群是可通过包括以下步骤的方法获得的第三til群：(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，从患者切除的肿瘤中获得第一til群；(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；(c)通过在包含il-2的细胞培养基中培养第一til群来进行第一次扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)通过向第二til群的细胞培养基中补充另外的il-2、可选的okt-3和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；其中，第三til群是治疗性til群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)收获从步骤(d)获得的治疗性til群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(f)将从步骤(e)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(g)可选地，使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的til群的输液袋。在一些实施方式中，til群用于根据上文和此处所述的方法治疗患有癌症的受试者，其中，所述方法还包括上文和此处所述的一个以上特征。在一些实施方式中，til群用于根据上文和此处所述的方法治疗患有癌症的受试者，其中，所述方法还包括上文和此处所述的一个以上特征。本发明提供了将肿瘤浸润淋巴细胞(til)扩增为治疗性til群的方法，该方法包括：(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，从患者切除的肿瘤中获得第一til群；(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；(c)通过在包含il-2、可选的okt-3和可选的肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)激动剂的细胞培养基中培养第一til群来进行第一扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)通过向第二til群的细胞培养基中补充另外的il-2、可选的okt-3、可选的肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)激动剂和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；其中，第三til群是治疗性til群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)收获从步骤(d)获得的治疗性til群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(f)将从步骤(e)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生。本发明提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(til)，该方法包括：(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，从受试者切除的肿瘤中获得第一til群；(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；(c)通过在包含il-2、可选的okt-3和可选的肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)激动剂的细胞培养基中培养第一til群来进行第一扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；其中，所述第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)通过向第二til群的细胞培养基中补充另外的il-2、可选的okt-3、可选的肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)激动剂和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；其中，第三til群是治疗性til群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)收获从步骤(d)获得的治疗性til群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(f)将从步骤(e)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；(g)可选地，使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的til群的输液袋；以及(h)给患者施用治疗有效剂量的第三til群，该第三til群来自步骤(g)的输液袋。在一些实施方式中，肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)激动剂是4-1bb抗体。在一些实施方式中，tnfrsf激动剂是4-1bb激动剂，4-1bb激动剂选自：乌瑞鲁单抗(urelumab)、乌托鲁单抗(utomilumab)、eu-101、融合蛋白及其片段、衍生物、变体、生物类似物和组合。本发明还提供了冷冻保存组合物，该冷冻保存组合物包含如上文和此处所述的til群、包含二甲基亚砜(dmso)的冷冻保护剂(cryoprotectantmedium)和电解质溶液。在一些实施方式中，冷冻保存组合物还包含一种以上稳定剂和一种以上淋巴细胞生长因子。在一些实施方式中，一种以上稳定剂包括人血清白蛋白(hsa)，一种以上淋巴细胞生长因子包括il-2。在一些实施方式中，该组合物可选地包含okt-3。在一些实施方式中，dmso和电解质溶液以约1.1：1至约1：1.1的比率存在。在一些实施方式中，dmso和电解质溶液以约1：1的比率存在。在一些实施方式中，100ml的冷冻保存组合物包含约1×106至约9×1014的til群、约30ml至约70ml的包含dmso的冷冻保护剂、约30ml至约70ml的电解质溶液、约0.1g至约1.0g的hsa、约0.001mg至约0.005mg的il-2。在一些实施方式中，100ml的冷冻保存组合物包含约1×107至约1×1011的til群；约30ml至约70ml的冷冻保护剂，其中所述冷冻保护剂包含约10％的dmso；约30ml至约70ml的电解质溶液；约0.3g至约0.7g的hsa和约0.001mg至约0.003mg的il-2。在一些实施方式中，100ml的冷冻保存组合物基本上由以下组分组成：约1×107至约1×1011的til群；约30ml至约70ml的冷冻保护剂，其中所述冷冻保护剂基本上由约10％的dmso组成；约30ml至约70ml的电解质溶液；约0.3g至约0.7g的hsa以及约0.001mg至约0.003mg的il-2。在一些实施方式中，组合物用于治疗患有癌症的受试者。本发明还提供了冷冻保存组合物，该组合物包含til群、包含二甲基亚砜(dmso)的冷冻保护剂和电解质溶液；其中，100ml的组合物包含约1×107至约1×1011的til群；约30ml至约70ml的冷冻保护剂，其中所述冷冻保护剂包含约10％的dmso；约30ml至约70ml的电解质溶液；约0.3g至约0.7g的hsa和约0.001mg至约0.003mg的il-2。本发明还提供了基本上由til群、包含二甲基亚砜(dmso)的冷冻保护剂和电解质溶液组成的冷冻保存组合物，其中，100ml的组合物由以下组分组成：约1×107至约1×1011的til群；约30ml至约70ml的冷冻保护剂，其中所述冷冻保护剂基本上由约10％的dmso组成；约30ml至约70ml的电解质溶液；约0.3g至约0.7g的hsa和约0.001mg至约0.003mg的il-2。本发明还提供了输液袋，该输液袋包含如上文和此处所述的冷冻保存组合物。在一些实施方式中，输液袋是含有hypothermosol的输液袋。本发明还提供了储存袋，该储存袋包含如上文和此处所述的冷冻保存组合物。在一些实施方式中，根据权利要求54所述的储存袋，其中，所述储存袋是cryostorecs750冻存袋。附图说明图1：显示了过程2a(process2a)的一个实施方式的图，过程2a是一个22天的til生产过程。图2：显示了til生产的1c过程和2a过程的一个实施方式之间的比较。图3：显示了1c过程的时间线。图4：显示了使用更高细胞计数的过程2a进行til生产的til治疗的一个实施方式的过程，包括施用步骤和联合治疗步骤。图5：显示了使用更低细胞计数的过程2a进行til生产的til治疗的一个实施方式的过程，包括施用步骤和联合治疗步骤。图6：显示了2a过程的一个实施方式的详细示意图。图7：通过比较新鲜的til和解冻的til的干扰素-γ(ifn-γ)表达，显示了使用2a过程的一个实施方式制备的til的表征。图8：通过研究新鲜的til与解冻的til的cd3表达，显示了使用2a过程的一个实施方式制备的til的表征。图9：通过研究新鲜的til与解冻的til的回收率，显示了使用2a过程的一个实施方式制备的til的表征。图10：通过研究新鲜的til与解冻的til的活力，显示了使用2a过程的一个实施方式制备的til的表征。图11a-11c：描述了过程2a(包括冷冻保存步骤)的一个实施方式的主要步骤。图12：描述了从1c过程和2a过程的一个实施方式获得的细胞计数。图13：描述了从1c过程和2a过程的一个实施方式获得的细胞活力的百分比。图14：描述了通过流式细胞术测量的til(获自1c过程和2a过程的一个实施方式)的cd45和cd3细胞(即t细胞)的百分比。图15：描述了1c过程和2a过程的实施方式获得的ifn-γ释放，通过与用于产生图80和图98中数据的方法不同的方法进行测量。图16：描述了1c过程和2a过程的实施方式获得的ifn-γ释放，通过与用于产生图80和图98中数据的方法不同的方法进行测量。图17：描述了从1c过程和2a过程的一个实施方式获得的tcra/b和nk细胞的百分比。图18：描述了通过流式细胞术测量的til(通过1c过程和2a过程的一个实施方式获得)的cd8+和cd4+细胞的百分比，以及各个亚群的比率。图19：描述了通过流式细胞术测量的til(获自1c过程和2a过程的一个实施方式)的记忆亚群的百分比。图20：描述了通过流式细胞术测量的til(获自1c过程和2a过程的一个实施方式)的pd-1、lag-3和tim-3表达的百分比。图21：描述了通过流式细胞术测量的til(获自1c过程和2a过程的一个实施方式)的4-ibb、cd69和klrg1表达的百分比。图22：描述了通过流式细胞术测量的til(获自1c过程和2a过程的一个实施方式)的tigit表达百分比。图23：描述了通过流式细胞术测量的til(获自1c过程和2a过程的一个实施方式)的cd27和cd28表达百分比。图24：描述了流式fish端粒长度分析的结果。图25：描述了流式fish端粒长度分析的结果(在剔除异常数据点后)。图26：描述了包括经过程1c和过程2a的一个实施方式治疗的队列(cohort)的临床试验设计。图27：示例性过程2a的图，其提供了步骤a至f的概述。图28a-28c：过程2a的过程流程图。图29：过程2a数据收集计划的过程流程图。图30：新鲜的til与解冻的til的活力。图31：re-rep培养中新鲜til和解冻til的扩增。图32：血液代谢物的正常实验室值。图33a-33b：过程2apre-reptil的代谢物分析。图34：过程2apre-reptil细胞培养物的il-2定量。图35：在抗cd3、抗cd28和抗4-lbb刺激下，til的细胞毒性细胞因子ifn-γ的释放。图36：在til的抗cd3、抗cd28和抗4-1bb刺激后，til的颗粒酶b的释放。图37a-37b：tcrαβ+til。大多数人类的cd3+t细胞表达由α和β链形成的受体，这些受体以mhc限制性方式识别抗原。(a)除了在m1061中，新鲜和解冻的til产物具有80％以上的表达tcrαβ+的til。新鲜和解冻的til均具有相当的tcrαβ表达(p值-0.9582)。即使观察到在re-rep之后表达tcrβ+的til降低，在re-reptil中此种降低也不显著(p＝0.24)。(b)与新鲜til和解冻til相比，新鲜和解冻的表达tcrαβ的re-reptil分别降低了9.2％和15.7％。图38a-38b：tcrαβ-cd56+。肿瘤浸润自然杀伤(nk，naturalkiller)和nkt细胞还具有裂解缺乏mhc表达以及cd1呈递脂质抗原的细胞的能力和提供免疫调节细胞因子的能力。但是，大量(intense)的nk细胞浸润与晚期疾病有关，可能促进癌症的发展。图a显示，在所有情况下，除m1063外，与新鲜的til相比，解冻的til的nk群都有适度(尽管不显著)降低(p＝0.27)。在re-reptil群之间未观察到显著差异(p＝0.88)。如图b所示，新鲜的til、新鲜的re-reptil和解冻的re-reptil表现出相似的cd56表达。与新鲜的til(3.0±2.2)相比，解冻的til产物可能因冷冻程序而具有更少的(1.9±1.3)表达nk的细胞。图39a-39b：cd4+细胞。在单个情况下，未观察到cd4群的实质性差异。图a代表每种情况下的平均cd4群。图b中的表显示了sd和sem值。新鲜的re-rep群的cd4群略有降低，这主要是由于ep11001t中新鲜re-rep群的cd4的降低。图40a-40b：cd8+细胞。(a)总之，除ep11001t外，新鲜til和解冻til均显示了相当的cd8+群(p＝0.10，无显著差异)。在大多数实验中，新鲜的re-reptil产物中表达cd8+的til略有降低(m1061t和m1065t除外)。解冻的re-reptil中cd8+群降低了约10-30％。新鲜til和解冻til的re-reptil的比较呈现显著差异(p＝0.03，学生t检验)。图b显示了在所有情况下表达cd8+的til的平均值。新鲜til和解冻til均显示了相似的结果。但是，与新鲜的re-reptil相比，解冻的re-reptil产物中cd8+群降低了10.8％。图41a-41b：cd4+cd154+细胞。cd154，也称为cd40l，是活化的t细胞的标志物。图a：在不同情况下，未观察到cd4+cd154+群的实质性差异，但是，在ep11001t新鲜re-repcd4+til中观察到了34.1％的降低。未测量m1061t和m1062t的cd154表达，因为这些实验是在扩展表型面板(extendedphenotypepanel)就位之前进行的。图b：解冻til的情况略有降低可能归因于未在m1061t和m1062t中测量到的cd154。在所有情况下cd4群均显示出非常相似的cd154表达，表明cd4+t细胞被活化。图42a-42b：cd8+cd154+细胞。还分析了在cd8+til上表达的活化标志物cd154。(a)总的来说，新鲜til产物和解冻til产物中cd8+群的cd154表达较低。这并不意外，因为cd154主要在活化的cd4+t细胞中表达。在新鲜til产物和解冻til产物都检测cd154表达的情况下，在解冻的til产物中观察到无差异cd154表达或者cd154表达增加。学生t检验显示两种情况无显著差异。在所有实验中，与新鲜的re-rep相比，解冻的re-rep中cd154表达增加(p＝0.02)。(b)与它们的对应物相比，在解冻的til和解冻的re-reptil产物中都观察到cd154表达的增加。与新鲜的re-reptil相比，解冻的re-reptil显示出cd154表达增加29.1％。图43a-43b：cd4+cd69+细胞。cd69是刺激或者活化后t细胞的早期活化标志物。(a)在所有til中(除了ep11001t)，新鲜和解冻的re-rep均显示出cd69表达适度增加，这可能是由于re-rep的长度(7天而不是11天)。新鲜til和解冻til之间未观察到差异(p＝0.89)。也未观察到新鲜和解冻的re-rep之间的差异(p＝0.82)。(b)在re-reptil产物中观察到cd69表达的轻微增加。(注：m1061t和m1062t解冻的til产物均未进行cd69染色。m1061t新鲜til产物的cd69表达为33.9％。)图44a-44b：cd8+cd69+细胞。如对cd4+群所观察到的，图a显示了cd8+re-reptil中cd69表达的增加。cd69表达在新鲜til和解冻的til之间(p＝0.68)或者新鲜和解冻的re-reptil之间(p＝0.76)无显著差异。图b支持了所观察到的re-reptil产物的cd69表达的适度增加。图45a-45b：cd4+cd137+细胞。cd137(4-11313)是tcr活化后诱导的t细胞共刺激受体。它在cd4+和cd8+t细胞上被活化。(a)在刺激7天后，re-reptil群的cd137表达显示出显著增加。但是，未观察到新鲜til和解冻的til之间或者新鲜和解冻的re-reptil之间的差异(在两种情况下，p<0.05，图b支持了此观察)。而且，解冻的til显示出cd137表达的适度降低。re-reptil中cd137表达的增加可能归因于7天的re-rep的第二轮刺激。图46a-46b：cd8+cd137+细胞。(a)cd8+群显示出re-rep产物的总体增加。(b)与新鲜的til产物相比，新鲜的re-rep产物的cd8+cd137+表达增加33.4％。与解冻的til相比，解冻的re-rep产物也显示出cd8+群的cd137表达增加33.15％。新鲜和解冻的re-reptil之间未观察到显著差异。比较新鲜的til和解冻的til产物，可以看到类似的观察结果。cd137表达的增加可能归因于re-rep的第二轮活化。(注，3个实验未测量cd137的表达，因此仅使用6个til进行分析。)图47a-47b：cd4+cm细胞。中枢记忆(cm)群由cd45ra-(阴性)和ccr7+(阳性)表达来定义。(a)在re-rep情况下观察到cm群增加。m1063t和m1064t中，与新鲜的til产物相比，从解冻的til获得的cd4+群中cm表达降低。新鲜til产物与解冻til产物(p＝0.1658)以及新鲜的re-rep与解冻的re-reptil(p＝0.5535)均未显示cm群有显著差异。(b)与新鲜til和解冻til相比，新鲜和解冻的re-reptil的cm群分别增加了14.4％和15.4％。图48a-48b：cd8+cm细胞。(a)在cd8+群中，发现新鲜的til产物中cm表达急剧增加，til产物中未观察到存在此种情况。此种增加不会影响显著性(p＝0.3086)，表明新鲜til和解冻til之间没有差异。在re-reptil产物中也看到了类似的趋势。图48(b)与解冻的til相比，新鲜til的cm群总体增加。数字显示新鲜的til和re-reptil只有约2％的差异。新鲜的til显示出非常高的标准偏差，这可以归因于m1064t；排除m1064t中的cm表达使得新鲜til产物和解冻til产物之间的cm表达非常相似(未显示)。图49a-49b：cd4+em细胞。效应记忆(em)群由ccr7和cd45ra表达的缺乏来定义。(a)如预期，来自新鲜til和解冻til的cd4+群具有高水平的效应记忆表型。在m1056tre-reptil群中发现效应记忆表达急剧降低。另外，其他5个实验显示，新鲜和解冻的re-reptil的效应记忆表型均降低。(b)新鲜til和解冻til均显示了相似的效应记忆表型表达。新鲜的til和新鲜的re-reptil的比较显示后者降低了16％。与解冻的til相比，解冻的re-reptil也观察到类似的降低(9％)。图50a-50b：cd8+em细胞。(a)cd8+群中也发现了新鲜til的效应记忆增加的相似模式。m1064t中注意到一个例外：新鲜的til仅有20％的效应记忆特性；这是由于这些til的73％具有a和b中所述的cm表型。所有显示re-rep产物的cd4+til的效应记忆群降低的样品，其cd8+til遵循相同的趋势。(b)与cd4+til群不同，cd8+til在新鲜、解冻和re-rep产物中显示了相似的效应记忆表型。(注，新鲜til和解冻til的高的标准偏差，这是由于新鲜m1064t中低的效应记忆，以及m1061t解冻til样品中没有表达。)图51a-51b：cd4+cd28+细胞。cd28表达与年轻til随年龄增长而降低有关。(a)即使re-reptil中观察到cm群增加，但cd28表达降低被视为一种趋势，表明单独的cm状态不能决定til的命运。除m1061tcd4+til外，在re-rep产物中观察到cd28表达降低。(b)与新鲜til产物和解冻til产物相比，新鲜的til降低了8.89％，解冻的til降低了5.71％。图52a-52b：cd8+cd28+细胞。(a)在新鲜til和解冻til中，cd8+til群中的cd28表达高于re-rep产物。在大多数情况下，与解冻的til和新鲜的re-reptil相比，解冻的re-reptil显示出显著降低。但是，学生t检验显示新鲜til和解冻til之间(p＝0.3668)以及新鲜re-rep产物和解冻re-rep产物之间(p＝0.7940)均无显著差异。(b)如在cd4+til群中所见，与他们的未再刺激的对应物相比，新鲜re-rep(21.5％)和解冻re-rep(18.2％)的cd8+cd28+群有所降低。图53a-53b：cd4+pd-1+细胞。til中的pd-1表达与抗原活性和耗尽的t细胞相关。因此，在经历了11天rep的til中观察到耗尽的表型并不意外。(a)解冻的til产物中此种耗尽的表型维持或者增加(特别是ep11001t和m1056t)。新鲜til产物和解冻til产物之间无显著差异(p＝0.9809)。与解冻的re-reptil相比，新鲜的趋势相似(p＝0.0912)。(b)cd4+til群中新鲜的re-rep显示出pd-1表达的适度降低。所有其他情况都保持了相当的pd-1表达模式。与所有其他情况相比，在新鲜的re-rep产物中观察到pd-1表达降低或者没有变化。在解冻的re-rep产物中，m1062t、m1063t(cd4+)和ep11001t(cd8+)中pd-1表达增加。所有其他解冻的re-rep产物均显示出与解冻产物相当的结果。图54a-54b：cd8+pd-1+细胞。(a)来自新鲜til产物的cd8+群表现出与pd-1表达增加有关的更加耗尽的表型。在ep11001t中观察到一个例外：cd8+解冻的til产物与新鲜til产物相比，pd-1表达有所增加。与解冻的til相比，新鲜til中pd-1表达有小的差异(尽管不显著)(p＝0.3144)。(b)与解冻的til相比，新鲜的til产物显示出略微增加(尽管不显著)的pd-1表达(6.74％，或者比解冻til高1.2倍)，表明基于表型模式，解冻的til产物是相当的。图55a-55b：cd4+lag3+细胞。耗尽的t细胞表达高水平的抑制性受体lag3和pd-1。(a)与新鲜til相比，cd4+解冻的til显示出略高(但不显著)的lag3表达水平(p＝0.52)。在m1063t中观察到一个例外。在测量cd4+新鲜和新鲜re-reptil中lag3表达的实验中，与新鲜til相比，新鲜re-rep样品中lag3+表达降低。(b)总体而言，新鲜的re-reptil产物中的lag3表达适度降低。请注意，图b为了维持一致性，排除了m1061t、m1062t和m1064t，因为未检测新鲜产物中lag3表达。图56a-56b：cd8+lag3+细胞。(a)在实验中表达cd8+lag3+的til显示出适度的降低，而m1063t为例外：在新鲜re-reptil中观察到lag3表达的显著降低。总体而言，与新鲜的re-reptil相比，解冻的re-reptil显示出了1.5倍显著增加的lag3表达(p＝0.0154)。但是，新鲜的til和解冻的til产物之间未观察到显著差异(p＝0.0884)。(b)与解冻的til产物相比，观察到来自新鲜re-rep的cd8+til中lag3表达降低约30％。新鲜til和解冻til都与解冻til相当，显示出适度的增加。(在此图中，省略了m1061t、m1062t和m1064t，因为未检测新鲜或者新鲜re-reptil样品中的lag3表达。)图57a-57b：cd4+tim-3+细胞。(a)如先前在pd-1和lag3的情况中所观察到的，与解冻的re-reptil相比，在新鲜的rereptil中发现tim-3表达降低。无论如何，新鲜和解冻的rereptil之间都无显著差异(p＝0.2007)。(b)在新鲜、解冻和解冻的rereptil产物中未观察到tim-3表达的重大变化。与解冻的rerep产物相比，在新鲜的rereptil中观察到tim-3表达的9.2％的适度降低。图58a-58b：cd8+tim-3+细胞。(a)也在cd8+til中观察到了在cd4+群中观察到的tim-3表达的类似趋势。新鲜的re-reptil具有最少的tim-3表达低的耗尽表型，显示出了与解冻的re-reptil相比的显著差异(p＝0.0147)。pd-1、lag3和tim-3的比较表明，新鲜的re-reptil具有较少的cm表型增加的耗尽表型。(b)与解冻的re-reptil产物相比，新鲜的re-reptil显示出tim-3表达的22％的显著降低。新鲜til和解冻til均显示出相似的tim-3表达模式。图59：til对p815靶细胞系的细胞毒性潜力。图60a-60f：新鲜til、新鲜re-reptil和解冻的re-reptil的代谢呼吸谱(metabolicrespirationprofile)。(a)基础ocr、(b)显性src、(c)src2dg、(d)隐性src、(e)基础ecar和(f)糖酵解储备。图61a-61b：使用flow-fish技术检测post-rep2a过程的9个解冻til产物中端粒重复的平均长度。(a)数据表示通过qpcr测量的端粒长度，将til与1301细胞进行比较。(b)数据显示了通过流式荧光原位杂交方法(flowfishassay)检测的与1301细胞相比的til的端粒长度。附录第10节中以表格格式(表25)提供了图形所用数据。总体而言，两种端粒长度检测结果的模式存在大致的相似性，但实验将继续确定哪种方法能更准确地反映til的实际端粒长度。该技术可以应用于未来的临床样品，以确定端粒长度与患者对til治疗的反应之间的关系。图62a-62b：选择无血清培养基供应商(血清替代物)。每个碎片在g-rex24孔板的单孔中培养，一式四份。在第11天，使用45个til和106个饲养细胞(feeder)开始rep，模拟2a过程。(a)条形图显示了在第11天(pre-rep)记录的每种情况下的平均活细胞计数。(b)条形图显示了在第22天(postrep)记录的平均活细胞计数。使用学生“t”检验计算p值。分别*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。图63a-63b：选择无血清培养基供应商(血小板裂解液血清)。每个碎片在g-rex24孔板的单孔中培养，一式三份。在第11天，使用45个til和106个饲养细胞开始rep，模拟2a过程。(a)条形图显示了在第11天(pre-rep)记录的每种情况下的平均活细胞计数。(b)条形图显示了在第22天(postrep)记录的平均活细胞计数。使用学生“t”检验计算p值。分别*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。“#”肿瘤碎片不够。图64a-64b：使用小型2a过程(g-rex5m)，比较ctsoptimizer与标准条件的效力。2个碎片/g-rex5m进行培养，一式三份，使用26个til和506个饲养细胞开始rep，模拟2a过程。上文显示的条是在第11天(a)或者第22天(b)获得的平均活细胞计数。图65a-65c：比较标准条件和ctsoptimizer推算的pretil扩增和posttil扩增的概述。(a)prerep。(b)postrep。c)外推到工业规模(fullscale)运行的til扩增的概述(标准vsctsoptimizer+sr)。图66：在活细胞上门控cd8+。9种肿瘤中有7种在cts+sr情况下显示出了绝对cd8+群的增加。图67：干扰素-γ的可比性(comparability)。干扰素-γelisa(quantikine)。通过r&d系统使用quantikineelisa试剂盒检测ifn-γ的产生。当与我们的标准条件相比时，cts+sr产生了相当数量的ifn-γ。图68：快速扩增方案(rep)的一个示例性实施方式的方案。到达后，破碎肿瘤，将肿瘤碎片放入加有il-2的g-rex烧瓶中进行til扩增(pre-rep扩增)，持续11天。对于三重混合物(triplecocktail)研究，在pre-rep开始时添加il-2/il-15/il-21。对于快速扩增方案(rep)，将til与饲养细胞和okt3一起培养，rep扩增另外的11天。图69a-69b：在pre-rep后，使用流式细胞术对来自黑色素瘤(n＝4)和肺(n＝7)的til的cd4+和cd8+细胞进行表型评估。*p值表示使用学生未配对t检验的cd8+细胞中il-2和il-12/il-15/il-21之间的差异。图70a-70b：在pre-rep后，使用流式细胞术对来自黑色素瘤(n＝4)和肺(n＝7)的til的cd4+和cd8+细胞中的cd27+和cd28+进行表型评估。图71a-71c：对(a)黑色素瘤(n＝4)和(b)肺(n＝8)的til的cd8+细胞和cd4+(数据未显示)中的效应/记忆亚群(cd45ra和ccr7)进行表型评估。评估黑色素瘤和肺中cxcr3表达。在pre-rep后，使用流式细胞术评估所有表型表达。tcm＝中枢记忆，tscm＝干细胞记忆，temra(效应t细胞)，tem＝效应记忆。图72a-72c：通过流式细胞术评估了pma刺激4小时后，源自(a)黑色素瘤(n＝4)和(b)肺(n＝5)的til的cd4+和cd8+细胞中的cd107a+表达。(c)用可溶性okt3(30ng/ml)刺激pre-reptil(n＝5)24小时，通过elisa评估上清液的ifnγ。图73a-73b：使用用于流式细胞术的beckmancoulter试剂盒评估了源自(a)黑色素瘤和(b)肺的til中的tcrvβ谱系(repertoire)(24种特异性)。图74：冷冻保存的til的示例性生产过程(约22天)。图75a-75b：在第22天，将体积减少的细胞产物进行合并、取样，以在洗涤和配制之前测定培养物性能。如前所述，在nc-200自动细胞计数器上分析样品。总活细胞密度由来自4个独立样品的重复(duplicate)计数的总平均值确定。第2代(gen2)过程产生了与第1代相似剂量的til产物(gen1；gen1平均值＝4.10×1010±2.92×l010，gen2平均值＝3.12×l010±2.19×1010)。(b)计算rep阶段的倍数扩增，作为最终活细胞密度相对于初始活til接种密度的被除数(dividend)。相对于gen1，gen2til产物具有较低的倍数扩增(gen1平均值＝1.40×103±9.86×102，gen2平均值＝5.11×102±2.95×102)。图76：通过流式细胞术检测新鲜配制的药物产品的释放一致性(identity)。gen1和gen2过程产生高纯度的t细胞培养物，如cd45、cd3双阳性表型(genl#±sd，gen2#±sd)所定义。使用曼-惠特尼“t”检验计算p值。图77a-77b：将配制好的药物产品的冷冻保存的卫星小管(satellitevial)解冻，并如前所述通过流式细胞术分析扩增表型。gen1和gen2产物表达的cd8与cd4t细胞亚型比率相似。使用曼-惠特尼“t”检验计算p值。图78a-78b：将配制好的药物产品的冷冻保存的卫星小管解冻，并如前所述通过流式细胞术分析扩增表型。gen1和gen2产物在t细胞亚群上表达相似水平的共刺激分子cd27和cd28。使用曼-惠特尼“t”检验计算p值。需要共刺激分子，例如cd27和cd28，以在t细胞受体参与时提供效应细胞增殖所必需的次级和三级信号传导。图79：如前所述，使用flow-fish技术测量端粒重复序列的平均长度。上文的rtl值表明，gen1(过程1c的一个实施方式)中每个染色体/基因组的平均端粒荧光为#％±sd％，gen2为对照细胞系(1301白血病细胞系)基因/染色体中每个染色体/基因组的端粒荧光的#％±sd％。数据表明，gen2产物的平均端粒长度至少与gen1产物相当。端粒长度是离体细胞培养长度的替代量度。图80：相对于gen1药物产品，gen2(过程2a的一个实施方式)药物产品表现出增加的产生ifn-γ的能力。在hla的情况下，tcr结合同源抗原后，药物产品重新活化和分泌细胞因子的能力是体内功能的替代量度。图81a-81b：t细胞受体多样性：检测了来自gen1(过程1c的一个实施方式)和gen2(过程2a的一个实施方式)药物产品的10×106til的rna，以确定各个产物中存在的独特cdr3序列的总数和频率。(a)各个产物中存在的独特cdr3序列的总数(gen1n＝#，平均值±sd，gen2n＝#，平均值±sd)。(b)相对于各个产物中的频率对独特的cdr3序列进行指数变化，以产生代表产物中t细胞受体的相对多样性的得分。来自两个过程的til产物由具有不同抗原特异性和亲和力的t细胞的多克隆群组成。总t细胞谱系的宽度可以指示肿瘤细胞上起作用的表位(actionableepitope)的数量。图82：显示了过程2a的一个实施方式的图，一个用于til生产的22天的过程。图83：过程1c和过程2a的示例性实施方式的步骤a至f的比较表。图84：过程1c的一个实施方式和过程2a的一个实施方式的详细比较。图85：til治疗过程的实施方式的详细方案。图86a-86c：使用10色流式细胞术检测til产物的表型特征。(a)t细胞和非t细胞亚群的百分比分别由cd45+cd3+和cd45-(非淋巴细胞)/cd45+cd3-(非t细胞淋巴细胞)定义。总体而言，检测的til产物中>99％由t细胞(cd45+cd3+)组成。显示的是til产物的平均值(n＝10)。(b)两个t细胞亚群的百分比，包括cd45+cd3+cd8+(蓝色空心圆)和cd45+cd3+cd4+(粉红色空心圆)。使用学生未配对t检验未观察到两个亚群百分比的统计学差异(p＝0.68)。(c)表征了4个不同亚群的非t细胞群，包括：1)非淋巴细胞(cd45-)、2)nk细胞(cd45+cd3-cd16+/56+)、3)b细胞(cd45+cd19+)和4)非nk/b细胞(cd45+cd3-cd16-cd56-cd19-)。图87a-87b：cd45+cd3+cd4+和cd45+cd3+cd8+细胞群中t细胞亚群的表征。使用cd45ra和ccr7定义了幼稚、中枢记忆(tcm)、效应记忆(tef)和效应记忆ra+(emra)t细胞亚群。图显示了来自10种最终til产物的代表性t细胞亚群(a)cd4+和(b)cd8+细胞群。在til终产物的cd4+和cd8+亚群中，效应记忆t细胞亚群(蓝色空心圆圈)是主要群(>93％)。少于7％的til产物细胞是中枢记忆亚群(粉红色空心圆圈)。在til产物中几乎未检测到emra(灰色空心圆圈)和幼稚(黑色空心圆圈)亚群(<0.02％)。p值表示使用学生未配对t检验的em和cm之间的差异。图88a-88b：检测黑色素瘤肿瘤细胞中mcsp和epcam的表达。黑色素瘤肿瘤细胞系(wm35、526和888)、患者来源的黑色素瘤细胞系(1028、1032和1041)和结直肠腺瘤癌细胞系(ht29作为阴性对照)通过mcsp(黑色素瘤相关的硫酸软骨素蛋白聚糖)和epcam(上皮细胞粘附分子)标志物的染色来表征。(a)平均90％的黑色素瘤肿瘤细胞表达mcsp。(b)与阳性对照ht29(epcam+肿瘤细胞系)相比，黑色素瘤肿瘤细胞系中未检测到epcam表达。图89a-89b：检测加标(spiked)对照，以确定肿瘤的检测准确性。通过将已知量的肿瘤细胞加入pbmc悬液中(n＝10)进行检测。将mcsp+526黑色素瘤肿瘤细胞以1：10、1：100和1：1000的比率稀释，然后与pbmc混合，用抗mcsp和抗cd45抗体以及活/死染料染色，通过流式细胞术进行分析。(a)分别以1∶10、1∶100和1∶1000的稀释度检测了约3000、300和30个细胞。(b)每种条件下采集的细胞的平均值(av)和标准偏差(sd)用于定义参考上下限。图90a-90b：加标对照中上下限的重复性研究。一式三份地进行三个独立实验，以确定加标实验的重复性。(a)检测到mcsp+的肿瘤细胞的数量始终在参考上限和下限范围内。(b)线性回归图表明mcsp+细胞与加标稀释度(r2＝0.99)之间的相关性，黑色实线显示了最佳拟合。绿色和灰色虚线分别代表标准曲线和样品(exp#1至3)的95％预测极限。图91a-91b：检测til产物中残留的黑色素瘤肿瘤。使用开发的检测方法评估til产物的残留肿瘤污染(n＝15)。(a和b)可检测到的mcsp+事件的中位数和百分比分别为2和0.0002％。图92：t细胞活化后til产物的效价强度(potency)评估。通过elisa评估用抗cd3/cd28/cd137再刺激的til产物的ifnγ分泌(n＝5)，重复两次。使用wilcoxon符号秩检验(wilcoxonsignedranktest)，til产物的ifnγ分泌显著大于未刺激对照(p＝0.02)，并且始终>1000pg/ml。ifnγ分泌>200pg/ml被认为是有效的，p值<0.05被认为具有统计学意义。图93：冷冻保存的til生产过程(22天)的一个实施方式的描述。图94：从gen1到gen2的过程改进的表格。图95a-95c：活细胞总数、生长速率(growthrate)和活力。在第22天，将体积减少的细胞产物合并并取样以在洗涤和配制之前测定培养物性能。(a)如前所述，在nc-200自动细胞计数器上分析样品。总活细胞密度由4个独立样品的重复计数的总平均值确定。gen2过程产生与gen1相似剂量的til产物(gen1平均＝4.10×1010±2.8×1010，gen2平均＝4.12×1010±2.5×1010)。(b)rep阶段的生长速率为gr＝ln(n(t)/n(0))/t。(c)如前所述，使用cellometerk2评估9个工艺开发批次的细胞活力。在配制的产物进行单个冷冻-解冻循环后，未观察到细胞活力的显著降低。解冻和取样后的活力的平均降低为2.19％。图96a-96c：gen2产物是高纯度t细胞培养物，其表达的共刺激分子水平与gen1相当。(a)通过流式细胞术检测用于释放的新鲜配制的药物产品的一致性。gen1和gen2过程产生高纯度t细胞培养物，如cd45+、cd3+(双阳性)表型所定义的。(b和c)将配制的药物产品的冷冻保存的卫星小管解冻，并如前所述通过流式细胞术分析扩增的表型。gen1和gen2产物在t细胞亚群上表达相似水平的共刺激分子cd27和cd28。需要共刺激分子，例如cd27和cd28，以在t细胞受体参与时提供效应细胞增殖所必需的次级和三级信号传导。使用曼-惠特尼“t”检验计算p-值。图97：gen2产物显示出相似的端粒长度。但是，某些til群可能趋向于具有更长的相对端粒。图98：响应于cd3、cd28和cd137参与，gen2药物分泌ifnγ。图99a-99b：t细胞受体多样性。(a)相对于各个产物中的频率对独特的cdr3序列进行指数变化，以得出代表产物中t细胞受体总体多样性的得分。(b)各个输注产物中存在的独特cdr3序列的平均总数。图100：本发明的til生产过程的实施方式。图101：在pre-rep期间，多种肿瘤组织学类型中使用il-2/il-15/il-21的扩增增强。图102a-102b：在肺癌中il-2/il-15/il-21增加了cd8+细胞的百分比，但在黑色素瘤中却没有。在pre-rep后，使用流式细胞术对来自(a)黑色素瘤(n＝4)和(b)肺(n＝7)的til的cd4+和cd8+细胞进行表型评估。图103a-103b：在用il-2/il-15/il-21处理的培养物中，cd8+细胞中cd27的表达略有增强。在pre-rep之后，使用流式细胞术对来自(a)黑色素瘤(n＝4)和(b)肺(n＝7)的til的cd4+和cd8+细胞中的cd27+和cd28+进行表型评估。图104a-104b：添加il-15/il-21不会改变t细胞亚群。pre-rep后，使用流式细胞术对来自(a)黑色素瘤(n＝4)和(b)肺(n＝8)的til的cd8+和cd4+(数据未显示)细胞中的效应/记忆亚群(cd45ra和ccr7)进行表型评估。图105a-105c：用il-2/il-15/il-21差异性地增强了til的功能能力。通过流式细胞术，对来自(a)黑色素瘤(n＝4)和(b)肺(n＝5)的til在响应pma刺激4小时后的cd4+和cd8+细胞中的cd107a+表达进行了评估。(c)用可溶性抗cd3抗体刺激来自黑色素瘤和肺的pre-reptil24小时，通过elisa评估上清液的ifnγ。图106a-106b：使用用于流式细胞术的beckmancoulter试剂盒评估了来自(a)黑色素瘤和(b)肺肿瘤的til中的tcrvβ谱系(24种特异性)。图107：gen2冷冻保存的ln-144生产过程的方案。图108：给转移性黑色素瘤患者施用新型冷冻保存的til的多中心ii期临床试验的研究设计方案。图109：表格显示了来自队列1(asco2017)与队列2的比较患者特征(comparisonpatientcharacteristic)。图110：表格显示了治疗突发不良事件(treatmentemergentadverseevent)(≥30％)。图111：输注产物和til治疗的疗效。图112：sd或者反应较好的反应可评估患者的临床状态。图113：直径总和的百分比变化。图114：经til治疗后，观察到hmgb1水平升高。图115：输注ln-144后，观察到生物标志物il-10增加。图116：来自第二次数据截止(datacut)(n＝17名患者)的转移性黑色素瘤中ii期临床试验的队列2的更新的患者特征。图117：来自第二次数据截止(n＝17名患者)的队列2的治疗突发不良事件(≥30％)。图118：来自第二次数据截止的队列2中可评估患者(病情稳定或者好转)的反应时间(n＝17名患者)。在该疗效组的10位患者中，一位患者(10号患者)无法评估，因其在第一次肿瘤评估前死于黑色素瘤(图中未显示)。图119：来自第二次数据截止的队列2的更新的疗效数据(n＝17名患者)。输注的til的平均数为34×109。先前治疗的中位数为4.5。braf突变患者和野生型braf患者均有反应(a*指braf突变患者)。一名患者(10号患者)因其在第一次肿瘤评估前死于黑色素瘤而无法评估，但仍被认为在有效组。缩写：pr(partialresponse)，部分缓解；sd(stabledisease)，病情稳定；pd(progressivedisease)，进行性疾病。图120：来自第二次数据截止的队列2的可评估患者的更新的疗效数据(n＝17名患者)。*表示无法评估的患者(未进行第一次评估)。所有可评估疗效的患者均接受过先前的抗pd-1和抗ctla-4检查点抑制剂治疗。图121：来自第二次数据截止队列2的pr患者(003-015)的代表性计算机断层扫描。图122：输注前til产物诱导ifn-γ与til输注后第42天临床肿瘤尺寸减小的相关性。图123：gen2til产物的一个实施方式的输注前和输注后的ip-10(cxcl10)水平(pg/ml，log10)。ip-10是细胞粘附(adhesion)和归巢(cellhoming)的标志物。图124：gen1til产物的一个实施方式的输注前和输注后的ip-10(cxcl10)水平(pg/ml，log10)。图125：gen2til产物的一个实施方式的输注前和输注后的mcp-1水平(pg/ml，log10)。mcp-1是细胞粘附和归巢的标志。图126：gen1til产物的一个实施方式的输注前和输注后的mcp-1水平(pg/ml，log10)。图127：宫颈癌和头颈部鳞状细胞癌(hnscc)的ii期研究数据。sd＝病情稳定。pr＝进行性疾病。pr＝部分缓解。图128：显示了过程2a的实施方式的图，该过程2a为生产til的22天过程。图129：显示了将til悬液转运包无菌连接(参见实施例30中的过程注释5.11)到重力血液过滤器的底部的示意图(单线)。图130：将红色的培养基取出管线从grex100mcs无菌连接(参见实施例30中的过程注释5.11)到“上清液”转运包的示意图。图131：显示了将4s-4m60连接(参见实施例30中的过程注释5.11)到cc2cellconnect的示意图，在(g)处用4s-4m60歧管(manifold)的4尖嘴(spike)端替换cellconnect设备(b)的单个尖嘴。图132：显示了将中继流体转运装置(repeaterfluidtransferset)连接(参见实施例30中的过程注释5.11)到4s-4m60的公鲁尔接头之一的示意图。图133：显示了将重力血液过滤器的长末端无菌连接(参见实施例30中的过程注释5.11)到lovo源袋(lovosourcebag)的示意图。图134：显示了将过滤器的两条源管线之一无菌连接(参见实施例30中的过程注释5.11)到“合并的til悬液”收集袋的示意图。图135：显示了将4s-4m60无菌连接(参见实施例30中的过程注释5.11)到cc2cellconnect的示意图，在(g)处用4s-4m60歧管的4尖嘴端替换cellconnect设备(b)的单个尖嘴。图136：显示了将cs750冻存袋(cryobag)无菌连接(参见实施例30中的过程注释5.11)到步骤8.14.8中制备的线束(harness)的示意图，用每个袋替换4个公鲁尔接头(e)之一。图137：显示了将cs-10袋连接(参见实施例30中的过程注释5.11)到4s-4m60的尖嘴的示意图。图138：显示了将“配制的til”袋连接(参见实施例30中的过程注释5.11)到步骤8.14.10中准备的装置的剩余尖嘴(a)的示意图。图139：显示了在f处热封(参见实施例30中的过程注释5.12)的示意图，移去了空的滞留物(retentate)袋和cs-10袋。图140：显示了结构i-a和i-b，圆柱表示单个多肽结合结构域。结构i-a和结构i-b包含三个线性连接的tnfrsf结合结构域，该结合结构域源自例如4-1bbl或与4-1bb结合的抗体，这些结构域折叠形成三价蛋白，然后通过igg1-fc(包括ch3和ch2结构域)与第二个三价蛋白连接，然后通过二硫键(小的细长椭圆)将两个三价蛋白连接在一起，从而稳定结构，提供能将六个受体的细胞内信号传导结构域和信号传导蛋白结合在一起形成信号复合体的激动剂。图141：提供了概述实验的三个阶段(如实施例21所述)的图。序列表seqidno：1是莫罗单抗(muromonab)的重链的氨基酸序列。seqidno：2是莫罗单抗的轻链的氨基酸序列。seqidno：3是重组人il-2蛋白的氨基酸序列。seqidno：4是阿地白介素(aldesleukin)的氨基酸序列。seqidno：5是重组人il-4蛋白的氨基酸序列。seqidno：6是重组人il-7蛋白的氨基酸序列。seqidno：7是重组人il-15蛋白的氨基酸序列。seqidno：8是重组人il-21蛋白的氨基酸序列。seqidno：9是人4-1bb的氨基酸序列。seqidno：10是鼠4-1bb的氨基酸序列。seqidno：11是4-1bb激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(pf-05082566)的重链。seqidno：12是4-1bb激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(pf-05082566)的轻链。seqidno：13是4-1bb激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(pf-05082566)的重链可变区(vh)。seqidno：14是4-1bb激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(pf-05082566)的轻链可变区(vl)。seqidno：15是4-1bb激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(pf-05082566)的重链cdr1。seqidno：16是4-1bb激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(pf-05082566)的重链cdr2。seqidno：17是4-1bb激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(pf-05082566)的重链cdr3。seqidno：18是4-1bb激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(pf-05082566)的轻链cdr1。seqidno：19是4-1bb激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(pf-05082566)的轻链cdr2。seqidno：20是4-1bb激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(pf-05082566)的轻链cdr3。seqidno：21是4-1bb激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(bms-663513)的重链。seqidno：22是4-1bb激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(bms-663513)的轻链。seqidno：23是4-1bb激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(bms-663513)的重链可变区(vh)。seqidno：24是4-1bb激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(bms-663513)的轻链可变区(vl)。seqidno：25是4-1bb激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(bms-663513)的重链cdr1。seqidno：26是4-1bb激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(bms-663513)的重链cdr2。seqidno：27是4-1bb激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(bms-663513)的重链cdr3。seqidno：28是4-1bb激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(bms-663513)的轻链cdr1。seqidno：29是4-1bb激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(bms-663513)的轻链cdr2。seqidno：30是4-1bb激动剂单克隆抗体乌瑞鲁单抗(bms-663513)的轻链cdr3。seqidno：46是4-1bb配体(4-1bbl)的氨基酸序列。seqidno：47是4-1bbl多肽的可溶性部分。seqidno：48是4-1bb激动剂抗体4b4-1-1版本1的重链可变区(vh)。seqidno：49是4-1bb激动剂抗体4b4-1-1版本1的轻链可变区(vl)。seqidno：50是4-1bb激动剂抗体4b4-1-1版本2的重链可变区(vh)。seqidno：51是4-1bb激动剂抗体4b4-1-1版本2的轻链可变区(vl)。seqidno：52是4-1bb激动剂抗体h39e3-2的重链可变区(vh)。seqidno：53是4-1bb激动剂抗体h39e3-2的轻链可变区(vl)。具体实施方式一、介绍利用通过快速扩增方案(rep)离体培养的til的过继性细胞治疗已经在患有黑色素瘤的患者中的宿主免疫抑制后产生了成功的过继性细胞治疗。目前的输注接受参数依赖于til组成的读数(例如cd28、cd8或者cd4阳性)以及rep产物扩增的数值倍数和活力。目前的rep方案很少考虑将被输注到患者体内的til的健康状况。t细胞在从幼稚t细胞到效应t细胞的成熟过程中经历了深刻的代谢转变(参见chang等,nat.immunol.2016,17,364，在此明确地整体并入，特别是对于厌氧和有氧代谢的讨论和标志物)。例如幼稚t细胞依靠线粒体呼吸产生atp，而成熟、健康的效应t细胞如til是高度糖酵解的，依靠有氧糖酵解提供它们增殖、迁移、活化和抗肿瘤疗效所需的生物能量学底物。先前论文报道，在转移前限制til中的糖酵解和促进til中的线粒体代谢是期望的，因为严重依赖糖酵解的细胞在过继性转移时会遭受营养缺乏，这会导致大部分转移的细胞死亡。因此，本领域教导，促进线粒体代谢可能会促进体内寿命，并且事实上建议在诱导免疫应答之前使用糖酵解抑制剂。参见chang等(chang等,nat.immunol.2016,17(364),574-582)。在一些实施方式中，本发明还涉及评价和量化代谢健康的此种增加的方法。因此，本发明提供了使用代谢的一种以上常规评价来检测til群的相对健康的方法，常规评价包括但不限于糖酵解、氧化磷酸化、备用呼吸能力(src)和糖酵解储备的速率和量。此外，在一些实施方式中，本发明还涉及评价和量化代谢健康的此种增加的方法。因此，本发明提供了使用代谢的一种以上常规评价来检测til群的相对健康的方法，常规评价包括但不限于糖酵解、氧化磷酸化、备用呼吸能力(src)和糖酵解储备的速率和量。此外，可选的其他评价包括但不限于atp产生、线粒体质量和葡萄糖摄取。二、定义除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。本文提及的所有专利和出版物均通过引用整体并入本文。术语“体内”指发生在受试者体内的事件。术语“体外”指在受试者体外发生的事件。体外检测包括使用活细胞或死细胞的基于细胞的检测，并且还可以包括不使用完整细胞的无细胞检测。术语“离体”指涉及对已从受试者体内移除的细胞、组织和/或器官进行治疗或进行手术的事件。适当地，该细胞、组织和/或器官可通过手术或治疗方法返回到受试者的身体。术语“快速扩增”指在一周的时间内抗原特异性til的数量增加至少约3倍(或者4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或者9倍)，更优选在一周的时间内增加至少约10倍(或者20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍或者90倍)，或者最优选在一周的时间内增加至少约100倍。下文概述了许多快速扩增方案。本文中的“肿瘤浸润淋巴细胞”或者“til”指最初作为白细胞获得的细胞群，它们已经离开受试者的血流并迁移至肿瘤。til包括但不限于cd8+细胞毒性t细胞(淋巴细胞)、th1和th17cd4+t细胞、天然杀伤细胞、树突状细胞和m1巨噬细胞。til包括原代til和次代til。“原代til”是如本文所述从患者组织样品中获得的那些(有时称为“新鲜收获的”)，“次代til”是如本文所讨论的已经扩增或者增殖的任何til细胞群，包括但不限于大量til(bulktil)和扩增的til(“reptil”或者“post-reptil”)。til细胞群可以包括经基因修饰(geneticallymodified)的til。本文的“细胞群”(包括til)指许多具有共同特征的细胞。通常，群的数量通常为1×106至1×1010，不同的til群包含不同的数量。例如，在il-2存在下，原代til的初始增长产生约1×108个细胞的大量til群。通常，进行rep扩增以提供1.5×109至1.5×1010个细胞的群用于输注。本文的“冷冻保存的til”指在约-150℃至-60℃范围内进行处理和储存的原代til、大量til或扩增的til(reptil)。用于冷冻保存的一般方法也在本文其他地方描述，包括在实施例中。为清楚起见，“冷冻保存的til”能够与可用作原代til来源的冷冻组织样品区分开。本文的“解冻的冷冻保存的til”指先前被冷冻保存然后被处理以恢复至室温以上温度(包括但不限于细胞培养温度或可以将til施用于患者的温度)的til群。til通常可以利用细胞表面标志物在生物化学上定义，或者通过其浸润肿瘤和影响治疗的能力在功能上来定义。til通常可通过表达以下生物标志物中的一种以上来分类：cd4、cd8、tcrαβ、cd27、cd28、cd56、ccr7、cd45ra、cd95、pd-1和cd25。另外，或者，til可通过在重新引入患者后其浸润实体瘤的能力在功能上定义。术语“冷冻保存培养基(cryopreservationmedia)”或者“冷冻保存培养基(cryopreservationmedium)”指可用于细胞的冷冻保存的任何培养基。此类培养基可以包括包含7％至10％dmso的培养基。示例性的培养基包括cryostorcs10、hyperthermasol以及它们的组合。术语“cs10”指从stemcelltechnologies或者biolifesolutions商购的冷冻保存培养基。cs10培养基可以用商品名“cs10”来指代。cs10培养基是包含dmso的无血清无动物成分的培养基。术语“中枢记忆t细胞”指人细胞中cd45r0+并且组成性地表达ccr7(ccr7高)和cd62l(cd62高)的t细胞亚群。中枢记忆t细胞的表面表型还包括tcr、cd3、cd127(il-7r)和il-15r。中枢记忆t细胞的转录因子包括bcl-6、bcl-6b、mbd2和bmi1。在tcr触发后，中枢记忆t细胞主要分泌il-2和cd40l作为效应分子。中枢记忆t细胞在血液中的cd4区室(compartment)中占优势，并且在人体中按比率富集在淋巴结和扁桃体。术语“效应记忆t细胞”指人或哺乳动物t细胞的亚群，其与中枢记忆t细胞一样，为cd45r0+，但丧失ccr7的组成型表达(ccr7低)，并且异质性或cd62l的表达低(cd62l低)。中枢记忆t细胞的表面表型还包括tcr、cd3、cd127(il-7r)和il-15r。中枢记忆t细胞的转录因子包括blimp1。效应记忆t细胞在抗原刺激后迅速分泌高水平的炎性细胞因子，包括干扰素-γ、il-4和il-5。效应记忆t细胞在血液的cd8区室中占优势，并且在人体中在肺、肝和肠中按比率富集。cd8+效应记忆t细胞携带大量的穿孔素。术语“封闭系统”指的是对外部环境封闭的系统。适用于细胞培养方法的任何封闭系统均可用于本发明的方法。封闭系统包括例如但不限于封闭的g容器。一旦将肿瘤碎片加入封闭系统中，系统就不会向外部环境开放，直至til准备好施用于患者。本文用于描述破坏肿瘤的方法的术语“碎片化”(fragmenting)、“碎片化”(fragment)和“经碎片化”(fragmented)包括机械破碎方法，例如破碎、切片、分割和粉碎肿瘤组织，以及任何其他破坏肿瘤组织的物理结构的方法。术语“外周血单核细胞”和“pbmc”指具有圆形细胞核的外周血细胞，包括淋巴细胞(t细胞、b细胞、nk细胞)和单核细胞。优选地，外周血单核细胞是辐照的同种异体外周血单核细胞。pbmc是一种抗原呈递细胞。术语“抗cd3抗体”指抗体或者它的变体(例如单克隆抗体)，包括：针对成熟t细胞的t细胞抗原受体中cd3受体的人、人源化、嵌合或者鼠抗体。抗cd3抗体包括okt-3，也称为莫罗单抗。抗cd3抗体还包括uhct1克隆，也称为t3和cd3ε。其他抗cd3抗体包括例如奥特昔珠单抗(otelixizumab)、特普利珠单抗(teplizumab)和威司利珠单抗(visilizumab)。术语“okt-3”(在本文中也称为“okt3”)指单克隆抗体或者其生物类似物或者变体，包括针对成熟t细胞的t细胞抗原受体中cd3受体的人、人源化、嵌合或者鼠抗体，还包括市售形式，如okt-3(30ng/ml，纯macsgmpcd3，miltenyibiotech，inc.，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)和莫罗单抗或者其变体、保守性氨基酸取代、糖型(glycoform)或者生物类似物。莫罗单抗的重链和轻链的氨基酸序列在表1中给出(seqidno：1和seqidno：2)。能够产生okt-3的杂交瘤保藏在美国典型培养物保藏中心(atcc，americantypeculturecollection)，并且其分配的atcc登录号为crl8001。能够产生okt-3的杂交瘤也保藏在欧洲认证细胞培养物保藏中心(ecacc，europeancollectionofauthenticatedcellcultures)中，并且其分配的目录号为86022706。表1：莫罗单抗的氨基酸序列术语“il-2”(在本文中也称为“il2”)指称为白细胞介素-2的t细胞生长因子，包括所有形式的il-2，包括其人和哺乳动物形式、保守氨基酸取代、糖型、生物类似物及变体。il-2描述于例如nelson,j.immunol.2004,172,3983-88和malek,annu.rev.immunol.2008,26,453-79，其公开内容在此引入作为参考。适用于本发明的重组人il-2的氨基酸序列在表2中给出(seqidno：3)。例如，术语il-2包括人类重组形式的il-2，例如，阿地白介素(proleukin，可从多个供应商商购，每个单独使用的小管2200万iu)，以及可从美国新罕布什尔州朴茨茅斯的cellgenix,inc.(cellgrogmp)或美国新泽西州东布朗士维克的prospec-tanytechnogeneltd.(目录号cyt-209-b)商购的重组形式的il-2和其他供应商的其他商业等价物。阿地白介素(des-alanyl-1，丝氨酸-125人il-2)是il-2的非糖基化人重组形式，分子量约为15kda。适用于本发明的阿地白介素的氨基酸序列在表2中给出(seqidno：4)。术语il-2还包括如本文所述的聚乙二醇化形式的il-2，包括聚乙二醇化的il2前药nktr-214，可从美国加利福尼亚州南旧金山的nektartherapeutics公司商购。适用于本发明的nktr-214和聚乙二醇化il-2描述于美国专利申请公开号us2014/0328791a1和国际专利申请公开号wo2012/065086a1中，其公开内容在此引入作为参考。适用于本发明的缀合的il-2的替代形式描述于美国专利4,766,106、5,206,344、5,089,261和4,902,502中，其公开内容在此引入作为参考。适用于本发明的il-2制剂描述于美国专利号6,706,289中，其公开内容在此引入作为参考。表2：白细胞介素的氨基酸序列术语“il-4”(在本文中也称为“il4”)指称为白细胞介素4的细胞因子，其由th2t细胞和嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞产生。il-4调节幼稚辅助性t细胞(th0细胞)向th2t细胞的分化。steinke和borish,respir.res.2001,2,66-70。在被il-4活化后，th2t细胞随后在正反馈环中产生另外的il-4。il-4还刺激b细胞增殖和ii类mhc表达，并诱导b细胞转换为ige和igg1表达。适用于本发明的重组人il-4可从多个供应商商购，包括美国新泽西州东布朗士维克的prospec-tanytechnogeneltd.(目录号cyt-211)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的thermofisherscientific，inc.(人il-15重组蛋白，目录号gibcoctp0043)。适用于本发明的重组人il-4的氨基酸序列在表2中给出(seqidno：5)。术语“il-7”(在本文中也称为“il7”)指称为白细胞介素7的糖基化组织衍生细胞因子，其可以从基质细胞和上皮细胞以及树突状细胞中获得。fry和mackall,blood2002,99,3892-904。il-7可以刺激t细胞的生长。il-7与il-7受体结合，il-7受体是由il-7受体α和共用γ链受体(commongammachainreceptor)组成的异二聚体，其在一系列信号中对t细胞的胸腺内发育和外周存活具有重要作用。适用于本发明的重组人il-4可从多个供应商商购，包括美国新泽西州东布朗士维克的prospec-tanytechnogeneltd.(目录号cyt-254)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的thermofisherscientific，inc.(人il-15重组蛋白，目录号gibcophc0071)。适用于本发明的重组人il-7的氨基酸序列在表2中给出(seqidno：6)。术语“il-15”(在本文中也称为“il15”)指称为白细胞介素-15的t细胞生长因子，并且包括所有形式的il-2，包括其人和哺乳动物形式、保守氨基酸取代、糖型、生物类似物及变体。il-15描述于例如fehniger和caligiuri,blood2001,97,14-32中，其公开内容在此引入作为参考。il-15与il-2共享β和γ信号传导受体亚单位。重组人il-15是非糖基化多肽单链，含有114个氨基酸(和n-末端甲硫氨酸)，分子量为12.8kda。重组人il-15可从多个供应商商购，包括美国新泽西州东布朗士维克的prospec-tanytechnogeneltd.(目录号cyt-230-b)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的thermofisherscientific,inc.(人il-15重组蛋白，目录号34-8159-82)。适用于本发明的重组人il-15的氨基酸序列在表2中给出(seqidno：7)。术语“il-21”(在本文中也称为“il21”)指称为白细胞介素-21的多效细胞因子蛋白，并且包括所有形式的il-21，包括其人和哺乳动物形式、保守氨基酸取代、糖型、生物类似物及变体。il-21描述于例如spolski和leonard,nat.rev.drug.disc.2014,13,379-95，其公开内容在此引入作为参考。il-21主要由自然杀伤t细胞和活化的人cd4+t细胞产生。重组人il-21是非糖基化多肽单链，含有132个氨基酸，分子量为15.4kda。重组人il-21可从多个供应商商购，包括美国新泽西州东布朗士维克的prospec-tanytechnogeneltd.(目录号cyt-408-b)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的thermofisherscientific,inc.(人il-21重组蛋白，目录号14-8219-80)。适用于本发明的重组人il-21的氨基酸序列在表2中给出(seqidno：8)。当指示“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医生确定，考虑年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度以及患者(受试者)状况的个体差异。通常可以说，包含本文所述的经基因修饰的细胞毒性淋巴细胞的药物组合物可以104至1011个细胞/kg体重(例如105至106、105至1010、105至1011、106至1010、106至1011、107至1011、107至1010、108至1011、108至1010、109至1011或109至1010个细胞/kg体重)的剂量施用，包括这些范围内的所有整数值。经基因修饰的细胞毒性淋巴细胞组合物也可以这些剂量多次给药。经基因修饰的细胞毒性淋巴细胞可通过使用免疫治疗中通常已知的输注技术来施用(参见例如rosenbergetal.,“新的”eng.j.ofmed.319：1676,1988)。通过监测患者的疾病迹象并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。术语“血液恶性肿瘤(hematologicalmalignancy)”指造血和淋巴组织(包括但不限于血液、骨髓、淋巴结和淋巴系统的组织)的哺乳动物癌症和肿瘤。血液恶性肿瘤也称为“液体肿瘤”。血液恶性肿瘤包括但不限于急性淋巴细胞白血病(all)、慢性淋巴细胞淋巴瘤(cll)、小淋巴细胞淋巴瘤(sll)、急性髓样白血病(aml)、慢性粒细胞白血病(cml)、急性单核细胞白血病(amol)、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。术语“b细胞血液恶性肿瘤”指影响b细胞的血液恶性肿瘤。术语“实体瘤”指通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。术语“实体瘤癌症”指恶性、肿瘤性或癌性实体瘤。实体瘤癌症包括但不限于肉瘤、恶性上皮肿瘤和淋巴瘤，例如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌和膀胱癌。实体瘤的组织结构包括相互依赖的组织隔室，包括实质(癌细胞)和支持的基质细胞(癌细胞分散在其中并且可以提供支持的微环境)。术语“液体肿瘤”指本质上是流体的异常细胞团。液体肿瘤癌症包括但不限于白血病、骨髓瘤和淋巴瘤，以及其他血液恶性肿瘤。从液体肿瘤获得的til在本文中也可称为骨髓浸润淋巴细胞(mil)。如本文所用，术语“微环境”可以指整个的实体瘤或血液肿瘤微环境，或指微环境内的单个细胞亚群。如本文所用，肿瘤微环境指“细胞、可溶性因子、信号分子、细胞外基质，以及促进肿瘤转化、支持肿瘤生长和侵袭、保护肿瘤免受宿主免疫、促进治疗抵抗力并为显性转移灶的繁殖提供利基的机制线索”的复杂混合物，如swartz等，cancerres.，2012，72，2473中所述。尽管肿瘤表达应该被t细胞识别到的抗原，但由于微环境的免疫抑制，免疫系统很少清除肿瘤。在一个实施方式中，本发明包括用til群治疗癌症的方法，其中，在输注本发明的til之前用非清髓性化疗预处理患者。在一些实施方式中，可以提供til群；其中，在输注本发明的til之前，用非清髓性化疗对患者进行预处理。在一个实施方式中，非清髓性化疗是环磷酰胺60mg/kg/天、持续2天(til输注前第27和第26天)和氟达拉滨25mg/m2/天、持续5天(rtil输注前第27至第23天)。在一个实施方式中，在根据本发明的非清髓性化疗和til输注(在第0天)后，患者以720,000iu/kg每8小时接受一次il-2的静脉输注，直至生理耐受。实验发现表明，过继性转移肿瘤特异性t淋巴细胞之前的淋巴细胞耗竭(lymphodepletion)通过消除调节性t细胞和免疫系统的竞争成分(“细胞因子沉降”)而在增强治疗疗效中起关键作用。因此，本发明的一些实施方式在引入本发明的rtil之前对患者使用淋巴耗竭步骤(有时也称为“免疫抑制调节”)。如本文所用，术语“共同施用”、“共同给药”、“与...组合施用”、“与...组合给药”、“同时”和“共同”包括向受试者施用两种以上活性药物成分(在本发明的一个优选实施方式中，例如至少一种钾通道激动剂与多个til组合)，使得活性药物成分和/或它们的代谢物同时存在于受试者体内。共同施用包括：同时施用不同的组合物、在不同时间施用不同的组合物，或者施用其中存在两种以上活性药物成分的组合物。优选同时施用不同的组合物和施用其中存在两种药剂的组合物。术语“有效量”或者“治疗有效量”指如本文所述的化合物或者化合物组合的量足够实现预期应用，包括但不限于疾病治疗。治疗有效量可根据预期应用(体外或者体内)或者所治疗的受试者和疾病状况(例如受试者的体重、年龄和性别)、疾病状况的严重程度或者施用方式而变化。该术语还适用于会在靶细胞中诱导特定应答(例如血小板粘附和/或细胞迁移的减少)的剂量。具体剂量将取决于所选择的具体化合物、要遵循的施用方案、化合物是否与其他化合物联合施用、施用时间、施用组织以及携带化合物的物理递送系统。术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”等指获得所需的药理学和/或生理学作用。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该作用可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的不良反应而言，该作用可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”包括哺乳动物，特别是人类中疾病的任何治疗，包括：(a)在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中防止疾病发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展或进展；以及(c)缓解疾病，即引起疾病消退和/或缓解一种以上疾病症状。“治疗”还意味着包括递送药剂以提供药理学作用，即使在没有疾病或病症的情况下也是如此。例如，“治疗”包括递送可在没有疾病的情况下引发免疫应答或赋予免疫力的组合物，例如在疫苗的情况下。当涉及核酸或者蛋白质部分的使用时，术语“异源”表示核酸或者蛋白质包含两个以上在自然界中彼此不存在相同关系的子序列。例如核酸通常是重组产生的，具有来自无关基因的两个以上序列，它被排列以产生新的功能性核酸，例如来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区，或者来自不同来源的编码区。类似地，异源蛋白质表示该蛋白质包含两个以上在自然界中彼此不存在相同关系的子序列(例如融合蛋白)。在两个以上核酸或多肽的情况下，术语“序列同一性”，“百分比同一性”和“序列百分比同一性”(或其同义词，例如“99％相同”)指，当比较和比对(视需要的话，引入缺口)以获得最大对应性时，两个以上序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，不考虑任何保守氨基酸取代作为序列同一性的一部分。可以使用序列比较软件或算法或通过目视检查，来测量同一性百分比。本领域已知各种算法和软件可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对。测定序列同一性百分比的合适程序包括，例如可从美国政府的国家生物技术信息中心blast网站获得的blast程序套件。可以使用blastn或blastp算法进行两个序列之间的比较。blastn用于比较核酸序列，而blastp用于比较氨基酸序列。align、align-2(加利福尼亚州南旧金山的genentech)或可从dnastar获得的megalign是可用于比对序列的其他公共可用软件程序。本领域技术人员可通过特定的比对软件确定用于最大比对的适当参数。在某些实施例中，使用比对软件的默认参数。如本文所用，术语“变体”包括但不限于如下的抗体或融合蛋白：其通过在参考抗体的氨基酸序列内或附近的某些位置处的一个以上取代、缺失和/或添加而包含与参考抗体的氨基酸序列不同的氨基酸序列。与参考抗体的氨基酸序列相比，变体在其氨基酸序列中可包含一个以上保守取代。保守取代可涉及例如取代相似带电荷或不带电荷的氨基酸。该变体保留了特异性结合参考抗体的抗原的能力。术语“变体”还包括聚乙二醇化抗体或蛋白质。本文中的“肿瘤浸润淋巴细胞”或者“til”指最初作为白细胞获得的细胞群，它们已经离开受试者的血流并迁移至肿瘤。til包括但不限于cd8+细胞毒性t细胞(淋巴细胞)、th1和th17cd4+t细胞、天然杀伤细胞、树突状细胞和m1巨噬细胞。til包括原代til和次代til。“原代til”是如本文所述从患者组织样品中获得的那些(有时称为“新鲜收获的”)，“次代til”是如本文所讨论的已经扩增或者增殖的任何til细胞群，包括但不限于大量til、扩增的til(“reptil”)以及“rereptil”。例如，rereptil可以包括第二次扩增til或者第二次另外的扩增til(例如，图27的步骤d中所描述的那些，包括称为rereptil的til)。til通常可以利用细胞表面标志物在生物化学上定义，或者通过其浸润肿瘤和影响治疗的能力在功能上来定义。til通常可通过表达以下生物标志物中的一种以上来分类：cd4、cd8、tcrαβ、cd27、cd28、cd56、ccr7、cd45ra、cd95、pd-1和cd25。另外，或者，til可通过在重新引入患者后其浸润实体瘤的能力在功能上定义。til还可通过效价强度来表征——例如，如果例如干扰素(ifn)的释放大于约50pg/ml、大于约100pg/ml、大于约150pg/ml或大于约200pg/ml，则til可被认为是有效的。术语“药学上可接受的载体”或者“药学上可接受的赋形剂”旨在包括任何和所有的溶剂、分散培养基、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂，以及惰性成分。此种药学上可接受的载体或者药学上可接受的赋形剂对活性药物成分的用途是本领域熟知的。除非任何常规的药学上可接受的载体或者药学上可接受的赋形剂与活性药物成分不相容，否则可预期其在本发明的治疗组合物中的应用。其他活性药物成分(例如其他药物)也可以掺入所述组合物和方法中。术语“约”和“大约”表示在统计上有意义的数值范围内。这样的范围可以在给定值或者范围的一个数量级内，优选在50％内，更优选在20％内，更优选在10％内，甚至更优选在5％内。术语“约”或者“大约”所包含的可允许变化取决于所研究的特定系统，并且本领域普通技术人员可以容易地理解。此外，如本文所用，术语“约”和“大约”表示大小、尺寸、配方、参数、形状和其他性质和特性不是、也不必是精确的，但可以视需要是近似的和/或更大的或者更小的，反映公差、转换因子、四舍五入、测量误差等，以及本领域技术人员已知的其他因素。通常，大小、尺寸、配方、参数、形状或者其他性质或者特性是“约”或者“近似”的，无论是否明确说明如此。应注意，具有非常不同的尺寸、形状和大小的实施方式可采用所述安排。当在所附权利要求中以原始和修改的形式使用时，转变术语“包含”、“基本上由...组成”和“由...组成”定义了关于被排除在权利要求的范围之外的未列举的另外的权利要求要素或者步骤(如果有的话)的权利要求范围。术语“包含”旨在是包含性的或者开放式的，并且不排除任何另外的、未列举的要素、方法、步骤或者材料。术语“由......组成”不包括除权利要求中所述那些之外的任何元素、步骤或者材料，并且在材料的情况下，术语“由...组成”不包括与指定材料相关的普通杂质。术语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制为指定的元素、步骤或者材料以及不会实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的那些。在替代实施方式中，本文所述的体现本发明的所有组合物、方法和试剂盒可以更具体地由任意转变术语“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”定义。4-1bb(cd137)激动剂在一个实施方式中，tnfrsf激动剂是4-1bb(cd137)激动剂。4-1bb激动剂可以是本领域已知的任何4-1bb结合分子。4-1bb结合分子可以是能够结合人或哺乳动物4-1bb的单克隆抗体或融合蛋白。4-1bb激动剂或4-1bb结合分子可包含免疫球蛋白分子的任何同种型(例如igg、ige、igm、igd、iga和igy)、类(例如igg1、igg2、igg3、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类。4-1bb激动剂或4-1bb结合分子可能同时具有重链和轻链。如本文所用，术语“结合分子”还包括抗体(包括全长抗体)、单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体以及抗体片段(例如fab片段、f(ab’)片段、由fab表达文库产生的片段、上述任一项的表位结合片段以及工程化形式的与4-1bb结合的抗体(例如scfv分子))。在一个实施方式中，4-1bb激动剂是抗原结合蛋白，其是完全人抗体。在一个实施方式中，4-1bb激动剂是抗原结合蛋白，其是人源化抗体。在一些实施方式中，用于本文公开方法和组合物的4-1bb激动剂包括：抗4-1bb抗体、人抗4-1bb抗体、小鼠抗4-1bb抗体、哺乳动物抗4-1bb抗体、单克隆抗4-1bb抗体、多克隆抗4-1bb抗体、嵌合抗4-1bb抗体、抗4-1bbadnectin、抗4-1bb结构域抗体、单链抗4-1bb片段、重链抗-4-1bb片段、轻链抗4-1bb片段、抗4-1bb融合蛋白以及它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。已知激动性抗4-1bb抗体诱导强烈的免疫应答。lee等，plosone2013,8,e69677。在一个优选实施方式中，4-1bb激动剂是激动性抗4-1bb人源化单克隆抗体或激动性抗4-1bb完全人单克隆抗体(即源自单个细胞系的抗体)。在一个实施方式中，4-1bb激动剂是eu-101(eutilexco.ltd.)、乌托鲁单抗或乌瑞鲁单抗或它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。在一个优选实施方式中，4-1bb激动剂是乌托鲁单抗或乌瑞鲁单抗或它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。在一个优选实施方式中，4-1bb激动剂或4-1bb结合分子也可以是融合蛋白。在一个优选实施方式中，与激动性单克隆抗体(通常具有两个配体结合域)相比，多聚体4-1bb激动剂，例如三聚体或六聚体4-1bb激动剂(具有三个或六个配体结合结构域)，可以诱导更高的受体(4-1bbl)聚集和内部细胞信号复合物的形成。例如，gieffers等，mol.cancertherapeutics2013,12,2735-47描述了三聚体(三价)或六聚体(或六价)或更高聚体融合蛋白，其包含三个tnfrsf结合结构域和igg1-fc并可选地进一步连接两个以上这些融合蛋白。已知激动性4-1bb抗体和融合蛋白诱导强烈的免疫应答。在一个优选实施方式中，4-1bb激动剂是以足以减少毒性的方式特异性结合4-1bb抗原的单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，4-1bb激动剂是消除抗体依赖性细胞毒性(adcc)(例如nk细胞的细胞毒性)的激动性4-1bb单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，4-1bb激动剂是消除抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)的激动性4-1bb单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，4-1bb激动剂是消除补体依赖性细胞毒性(cdc)的激动性4-1bb单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，4-1bb激动剂是消除fc区功能性的激动性4-1bb单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方式中，4-1bb激动剂的特征在于以高亲和力和激动剂活性结合人4-1bb(seqidno：9)。在一个实施方式中，4-1bb激动剂是与人4-1bb(seqidno：9)结合的结合分子。在一个实施方式中，4-1bb激动剂是与鼠4-1bb(seqidno：10)结合的结合分子。表3-1总结了与4-1bb激动剂或结合分子结合的4-1bb抗原的氨基酸序列。表3：4-1bb抗原的氨基酸序列在一些实施方式中，所述的组合物、过程和方法包括4-1bb激动剂，所述4-1bb激动剂以约100pm以下的kd结合人4-1bb或鼠4-1bb、以约90pm以下的kd结合人4-1bb或鼠4-1bb、以约80pm以下的kd结合人4-1bb或鼠4-1bb、以约70pm以下的kd结合人4-1bb或鼠4-1bb、以约60pm以下的kd结合人4-1bb或鼠4-1bb、以约50pm以下的kd结合人4-1bb或鼠4-1bb、以约40pm以下的kd结合人4-1bb或鼠4-1bb或以约30pm以下的kd结合人4-1bb或鼠4-1bb。在一些实施方式中，所述的组合物、过程和方法包括4-1bb激动剂，所述4-1bb激动剂以约7.5×1051/m·s以上的kassoc结合人或鼠类4-1bb、8×1051/m·s以上的kassoc结合人或鼠类4-1bb、8.5×1051/m·s以上的kassoc结合人或鼠类4-1bb、9×1051/m·s以上的kassoc结合人或鼠类4-1bb、9.5×1051/m·s以上的kassoc结合人或鼠类4-1bb、或1×1061/m·s以上的kassoc结合人或鼠类4-1bb、。在一些实施方式中，所述的组合物、过程和方法包括4-1bb激动剂，所述4-1bb激动剂以约2×10-51/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1bb、以约2.1×10-51/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1bb、以约2.2×10-51/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1bb、以约2.3×10-51/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1bb、以约2.4×10-51/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1bb、以约2.5×10-51/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1bb、以约2.6×10-51/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1bb、以约2.7×10-51/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1bb、以约2.8×10-51/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1bb、以约2.9×10-51/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1bb或以约3×10-51/s以下的kdissoc结合人或鼠类4-1bb。在一些实施方式中，所述的组合物、过程和方法包括4-1bb激动剂，所述4-1bb激动剂以约10nm以下的ic50结合人4-1bb或鼠4-1bb、以约9nm以下的ic50结合人4-1bb或鼠4-1bb、以约8nm以下的ic50结合人4-1bb或鼠4-1bb、以约7nm以下的ic50结合人4-1bb或鼠4-1bb、以约6nm以下的ic50结合人4-1bb或鼠4-1bb、以约5nm以下的ic50结合人4-1bb或鼠4-1bb、以约4nm以下的ic50结合人4-1bb或鼠4-1bb、以约3nm以下的ic50结合人4-1bb或鼠4-1bb、以约2nm以下的ic50结合人4-1bb或鼠4-1bb或以约1nm以下的ic50结合人4-1bb或鼠4-1bb。在一个优选实施方式中，4-1bb激动剂是乌托鲁单抗(也称为pf-05082566或mor-7480)或其片段、衍生物、变体或生物类似物。乌托鲁单抗可从pfizer，inc.商购。乌托鲁单抗是一种免疫球蛋白g2-λ，抗[智人tnfrsf9(肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族成员9，4-1bb，t细胞抗原ila，cd137)]，智人(完全人)单克隆抗体。乌托鲁单抗的氨基酸序列在表4中列出。乌托鲁单抗在asn59和asn292处包含糖基化位点；在第22-96(vh-vl)、143-199(ch1-cl)、256-316(ch2)和362-420(ch3)位包含重链链内二硫键；在第22'-87'(vh-vl)和136'-195'(ch1-cl)位包含轻链链内二硫键；在igg2a/b同工型第218-130、219-219、222-222和225-225位、在igg2a同工型第218-218、219-219、222-222和225-225位以及在igg2b同工型第219-130(2)、222-222和225-225位包含链间重链-重链二硫键；以及在igg2a同工型第130-213'(2)位、在igg2a/b同工型第218-213'和130-213'位以及在igg2b同工型第218-213'(2)位包含链间重链-轻链二硫键。乌托鲁单抗及其变体和片段的制备和性质描述于美国专利号8,821,867；8,337,850和9,468,678以及国际专利申请公开号wo2012/032433a1，其各自公开内容通过引用并入本文。乌托鲁单抗的临床前特征描述于fisher等，cancerimmunolog.&immunother.2012,61,1721-33。目前，乌托鲁单抗在各种血液学和实体瘤适应症中的临床试验包括美国国立卫生研究院(u.s.nationalinstitutesofhealth)clinicaltrials.gov识别号nct02444793、nct01307267、nct02315066和nct02554812。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含seqidno：11给出的重链和seqidno：12给出的轻链。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别具有seqidno：11和seqidno：12所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、fab片段、单链可变片段(scfv)、变体或缀合物。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别与seqidno：11和seqidno：12所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别与seqidno：11和seqidno：12所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别与seqidno：11和seqidno：12所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别与seqidno：11和seqidno：12所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别与seqidno：11和seqidno：12所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含乌托鲁单抗的重链和轻链的cdr或可变区(vr)。在一个实施方式中，4-1bb激动剂重链可变区(vh)包含seqidno：13所示的序列，4-1bb激动剂轻链可变区(vl)包含seqidno：14所示的序列，及它们的保守氨基酸取代。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别与seqidno：13和seqidno：14所示序列具有至少99％同一性的vh区和vl区。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别与seqidno：13和seqidno：14所示序列具有至少98％同一性的vh区和vl区。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别与seqidno：13和seqidno：14所示序列具有至少97％同一性的vh区和vl区。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别与seqidno：13和seqidno：14所示序列具有至少96％同一性的vh区和vl区。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别与seqidno：13和seqidno：14所示序列具有至少95％同一性的vh区和vl区。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含scfv抗体，该scfv抗体包含分别与seqidno：13和seqidno：14所示序列具有至少99％同一性的vh区和vl区。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别具有seqidno：15、seqidno：16和seqidno：17所示序列及其保守氨基酸取代的重链cdr1结构域、重链cdr2结构域和重链cdr3结构域，以及分别具有seqidno：18，seqidno：19和seqidno：20所示序列及其保守氨基酸取代的轻链cdr1结构域、轻链cdr2结构域和轻链cdr3结构域。在一个实施方式中，4-1bb激动剂是药品监管机构参考乌托鲁单抗批准的4-1bb激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方式中，生物类似物单克隆抗体包含4-1bb抗体，该抗体4-1bb抗体包含与参考药物产品或参考生物制品的氨基酸序列具有至少97％(例如97％、98％、99％或100％)序列同一性并且与参考药物产品或参考生物制品相比包含一种以上翻译后修饰的氨基酸序列，其中，参考药物产品或参考生物制品是乌托鲁单抗。在一些实施方式中，一种以上翻译后修饰选自糖基化、氧化、脱酰胺和截短中的一种以上。在一些实施方式中，生物类似物是已授权或已提交授权的4-1bb激动剂抗体，其中，4-1bb激动剂抗体以不同于参考药物产品或参考生物制品制剂的制剂形式提供，其中，参考药物产品或参考生物制品是乌托鲁单抗。4-1bb激动剂抗体可能会被药品监管机构(例如美国fda和/或欧盟ema)授权。在一些实施方式中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物制品中所包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物制品是乌托鲁单抗。在一些实施方式中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物制品中所包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物制品是乌托鲁单抗。表4：与乌托鲁单抗有关的4-1bb激动剂抗体的氨基酸序列在一个优选实施方式中，4-1bb激动剂是单克隆抗体乌瑞鲁单抗(也称为bms-663513和20h4.9.h4a)或其片段、衍生物、变体或生物类似物。乌瑞鲁单抗可购自bristol-myerssquibb，inc.和creativebiolabs，inc.。乌瑞鲁单抗是一种免疫球蛋白g4-κ，抗[智人tnfrsf9(肿瘤坏死因子受体超家族成员9，4-1bb，t细胞抗原ila，cd137)]，智人(全人)单克隆抗体。表5列出了乌瑞鲁单抗的氨基酸序列。乌瑞鲁单抗在第298位(和第298’位)包含n-糖基化位点；在第22-95(vh-vl)、148-204(ch1-cl)、262-322(ch2)和368-426(ch3)位(以及在第22”-95”、148”-204”、262”-322”和368”-426”位)包含重链链内二硫键；在第23'-88'(vh-vl)和136'-196'(ch1-cl)位(以及在第23”'-88”'和136”'-196”'位)包含轻链链内二硫桥；在第227-227'和230-230”位包含链间重链-重链二硫键；以及在第135-216'和135'-216”位包含链间重链-轻链二硫键。乌瑞鲁单抗及其变体和片段的制备和性质描述于美国专利号7,288,638和8,962,804，其公开内容通过引用并入本文。segal等,clin.cancerres.2016(可访问http://dx.doi.org/10.1158/1078-0432.ccr-16-1272)描述了乌瑞鲁单抗的临床前和临床特征。乌瑞鲁单抗在各种血液学和实体瘤适应症中的当前临床试验包括美国国立卫生研究院clinicaltrials.gov识别号nct01775631、nct02110082、nct02253992和nct01471210。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含由seqidno：21给出的重链和由seqidno：22给出的轻链。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包括重链和轻链，所述重链和轻链分别具有seqidno：21和seqidno：22所示序列或其抗原结合片段、fab片段、单链可变片段(scfv)、变体或缀合物。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别与seqidno：21和seqidno：22所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别与seqidno：21和seqidno：22所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别与seqidno：21和seqidno：22所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别与seqidno：21和seqidno：22所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别与seqidno：21和seqidno：22所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含乌瑞鲁单抗的重链和轻链的cdr或可变区(vr)。在一个实施方式中，4-1bb激动剂重链可变区(vh)包含seqidno：23所示的序列，4-1bb激动剂轻链可变区(vl)包含seqidno：24所示的序列，及它们的保守氨基酸取代。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别与seqidno：23和seqidno：24所示序列具有至少99％同一性的vh区和vl区。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别与seqidno：23和seqidno：24所示序列具有至少98％同一性的vh区和vl区。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别与seqidno：23和seqidno：24所示序列具有至少97％同一性的vh区和vl区。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别与seqidno：23和seqidno：24所示序列具有至少96％同一性的vh区和vl区。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别与seqidno：23和seqidno：24所示序列具有至少95％同一性的vh区和vl区。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含scfv抗体，该scfv抗体包含分别与seqidno：23和seqidno：24所示序列具有至少99％同一性的vh区和vl区。在一个实施方式中，4-1bb激动剂包含分别具有seqidno：25，seqidno：26和seqidno：27所示序列及其保守氨基酸取代的重链cdr1结构域、重链cdr2结构域和重链cdr3结构域，以及分别具有seqidno：28，seqidno：29和seqidno：30所示序列及其保守氨基酸取代的轻链cdr1结构域、轻链cdr2结构域和轻链cdr3结构域。在一个实施方式中，4-1bb激动剂是由药品监管机构参考乌瑞鲁单抗批准的4-1bb激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方式中，生物类似物单克隆抗体包含4-1bb抗体，该抗体4-1bb抗体包含与参考药物产品或参考生物制品的氨基酸序列具有至少97％(例如97％、98％、99％或100％)序列同一性并且与参考药物产品或参考生物制品相比包含一种以上翻译后修饰的氨基酸序列，其中，参考药物产品或参考生物制品是乌瑞鲁单抗。在一些实施方式中，一种以上翻译后修饰选自糖基化、氧化、脱酰胺和截短中的一种以上。在一些实施方式中，生物类似物是已授权或已提交授权的4-1bb激动剂抗体，其中，4-1bb激动剂抗体以不同于参考药物产品或参考生物制品制剂的制剂形式提供，其中，参考药物产品或参考生物制品为乌瑞鲁单抗。4-1bb激动剂抗体可能会被药品监管机构(例如美国fda和/或欧盟ema)授权。在一些实施方式中，在一些实施方式中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物制品中所包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物制品是乌瑞鲁单抗。在一些实施方式中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中，一种以上赋形剂与参考药物产品或参考生物制品中所包含的赋形剂相同或不同，其中，参考药物产品或参考生物制品是乌瑞鲁单抗。表5：与乌瑞鲁单抗有关的4-1bb激动剂抗体的氨基酸序列在一个实施方式中，4-1bb激动剂选自：1d8、3elor、4b4(biolegend309809)、h4-1bb-m127(bdpharmingen552532)、bbk2(thermofisherms621pabx)、145501(leincotechnologiesb591)、由保藏于atcc号hb-11248且公开于美国专利号6974863的细胞系产生的抗体、5f4(biolegend311503)、c65-485(bdpharmingen559446)、公开于美国专利申请公开号us2005/0095244的抗体、美国专利号7,288,638(例如20h4.9-igg1(bms-663031))中公开的抗体、美国专利6,887,673(例如4e9或bms-554271)中公开的抗体、美国专利号7,214,493中公开的抗体、美国专利号6,303,121中公开的抗体、美国专利号6,569,997中公开的抗体、美国专利号6,905,685中公开的抗体(例如4e9或bms-554271)、美国专利号6,362,325(例如1d8或bms-469492；3h3或bms-469497；或3e1)中公开的抗体、美国专利号6,974,863中公开的抗体(例如53a2)、美国专利号6,210,669中公开的抗体(例如1d8、3b8或3e1)、美国专利号5,928,893中描述的抗体、美国专利号6,303,121中公开的抗体、美国专利号6,569,997中公开的抗体、国际专利中公开的抗体专利申请公开号wo2012/177788、wo2015/119923和wo2010/042433中公开的抗体，及它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物，其中，每个前述专利或专利申请出版物的公开内容均通过引用并入本文。在一个实施方式中，4-1bb激动剂是国际专利申请公开号wo2008/025516a1，wo2009/007120a1、wo2010/003766a1、wo2010/010051a1和wo2010/078966a1；美国专利申请公开号us2011/0027218a1、us2015/0126709a1、us2011/0111494a1、us2015/0110734a1和us2015/0126710a1；以及美国专利号9,359,420、9,340,599、8,921,519和8,450,460中描述的4-1bb激动融合蛋白，其公开内容通过引用并入本文。在一个实施方式中，4-1bb激动剂是如结构i-a(c端fc抗体片段融合蛋白)或结构i-b(n端fc抗体片段融合蛋白)所描述的4-1bb激动融合蛋白或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物：在结构i-a和i-b中，圆柱指单个多肽结合结构域(参见图140)。例如，结构i-a和结构i-b包含三个线性连接的tnfrsf结合结构域，该结合结构域源自例如4-1bbl或与4-1bb结合的抗体，它们折叠形成三价蛋白，然后通过igg1-fc(包括ch3和ch2结构域)与第二个三价蛋白连接，然后通过二硫键(小的细长椭圆)将两个三价蛋白连接在一起，从而稳定结构，提供能够将六个受体的细胞内信号传导结构域和信号传导蛋白结合在一起形成信号复合体的激动剂。例如，表示为圆柱的tnfrsf结合结构域可以是scfv结构域，scfv结构域包含例如通过接头连接的vh链和vl链，该接头可包含亲水性残基和gly和ser序列以具有柔韧性，以及包含glu和lys序列以具有溶解性。可以使用任何scfv结构域设计，例如描述于demarco,microbialcellfactories,2011,10,44；ahmad等，clin.&dev.immunol.2012,980250；monnier等，antibodies,2013,2,193-208；或并入本文其他地方的参考文献中的那些。此种形式的融合蛋白结构描述于美国专利号9,359,420、9,340,599、8,921,519和8,450,460，其公开内容通过引用并入本文。结构i-a的其他多肽结构域的氨基酸序列在表6中给出。fc结构域优选包含完整的恒定结构域(seqidno：31的氨基酸17-230)和完整的铰链结构域(seqidno：31的氨基酸1-16)或铰链结构域的一部分(例如seqidno：31的氨基酸4-16)。连接c端fc抗体的优选的接头可以选自seqidno：32至seqidno：41给出的实施方式，包括适用于融合其他多肽的接头。表6：具有c端fc-抗体片段融合蛋白设计(结构i-a)的tnfrsf融合蛋白(包括4-1bb融合蛋白)的氨基酸序列结构i-b的其他多肽结构域的氨基酸序列在表7中给出。如果fc抗体片段融合至tnrfsf融合蛋白的n-末端(如结构i-b)，则fc模块的序列优选为sedidno：42所示的序列，接头序列优选选自sedidno：43至seqidno：45所示的那些实施方式。表7：具有n末端fc-抗体片段融合蛋白设计(结构i-b)的tnfrsf融合蛋白(包括4-1bb融合蛋白)的氨基酸序列在一个实施方式中，根据结构i-a或结构i-b的4-1bb激动剂融合蛋白包含一个以上4-1bb结合结构域，该4-1bb结合结构域选自：乌托鲁单抗的可变重链和可变轻链、乌瑞鲁单抗的可变重链和可变轻链、乌托鲁单抗的可变重链和可变轻链、选自表8中所述可变重链和可变轻链的可变重链和可变轻链，前述可变重链和可变轻链的任意组合，及它们的片段、衍生物、缀合物、变体和生物类似物。在一个实施方式中，根据结构i-a或结构i-b的4-1bb激动剂融合蛋白包含一个以上包含4-1bbl序列的4-1bb结合结构域。在一个实施方式中，根据结构i-a或结构i-b的4-1bb激动剂融合蛋白包含一个以上4-1bb结合结构域，该4-1bb结合结构域包含seqidno：46的序列。在一个实施方式中，根据结构i-a或结构i-b的4-1bb激动剂融合蛋白包含一个以上4-1bb结合结构域，该4-1bb结合结构域包含可溶性4-1bbl序列。在一个实施方式中，根据结构i-a或结构i-b的4-1bb激动剂融合蛋白包含一个以上4-1bb结合结构域，该4-1bb结合结构域包含seqidno：47的序列。在一个实施方式中，根据结构i-a或结构i-b的4-1bb激动剂融合蛋白包含一个以上4-1bb结合结构域，该4-1bb结合结构域是scfv结构域，该scfv结构域包含分别与seqidno：13和seqidno：14所示序列具有至少95％同一性的vh区和vl区，其中，vh结构域和vl结构域通过接头连接。在一个实施方式中，根据结构i-a或结构i-b的4-1bb激动剂融合蛋白包含一个以上4-1bb结合结构域，该4-1bb结合结构域是scfv结构域，该scfv结构域包含分别与idno：23和seqidno：24所示序列具有至少95％同一性的vh区和vl区，其中，vh结构域和vl结构域通过接头连接。在一个实施方式中，根据结构i-a或结构i-b的4-1bb激动剂融合蛋白包含一个以上4-1bb结合结构域，该4-1bb结合结构域是scfv结构域，该scfv结构域包含分别与表8所示序列具有至少95％同一性的vh区和vl区，其中，vh结构域和vl结构域通过接头连接。表8：用作融合蛋白中4-1bb结合结构域或用作scfv4-1bb激动剂抗体的其他多肽结构域在一个实施方式中，4-1bb激动剂是4-1bb激动性单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1bb结合域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性4-1bb结合结构域、(iv)第二肽接头和(v)第三可溶性4-1bb结合结构域，还包含位于n端和/或c端的其他结构域，其中，该其他结构域是fab或fc片段结构域。在一个实施方式中，4-1bb激动剂是4-1bb激动性单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性4-1bb结合域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性4-1bb结合结构域、(iv)第二肽接头和(v)第三可溶性4-1bb结合结构域，还包含位于n端和/或c端的其他结构域，其中，其他结构域是fab或fc片段结构域，其中，每个可溶性4-1bb结构域均缺少茎(stalk)区(有助于三聚化作用并提供与细胞膜的一定距离，但不是4-1bb结合结构域的一部分)，第一肽接头和第二肽接头独立地具有3至8个氨基酸的长度。在一个实施方式中，4-1bb激动剂是4-1bb激动性单链融合多肽，其包含(i)第一可溶性肿瘤坏死因子(tnf)超家族细胞因子结构域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性tnf超家族细胞因子结构域、(iv)第二肽接头和(v)第三可溶性tnf超家族细胞因子结构域，其中，每个可溶性tnf超家族细胞因子结构域都缺乏茎区，第一肽接头和第二肽接头独立地具有3至8个氨基酸的长度，其中每个tnf超家族细胞因子结构域均是4-1bb结合结构域。在一个实施方式中，4-1bb激动剂是4-1bb激动性scfv抗体，其包含与任何前述vl结构域连接的任何前述vh结构域。在一个实施方式中，4-1bb激动剂是bpsbioscience4-1bb激动剂抗体(目录号79097-2)，可从美国加利福尼亚州圣地亚哥的bpsbioscience商购。在一个实施方式中，4-1bb激动剂是creativebiolabs4-1bb激动剂抗体(目录号mom-18179)，可从美国纽约州shirley的creativebiolabs商购。三、til生产过程图1描述了一个包含这些特征中的一些特征的示例性的til过程(称为过程2a)，图2描述了本发明的此实施方式相对于过程1c的一些优点，如图84那样。图3显示了用于比较的过程1c。图4(较高的细胞计数)和图5(较低的细胞计数)显示了基于过程2a的til治疗的两个替代时间线。过程2a的一个实施方式在图6以及图27示出。图83和84进一步提供了与示例性1c过程相比的示例性2a过程。如本文所讨论的，本发明可以包括与冷冻保存的til的再刺激有关的步骤，以在移植入患者之前增加其代谢活性并因此增加相对健康，以及测试所述代谢健康的方法。如本文一般概述的，til通常取自患者样品并在移植入患者之前进行操作以扩增其数量。在一些实施方式中，til可以可选地进行如下所述的遗传操作。在一些实施方式中，可以冷冻保存til。一旦解冻，在输注给患者之前，也可以对它们进行再刺激以增加它们的新陈代谢。在一些实施方式中，如下文详述以及实施例和附图中所讨论的，第一次扩增(包括称为prerep的过程以及图27中步骤a所示的过程)被缩短为3天至14天，第二次扩增(包括称为rep的过程以及图27中步骤b所示的过程)被缩短为7天至14天。在一些实施方式中，如实施例中所述以及如图4、图5和图27中所示，第一次扩增(例如图27中步骤b中所述的扩增)被缩短为11天，第二次扩增(例如图27中步骤d中所述的扩增)被缩短为11天。在一些实施方式中，如下文详述以及实施例和附图中所讨论的，第一次扩增和第二次扩增的组合(例如图27中步骤b和步骤d所述的扩增)被缩短为22天。下文的“步骤”标记a、b、c等参考图27和本文所述的某些实施方式。下述的和图27中的步骤顺序是示例性的，本申请和本文公开的方法预期步骤的任何组合或顺序，以及附加步骤、步骤的重复和/或步骤的省略。a、步骤a：获得患者肿瘤样品通常，til最初从患者肿瘤样品获得(“原代til”)，然后如本文所述地扩增为更大的群用于进一步操作，可选地，如本文所概述的冷冻保存、再刺激，并可选地评估表型和代谢参数作为til健康的指示。可以使用本领域已知的方法获得患者肿瘤样品，通常通过手术切除、穿刺活检或者用于获得含有肿瘤和til细胞混合物的样品的其他手段。通常，肿瘤样品可以来自任何实体瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或者转移性肿瘤。肿瘤样品也可以是液体肿瘤，例如，从血液恶性肿瘤获得的肿瘤。实体瘤可以是任何癌症类型，包括但不限于乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肺癌、脑癌、肾癌、胃癌和皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤)。在一些实施方式中，有用的til获自恶性黑色素瘤肿瘤，因为据报道这些恶性黑色素瘤肿瘤具有特别高水平的til。术语“实体瘤”指通常不包含囊肿或者液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或者恶性的。术语“实体瘤癌”指恶性、肿瘤性或者癌性实体瘤。实体瘤癌症包括但不限于肉瘤、恶性上皮肿瘤(carcinoma)和淋巴瘤，例如肺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌和膀胱癌。在一些实施方式中，癌症选自宫颈癌、头颈癌(包括例如头颈部鳞状细胞癌(hnscc))、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肉瘤、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌。实体瘤的组织结构包括相互依赖的组织隔室，包括实质(癌细胞)和支持的基质细胞(癌细胞分散在其中并且可以提供支持的微环境)。术语“血液恶性肿瘤”指造血和淋巴组织(包括但不限于血液、骨髓、淋巴结和淋巴系统的组织)的哺乳动物癌症和肿瘤。血液恶性肿瘤也称为“液体肿瘤”。血液恶性肿瘤包括但不限于急性淋巴细胞白血病(all)、慢性淋巴细胞淋巴瘤(cll)、小淋巴细胞淋巴瘤(sll)、急性髓样白血病(aml)、慢性粒细胞白血病(cml)、急性单核细胞白血病(amol)、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。术语“b细胞血液恶性肿瘤”指影响b细胞的血液恶性肿瘤。一旦获得肿瘤样品，通常使用锐器解剖法(sharpdissection)将肿瘤样品切成1mm3至约8mm3的小块；其中，约2mm3至3mm3是特别有用的。使用酶促肿瘤消化液从这些碎片培养til。此种肿瘤消化液可通过在酶培养基(例如roswellparkmemorialinstitute(rpmi)1640缓冲液、2mm谷氨酸盐、10mcg/ml庆大霉素、30u/mldnase和1.0mg/ml胶原酶)中孵育然后机械解离(例如使用组织解离剂)来产生。肿瘤消化液可通过如下方法产生：将肿瘤置于酶培养基中并将肿瘤机械解离约1分钟，然后在37℃、5％co2中孵育30分钟，然后在上述条件下进行机械解离和孵育的重复循环，直至仅存在小的组织碎片。在该过程结束时，如果细胞悬液含有大量红细胞或死细胞，则可以使用ficoll分支亲水性多糖进行密度梯度分离以除去这些细胞。可以使用本领域已知的替代方法，例如美国专利申请公开号2012/0244133a1中描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。任何前述方法都可以用于本文所述扩增til的方法或治疗癌症的方法的任何实施方式中。通常，收获的细胞悬液称为“原代细胞群”或者“新鲜收获的”细胞群。在一些实施方式中，碎片化包括物理碎片化，包括例如切碎和消化。在一些实施方式中，碎片化是物理碎片化。在一些实施方式中，碎片化是切碎。在一些实施方式中，碎片化是通过消化。在一些实施方式中，可由酶促肿瘤消化液和从患者获得的肿瘤碎片来对til进行初始培养。在一些实施方式中，当肿瘤是实体瘤时，例如在步骤a中获得肿瘤样品后，肿瘤经历物理破碎(如图27所提供)。在一些实施方式中，碎片化发生在冷冻保存之前。在一些实施方式中，碎片化发生在在冷冻保存之后。在一些实施方式中，碎片化发生在获得肿瘤之后并且没有任何冷冻保存的情况下。在一些实施方式中，肿瘤是碎片化的，并且将10、20、30、40或者更多个碎片或者片放置在各个容器中用于第一次扩增。在一些实施方式中，肿瘤是碎片化的，并且将30或40个碎片或者片放置在各个容器中用于第一次扩增。在一些实施方式中，肿瘤是碎片化的，并且将40个碎片或者片放置在各个容器中用于第一次扩增。在一些实施方式中，多个碎片包括约4个至约50个碎片；其中，每个碎片的体积为约27mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约30个至约60个碎片，碎片总体积为约1300mm3至约1500mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总体积为约1350mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总质量为约1克至约1.5克。在一些实施方式中，多个碎片包括约4个碎片。在一些实施方式中，til获自肿瘤碎片。在一些实施方式中，通过锐器解剖法获得肿瘤碎片。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约1mm3至10mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约1mm3至8mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约1mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约2mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约3mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约4mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约5mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约6mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约7mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约8mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约9mm3。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约10mm3。在一些实施方式中，肿瘤为1mm至4mm×1mm至4mm×1mm至4mm。在一些实施方式中，肿瘤为1mm×1mm×1mm。在一些实施方式中，肿瘤为2mm×2mm×2mm。在一些实施方式中，肿瘤为3mm×3mm×3mm。在一些实施方式中，肿瘤为4mm×4mm×4mm。在一些实施方式中，切除肿瘤以使每个块的出血组织、坏死组织和/或脂肪组织的量最小化。在一些实施方式中，切除肿瘤以使每个块的出血组织的量最小化。在一些实施方式中，切除肿瘤以使每个块的坏死组织的量最小化。在一些实施方式中，切除肿瘤以使每个块的脂肪组织的量最小化。在一些实施方式中，进行肿瘤破碎以维持肿瘤内部结构。在一些实施方式中，在不用解剖刀进行锯切运动的情况下进行肿瘤破碎。在一些实施方式中，til获自肿瘤消化物。在一些实施方式中，肿瘤消化物通过在酶培养基(例如但不限于rpmi1640、2mmglutamax、10mg/ml庆大霉素、30u/mldnase和1.0mg/ml胶原酶)中孵育，然后机械解离(gentlemacs，miltenyibiotec，aubum，加利福尼亚州)来产生。将肿瘤置于酶培养基中后，可以机械解离肿瘤约1分钟。然后将溶液在37℃、5％co2中孵育30分钟，然后再次机械破碎约1分钟。在37℃、5％co2中再次孵育30分钟后，可以第三次机械破碎肿瘤约1分钟。在一些实施方式中，在第三次机械破碎后，如果存在大块组织，则对样品施加1或者2次另外的机械解离，在或者不在37℃、5％co2中进行另外的30分钟孵育。在一些实施方式中，在最终孵育结束时，如果细胞悬液含有大量红细胞或者死细胞，则可以使用ficoll进行密度梯度分离以除去这些细胞。在一些实施方式中，在第一次扩增步骤之前收获的细胞悬液称为“原代细胞群”或者“新鲜收获的”细胞群。在一些实施方式中，可选地，可以在收获样品后将细胞冷冻，在进入步骤b所描述的扩增之前冷冻保存，这将在下文进一步详细描述，在图27中进行举例说明。b、步骤b：第一次扩增1、年轻til在一些实施方式中，本发明方法提供获得年轻til，年轻til能够在施用给受试者/患者后增加复制周期，因此相对于较老til(即，在施用给受试者/患者之前进一步经历了更多轮复制的til)可以提供其他治疗益处。文献中已经描述了年轻til的特征，例如donia等，scandinavianjournalofimmunology，75：157-167(2012)；dudley等，clincancerres，16：6122-6131(2010)；huang等，jimmunother，28(3)：258-267(2005)；besser等，clincancerres，19(17)：of1-of9(2013)；besser等，jimmunother，32：415-423(2009)；bunds等，jimmunother，32：415-423(2009)；robbins等，jimmunol，2004；173：7125-7130；shen等，jimmunother，30：123-129(2007)；zhou等，jimmunother，28：53-62(2005)和tran等，jimmunother，31：742-751(2008)，其全部内容通过引用整体并入本文。t和b淋巴细胞的多种抗原受体通过有限但大量的基因片段的体细胞重组来产生。这些基因片段：v(可变区)、d(多变区)、j(结合区)和c(恒定区)确定免疫球蛋白和t细胞受体(tcr，t-cellreceptor)的结合特异性和下游应用。本发明提供了产生til的方法，其显示并增加t细胞谱系的多样性。在一些实施方式中，通过本方法获得的til显示出t细胞谱系多样性的增加。在一些实施方式中，与新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(例如包括除了图27中所示那些之外的方法)制备的til相比，通过本发明方法获得的til显示出t细胞谱系多样性的增加。在一些实施方式中，与新鲜收获的til和/或使用如图83所示的称为过程1c的方法制备的til相比，通过本方法获得的til显示出t细胞谱系多样性的增加。在一些实施方式中，第一次扩增中获得的til显示出t细胞谱系多样性的增加。在一些实施方式中，多样性的增加是免疫球蛋白多样性和/或t细胞受体多样性的增加。在一些实施方式中，免疫球蛋白多样性是免疫球蛋白重链多样性。在一些实施方式中，免疫球蛋白多样性是免疫球蛋白轻链多样性。在一些实施方式中，多样性是t细胞受体多样性。在一些实施方式中，多样性是选自α、β、γ和δ受体之一的t细胞受体的多样性。在一些实施方式中，t细胞受体(tcr)α和/或β的表达增加。在一些实施方式中，t细胞受体(tcr)α的表达增加。在一些实施方式中，t细胞受体(tcr)β的表达增加。在一些实施方式中，tcrab(即tcrα/β)的表达增加。例如，如图27的步骤a中所述，切开或者消化肿瘤碎片后，在有利于til生长(相对于肿瘤和其他细胞)的条件下，在含有il-2的血清中培养所得细胞。在一些实施方式中，在2ml孔中的包含灭活的人ab血清和6000iu/ml的il-2的培养基中孵育肿瘤消化物。培养此原代细胞群一段时间，通常为3天至14天，产生大量til群，通常为约1×108个大量til细胞。在一些实施方式中，培养此原代细胞群7天至14天，产生大量til群，通常约1×108个大量til细胞。在一些实施方式中，培养此原代细胞群10至14天，产生大量til群，通常约1×108个大量til细胞。在一些实施方式中，培养此原代细胞群约11天，产生大量til群，通常约1×108个大量til细胞。在一个优选实施方式中，til的扩增可以如下进行：使用如下文和此处所述的初始大量til扩增步骤(例如，如图27的步骤b中所述的那些，其可以包括称为pre-rep的过程)，然后进行如下文步骤d和此处所述的第二次扩增(步骤d，包括称为快速扩增方案(rep)步骤的过程)，随后可选地进行冷冻保存，然后进行如下文和此处所述的第二次步骤d(包括称为再刺激rep步骤的过程)。可选地，可以对从该过程获得的til进行如本文所述的表型特征和代谢参数的表征。在用24孔板开始til培养的实施方式中，例如，使用costar24孔细胞培养板、平底(康宁公司，康宁，纽约)，可以在每个孔接种2ml含有il-2(6000iu/ml；chironcorp.，埃默里维尔，加利福尼亚州)的完全培养基(cm)中的1×106个肿瘤消化细胞或者一个肿瘤碎片。在一些实施方式中，肿瘤碎片为约1mm3至10mm3。在一些实施方式中，第一扩增培养基被称为“cm”，其中cm是培养基的缩写。在一些实施方式中，步骤b的cm由含有glutamax的rpmi1640组成，补充有10％人ab血清、25mmhepes和10mg/ml庆大霉素。在用容量为40ml、透气性硅底为10cm2的透气性烧瓶(例如，g-rex10；wilsonwolfmanufacturing，新布莱顿，明尼苏达州)开始培养的实施方式中(图1)，各个烧瓶装有在10至40ml含有il-2的cm中的10×106至40×106个活肿瘤消化细胞或者5至30个肿瘤碎片。在37℃、5％co2的潮湿培养箱中孵育g-rex10和24孔板，培养开始5天后，移除一半培养基，换上新鲜的cm和il-2，在第5天后，每2至3天更换一半的培养基。在制备肿瘤碎片后，在有利于til生长(相对于肿瘤和其他细胞)的条件下，在含有il-2的血清中培养所得细胞(即碎片)。在一些实施方式中，在2ml孔中的含有灭活的人ab血清(或在一些情况下，如本文所述，在aapc细胞群存在下)和6000iu/mlil-2的培养基中，孵育肿瘤消化液。将该原代细胞群培养一段时间，通常为10至14天，产生大量til群，通常约1×108个大量til细胞。在一些实施方式中，第一次扩增期间的生长培养基包含il-2或其变体。在一些实施方式中，il是重组人il-2(rhil-2)。在一些实施方式中，1mg小管的il-2储备溶液具有20×106iu/mg至30×106iu/mg的比活性。在一些实施方式中，1mg小管的il-2储备溶液具有20×106iu/mg的比活性。在一些实施方式中，1mg小管的il-2储备溶液具有25×106iu/mg的比活性。在一些实施方式中，1mg小管的il-2储备溶液具有30×106iu/mg的比活性。在一些实施方式中，il-2储备溶液的终浓度为4×106iu/mg至8×106iu/mgil-2。在一些实施方式中，il-2储备溶液的终浓度为5×106iu/mg至7×106iu/mgil-2。在一些实施方式中，il-2储备溶液的终浓度为6×106iu/mgil-2。在一些实施方式中，如实施例4中所述制备il-2储备溶液。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约10,000iu/ml的il-2，约9,000iu/ml的il-2，约8,000iu/ml的il-2，约7,000iu/ml的il-2，约6000iu/ml的il-2或约5,000iu/ml的il-2。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约9,000iu/ml的il-2至约5,000iu/ml的il-2。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约8,000iu/ml的il-2至约6,000iu/ml的il-2。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约7,000iu/ml的il-2至约6,000iu/ml的il-2。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约6,000iu/ml的il-2。在一个实施方式中，细胞培养基还包含il-2。在一些实施方式中，细胞培养基包含约3000iu/ml的il-2。在一个实施方式中，细胞培养基还包含il-2。在一个优选实施方式中，细胞培养基包含约3000iu/ml的il-2。在一个实施方式中，细胞培养基包含约1000iu/ml、约1500iu/ml、约2000iu/ml、约2500iu/ml、约3000iu/ml、约3500iu/ml、约4000iu/ml、约4500iu/ml、约5000iu/ml、约5500iu/ml、约6000iu/ml、约6500iu/ml、约7000iu/ml、约7500iu/ml或者约8000iu/ml的il-2。在一个实施方式中，细胞培养基包含1000至2000iu/ml、2000至3000iu/ml、3000至4000iu/ml、4000至5000iu/ml、5000至6000iu/ml、6000至7000iu/ml、7000至8000iu/ml，或者约8000iu/ml的il-2。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约500iu/ml的il-15、约400iu/ml的il-15、约300iu/ml的il-15、约200iu/ml的il-15、180iu/ml的il-15、约160iu/ml的il-15、约140iu/ml的il-15、约120iu/ml的il-15或者约100iu/ml的il-15。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约500iu/ml的il-15至约100iu/ml的il-15。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约400iu/ml的il-15至约100iu/ml的il-15。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约300iu/ml的il-15至约100iu/ml的il-15。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约200iu/ml的il-15。在一些实施方式中，细胞培养基包含约180iu/ml的il-15。在一个实施方式中，细胞培养基还包含il-15。在一个优选实施方式中，细胞培养基包含约180iu/ml的il-15。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约20iu/ml的il-21、约15iu/ml的il-21、约12iu/ml的il-21、约10iu/ml的il-21、约5iu/ml的il-21、约4iu/ml的il-21、约3iu/ml的il-21、约2iu/ml的il-21、约1iu/ml的il-21或者约0.5iu/ml的il-21。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约20iu/ml的il-21至约0.5iu/ml的il-21。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约15iu/ml的il-21至约0.5iu/ml的il-21。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约12iu/ml的il-21至约0.5iu/ml的il-21。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约10iu/ml的il-21至约0.5iu/ml的il-21。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约5iu/ml的il-21至约1iu/ml的il-21。在一些实施方式中，第一扩增培养基包含约2iu/ml的il-21。在一些实施方式中，细胞培养基包含约1iu/ml的il-21。在一些实施方式中，细胞培养基包含约0.5iu/ml的il-21。在一个实施方式中，细胞培养基还包含il-21。在一个优选实施方式中，细胞培养基包含约1iu/ml的il-21。在一个实施方式中，细胞培养基包含okt-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基包含约30ng/ml的okt-3抗体。在一个实施方式中，细胞培养基包含约0.1ng/ml、约0.5ng/ml、约1ng/ml、约2.5ng/ml、约5ng/ml、约7.5ng/ml、约10ng/ml、约15ng/ml、约20ng/ml、约25ng/ml、约30ng/ml、约35ng/ml、约40ng/ml、约50ng/ml、约60ng/ml、约70ng/ml、约80ng/ml、约90ng/ml、约100ng/ml、约200ng/ml、约500ng/ml和约1μg/ml的okt-3抗体。在一个实施方式中，细胞培养基包含0.1ng/ml至1ng/ml、1ng/ml至5ng/ml、5ng/ml至10ng/ml、10ng/ml至20ng/ml、20ng/ml至30ng/ml、30ng/ml至40ng/ml、40ng/ml至50ng/ml以及50ng/ml至100ng/ml的okt-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基不包含okt-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基在细胞培养基中包含一种以上tnfrsf激动剂。在一些实施方式中，tnfrsf激动剂包括4-1bb激动剂。在一些实施方式中，tnfrsf激动剂是4-1bb激动剂，4-1bb激动剂选自：乌瑞鲁单抗、乌托鲁单抗、eu-101、融合蛋白及其片段、衍生物、变体、生物类似物和组合。在一些实施方式中，以足以达到细胞培养基中tnfrsf激动剂为0.1μg/ml至100μg/ml的浓度添加tnfrsf激动剂。在一些实施方式中，以足以达到细胞培养基中tnfrsf激动剂为20μg/ml至40μg/ml的浓度添加tnfrsf激动剂。在一些实施方式中，除一种以上tnfrsf激动剂之外，细胞培养基还包含初始浓度为约3000iu/ml的il-2和初始浓度为约30ng/ml的okt-3抗体，其中，一种以上tnfrsf激动剂包括4-1bb激动剂。在一些实施方式中，第一次扩增的培养基被称为“cm”(培养基的缩写)。在一些实施方式中，将其称为cm1(培养基1)。在一些实施方式中，cm由具有glutamax的rpmi1640组成，补充有10％人ab血清、25mmhepes和10mg/ml庆大霉素。在具有40ml容量和10cm2透气性硅底的透气性烧瓶(例如g-rex10；wilsonwolfmanufacturing，新布莱顿，明尼苏达州)中开始培养的实施方式中(图1)，各个烧瓶在含有il-2的10-40mlcm中装载10×106至40×106个活肿瘤消化细胞或5至30个肿瘤碎片。将g-rex10和24孔板在37℃、5％co2的潮湿培养箱中培养，培养开始5天后，取出一半培养基，换上新鲜的cm和il-2，在第5天后，每2-3天更换一半的培养基。在一些实施方式中，cm是实施例中描述的cm1，参见实施例5。在一些实施方式中，第一次扩增发生在初始细胞培养基或第一细胞培养基中。在一些实施方式中，初始细胞培养基或第一细胞培养基包含il-2。在一些实施方式中，如实施例和附图中所讨论的，第一次扩增(包括例如图27的步骤b中所述的那些过程，其可以包括有时称为pre-rep的那些过程)过程被缩短为3天至14天。在一些实施方式中，如实施例中所讨论以及如图4和图5中所示的，以及包括例如图27的步骤b中所述的扩增，第一次扩增(包括例如图27的步骤b中所述的那些过程，其可以包括有时称为pre-rep的那些过程)被缩短为7天至14天。在一些实施方式中，如实施例中所讨论以及如图4和图5所示的，步骤b的第一次扩增被缩短为10至14天。在一些实施方式中，如实施例中所讨论以及如图4和图5所示的，以及包括例如图27的步骤b中所述的扩增，第一次扩增被缩短为11天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或者14天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行1天至14天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行2天至14天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行3天至14天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行4天至14天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行5天至14天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行6天至14天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行7天至14天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行8天至14天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行9天至14天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行10天至14天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行11天至14天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行12天至14天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行13天至14天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行14天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行1天至11天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行2天至11天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行3天至11天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行4天至11天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行5天至11天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行6天至11天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以持续7天至11天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行8天至11天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行9天至11天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行10天至11天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行11天。在一些实施方式中，在第一次扩增期间，采用il-2、il-7、il-15和/或il-21的组合作为组合。在一些实施方式中，在第一次扩增期间，包括例如在根据图27的步骤b期间以及如此处所述，可以包括il-2、il-7、il-15和/或il-21以及它们的任何组合。在一些实施方式中，在第一次扩增期间，采用il-2、il-15和il-21的组合作为组合。在一些实施方式中，在根据图27的步骤b期间以及如此处所述，可以包括il-2、il-15和il-21以及它们的任何组合。在一些实施方式中，如实施例和附图中所讨论的，第一次扩增(包括被称为pre-rep的过程；例如，根据图27的步骤b)的过程被缩短为3天至14天。在一些实施方式中，如实施例中所讨论以及如图4和图5所示的，步骤b的第一次扩增被缩短为7天至14天。在一些实施方式中，如实施例中所讨论以及如图4、图5和图27所示的，步骤b的第一次扩增缩短至10至14天。在一些实施方式中，如实施例中所讨论以及如图4、图5和图27所示的，第一次扩增被缩短为11天。在一些实施方式中，第一次扩增，例如根据图27的步骤b，在封闭系统生物反应器中进行。在一些实施方式中，如此处所述，采用封闭系统进行til扩增。在一些实施方式中，采用单个生物反应器。在一些实施方式中，例如，采用的单个生物反应器是g-rex-10或者g-rex-100。在一些实施方式中，封闭系统生物反应器是单个生物反应器。c、步骤c：第一次扩增向第二次扩增的转变在一些情况下，可以使用下文讨论的方案，立即冷冻保存从第一次扩增获得的大量til群，包括例如从例如图27所示的步骤b收获的til群。可选地，可以对第一次扩增收获的til群(称为第二til群)进行第二次扩增(其可以包括有时被称为rep的扩增)，然后如下文所述冷冻保存。类似地，在基因修饰的til将被用于治疗的情况下，第一til群(有时被称为大量til群)或者第二til群(在一些实施方式中可以包括被称为reptil群的群)可以在扩增之前或者第一次扩增之后且在第二次扩增之前进行基因修饰以用于合适的治疗。在一些实施方式中，储存从第一次扩增(例如，如图27所示的步骤b)获得的til直至进行表型选择。在一些实施方式中，从第一次扩增(例如，如图27所示的步骤b)获得的til不储存而是直接进行第二次扩增。在一些实施方式中，在第一次扩增之后且在第二次扩增之前，不冷冻保存从第一次扩增获得的til。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或者14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的约3天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的约4天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的约4天至10天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的约7天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的约14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或者14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的1天至14天。在一些实施方式中，第一次til扩增可以进行2天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的3天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的4天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的5天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的6天到14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的7天到14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的8天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的9天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的10天到14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的11天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的12天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的13天至14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的14天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的1天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的2天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的3天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的4天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的5天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的6天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的7天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的8天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的9天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的10天至11天。在一些实施方式中，第一次扩增向第二次扩增的转变发生在发生碎片化后的11天。在一些实施方式中，在第一次扩增之后和第二次扩增之前不储存til，并且til直接进行第二次扩增(例如，在一些实施方式中，从步骤b向步骤d转变的期间不进行储存)(如图27所示)。在一些实施方式中，如本文所述，转变在封闭系统中发生。在一些实施方式中，来自第一次扩增的til(即第二til群)不经历转变期而直接进入第二次扩增。在一些实施方式中，在封闭系统生物反应器中进行第一次扩增向第二次扩增的转变(例如根据图27的步骤c)。在一些实施方式中，如本文所述，采用封闭系统进行til扩增。在一些实施方式中，采用单个生物反应器。在一些实施方式中，例如，采用的单个生物反应器是g-rex-10或者g-rex-100。在一些实施方式中，封闭系统生物反应器是单个生物反应器。d、步骤d：第二次扩增在一些实施方式中，例如在步骤a和步骤b之后，在收获和初始大量处理之后，til细胞群的数量增加，该转变称为步骤c，如图27所示。此种进一步的扩增在本文中称为第二次扩增，其可以包括本领域中通常称为快速扩增过程(rep；以及图27的步骤d所示的过程)的扩增过程。通常在透气性容器中使用包含多种组分的培养基来完成第二次扩增，所述组分包括饲养细胞、细胞因子源(cytokinesource)和抗cd3抗体。在一些实施方式中，til的第二次扩增或第二次til扩增(其可包括有时称为rep的扩增；以及图27的步骤d中所示的过程)可使用本领域技术人员已知的任何til烧瓶或容器进行。在一些实施方式中，第二til扩增可以进行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或者14天。在一些实施方式中，第二til扩增可以进行约7天至约14天。在一些实施方式中，第二til扩增可以进行约8天至约14天。在一些实施方式中，第二til扩增可以进行约9天至约14天。在一些实施方式中，第二til扩增可以进行约10天至约14天。在一些实施方式中，第二til扩增可以进行约11天至约14天。在一些实施方式中，第二til扩增可以进行约12天至约14天。在一些实施方式中，第二til扩增可进行约13天至约14天。在一些实施方式中，第二til扩增可以进行约14天。在一个实施方式中，第二次扩增可以使用本公开的方法在透气性容器中进行(包括例如称为rep的扩增；以及如图27的步骤d中所示的过程)。例如，可以在白细胞介素2(il-2)或白细胞介素-15(il-15)的存在下，使用非特异性t细胞受体刺激来快速扩增til。非特异性t细胞受体刺激可包括，例如，抗cd3抗体，例如约30ng/ml的okt-3，一种小鼠单克隆抗cd3抗体(可从ortho-mcneil，拉里坦，新泽西州或miltenyibiotech，奥本，加利福尼亚州商购)或者uhct-1(可从biolegend，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国商购)。可选地在t细胞生长因子(如300iu/mlil-2或il-15)存在下，可通过在第二次扩增期间包括一种以上癌症抗原(包括其抗原性部分，例如表位)在体外诱导til的进一步刺激，快速扩增til，该抗原可可选地由载体表达，例如人白细胞抗原a2(hla-a2)结合肽，例如0.3μmmart-l26-35(27l)或gp100：209-217(210m)。其他合适的抗原可包括例如ny-eso-1、trp-1、trp-2、酪氨酸酶癌抗原、mage-a3、ssx-2区和vegfr2，或其抗原性部分。也可通过用表达hla-a2的抗原呈递细胞脉冲的相同癌症抗原再刺激，来快速扩增til。或者，可以用例如经辐照的自体淋巴细胞或用经辐照的hla-a2+同种异体淋巴细胞和il-2进一步再刺激til。在一些实施方式中，再刺激作为第二次扩增的一部分发生。在一些实施方式中，在经辐照的自体淋巴细胞或者经辐照的hla-a2+同种异体淋巴细胞和il-2的存在下，发生第二次扩增。在一个实施方式中，细胞培养基还包含il-2。在一些实施方式中，细胞培养基包含约3000iu/ml的il-2。在一个实施方式中，细胞培养基包含约1000iu/ml、约1500iu/ml、约2000iu/ml、约2500iu/ml、约3000iu/ml、约3500iu/ml、约4000iu/ml、约4500iu/ml、约5000iu/ml、约5500iu/ml、约6000iu/ml、约6500iu/ml、约7000iu/ml、约7500iu/ml，或约8000iu/ml的il-2。在一个实施方式中，细胞培养基包含1000iu/ml至2000iu/ml、2000iu/ml至3000iu/ml、3000iu/ml至4000iu/ml、4000iu/ml至5000iu/ml、5000iu/ml至6000iu/ml、6000iu/ml至7000iu/ml、7000iu/ml至8000iu/ml，或8000iu/ml的il-2。在一个实施方式中，细胞培养基包含okt-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基包含约30ng/ml的okt-3抗体。在一个实施方式中，细胞培养基包含约0.1ng/ml、约0.5ng/ml、约1ng/ml、约2.5ng/ml、约5ng/ml、约7.5ng/ml、约10ng/ml、约15ng/ml、约20ng/ml、约25ng/ml、约30ng/ml、约35ng/ml、约40ng/ml、约50ng/ml、约60ng/ml、约70ng/ml、约80ng/ml、约90ng/ml、约100ng/ml、约200ng/ml、约500ng/ml和约1μg/ml的okt-3抗体。在一个实施方式中，细胞培养基包含0.1ng/ml至1ng/ml、1ng/ml至5ng/ml、5ng/ml至10ng/ml、10ng/ml至20ng/ml，20ng/ml至30ng/ml、30ng/ml至40ng/ml、40ng/ml至50ng/ml、50ng/ml至100ng/ml的okt-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基不包含okt-3抗体。在一些实施方式中，细胞培养基在细胞培养基中包含一种以上tnfrsf激动剂。在一些实施方式中，tnfrsf激动剂包括4-1bb激动剂。在一些实施方式中，tnfrsf激动剂是4-1bb激动剂，4-1bb激动剂选自：乌瑞鲁单抗、乌托鲁单抗、eu-101、融合蛋白及其片段、衍生物、变体、生物类似物和组合。在一些实施方式中，以足以达到细胞培养基中tnfrsf激动为0.1μg/ml至100μg/ml的浓度添加tnfrsf激动剂。在一些实施方式中，以足以达到细胞培养基中tnfrsf激动为20μg/ml至40μg/ml的浓度添加tnfrsf激动剂。在一些实施方式中，除一种以上tnfrsf激动剂之外，细胞培养基还包含初始浓度为约3000iu/ml的il-2和初始浓度为约30ng/ml的okt-3抗体，其中，一种以上tnfrsf激动剂包括4-1bb激动剂。在一些实施方式中，在第二次扩增期间采用il-2、il-7、il-15和/或il-21的组合作为组合。在一些实施方式中，第二次扩增期间(包括例如根据图27的步骤d过程，以及如此处所述)可以包括il-2、il-7、il-15和/或il-21以及它们的任何组合。在一些实施方式中，在第二次扩增期间采用il-2、il-15和il-21的组合作为组合。在一些实施方式中，在根据图27的步骤d过程中，以及如此处所述，可以包括il-2、il-15和il-21及它们的任何组合。在一些实施方式中，第二次扩增可在包含il-2、okt-3、抗原呈递饲养细胞和可选的tnfrsf激动剂的补充细胞培养基中进行。在一些实施方式中，第二次扩增发生在补充细胞培养基中。在一些实施方式中，补充细胞培养基包含il-2、okt-3和抗原呈递饲养细胞。在一些实施方式中，第二细胞培养基包含il-2、okt-3和抗原呈递细胞(apc；也称为抗原呈递饲养细胞)。在一些实施方式中，第二次扩增在包含il-2、okt-3和抗原呈递饲养细胞(即抗原呈递细胞)的细胞培养基中发生。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约500iu/ml的il-15、约400iu/ml的il-15、约300iu/ml的il-15、约200iu/ml的il-15、约180iu/ml的il-15、约160iu/ml的il-15、约140iu/ml的il-15、约120iu/ml的il-15或者约100iu/ml的il-15。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约500iu/ml的il-15至约100iu/ml的il-15。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约400iu/ml的il-15至约100iu/ml的il-15。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约300iu/ml的il-15至约100iu/ml的il-15。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约200iu/ml的il-15。在一些实施方式中，细胞培养基包含约180iu/ml的il-15。在一个实施方式中，细胞培养基还包含il-15。在一个优选实施方式中，细胞培养基包含约180iu/ml的il-15。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约20iu/ml的il-21、约15iu/ml的il-21、约12iu/ml的il-21、约10iu/ml的il-21、约5iu/ml的il-21、约4iu/ml的il-21、约3iu/ml的il-21、约2iu/ml的il-21、约1iu/ml的il-21或者约0.5iu/ml的il-21。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约20iu/ml的il-21至约0.5iu/ml的il-21。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约15iu/ml的il-21至约0.5iu/ml的il-21。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约12iu/ml的il-21至约0.5iu/ml的il-21。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约10iu/ml的il-21至约0.5iu/ml的il-21。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约5iu/ml的il-21至约1iu/ml的il-21。在一些实施方式中，第二次扩增培养基包含约2iu/ml的il-21。在一些实施方式中，细胞培养基包含约1iu/ml的il-21。在一些实施方式中，细胞培养基包含约0.5iu/ml的il-21。在一个实施方式中，细胞培养基还包含il-21。在一个优选实施方式中，细胞培养基包含约1iu/ml的il-21。在一些实施方式中，抗原呈递饲养细胞(apc)是pbmc。在一个实施方式中，在快速扩增和/或第二次扩增中，til比pbmc和/或抗原呈递细胞的比率为约1：25、约1：50、约1：100、约1：125、约1：150、约1：175、约1：200、约1：225、约1：250、约1：275、约1：300、约1：325、约1：350、约1：375、约1：400，或约1：500。在一个实施方式中，在快速扩增和/或第二次扩增中，til比pbmc的比率在1：50至1：300之间。在一个实施方式中，在快速扩增和/或第二次扩增中，til比pbmc的比率在1：100至1：200之间。在一个实施方式中，rep和/或第二次扩增在烧瓶中进行；其中，大量til与100或200倍过量的灭活饲养细胞、30mg/ml的okt3抗cd3抗体和3000iu/ml的il-2混合于150ml培养基中。进行培养基更换(通常通过吸入新鲜培养基替换2/3培养基)，直至细胞转移至替代生长室。如下文更充分讨论的，替代生长室包括g-rex烧瓶和透气性容器。在一些实施方式中，如实施例和附图中所讨论的，第二次扩增(其可以包括称为rep过程)缩短至7天至14天。在一些实施方式中，第二次扩增缩短至11天。在一个实施方式中，rep和/或第二次扩增可以使用如前所述的t-175烧瓶和透气袋(tran等，j.immunother.，2008，31，742-51；dudley等，j.immunother.，2003，26，332-42)或透气性培养皿(g-rex烧瓶)进行。在一些实施方式中，第二次扩增(包括称为快速扩增的扩增)在t-175烧瓶中进行，并且可以将悬浮于150ml培养基中的约1×106个til添加至每个t-175烧瓶中。til可以在cm和afm-v培养基的1：1混合物中培养，补充有3000iu/ml的il-2和30ng/ml的抗cd3。t-175烧瓶可以在37℃、5％co2中孵育。在第5天，可以使用含有3000iu/mlil-2的50/50培养基更换一半培养基。在一些实施方式中，在第7天，可以将来自两个t-175烧瓶的细胞合并在3l袋中，将300ml含有5％人ab血清和3000iu/mlil-2的aimv添加至300mltil悬液中。每天或每2天计数各个袋中的细胞数，并添加新鲜培养基以使细胞计数保持为0.5×106至2.0×106个细胞/ml。在一个实施方式中，第二次扩增(其可以包括称为rep的扩增，以及图27的步骤d中提到的那些)可以在容量为500ml、透气性硅底为100cm2的透气性烧瓶(g-rex100，可从wilsonwolfmanufacturingcorporation，新布莱顿，明尼苏达州，美国商购)中进行，5×106或10×106til可与pbmc一起培养在400ml的50/50培养基中，补充有5％人ab血清、3000iu/mlil-2和30ng/ml抗cd3(okt3)。g-rex100烧瓶可以在37℃、5％co2中孵育。在第5天，可以取出250ml上清液并置于离心瓶中并以1500rpm(491×g)离心10分钟。可以用150ml含有5％人ab血清、3000iu/ml的il-2的新鲜培养基重悬til沉淀，并加回到原来的g-rex100烧瓶中。当til在g-rex100烧瓶中连续扩增时，在第7天，可以将每个g-rex100中的til悬浮于各个烧瓶中存在的300ml培养基中，并且可以将细胞悬液分成可用于接种3个g-rex100烧瓶的3个100ml等分试样。然后可以向各个烧瓶中添加150ml含有5％人ab血清和3000iu/mlil-2的aim-v。g-rex100烧瓶可以在37℃、5％co2中孵育，4天后，可以向每个g-rex100烧瓶中添加150ml含有3000iu/mlil-2的aim-v。可以在培养的第14天收获细胞。在一个实施方式中，第二次扩增(包括称为rep的扩增)在烧瓶中进行；其中，大量til与100或200倍过量的灭活饲养细胞、30mg/mlokt3抗cd3抗体和3000iu/mlil-2混合于150ml培养基中。在一些实施方式中，进行培养基更换，直至细胞转移至替代生长室。在一些实施方式中，通过吸入新鲜培养基来更换2/3的培养基。在一些实施方式中，如下文更充分讨论的，替代生长室包括g-rex烧瓶和透气性容器。在一个实施方式中，进行第二次扩增(包括称为rep的扩增)，并且还包括选择肿瘤反应性优异的til的步骤。可以使用本领域已知的任何选择方法。例如，美国专利申请公开号2016/0010058a1所述的方法(其公开内容通过引用并入本文)可用于选择肿瘤反应性优异的til。可选地，可以使用本领域已知的标准检测法，在第二次扩增(包括称为rep扩增的扩增)之后进行细胞活力检测。例如，可以对大量til样品进行台盼蓝拒染试验实验(trypanblueexclusionassay)，其选择性地标记死细胞并允许活力评估。在一些实施方式中，可以使用cellometerk2自动细胞计数器(nexcelombioscience,劳伦斯，马萨诸塞州)对til样品进行计数和检测活力。在一些实施方式中，根据例如实施例15中描述的cellometerk2imagecytometer自动细胞计数器方案测定活力。在一些实施方式中，til的第二次扩增(包括称为rep的扩增)可以使用如前所述的t-175烧瓶和透气袋(trankq、zhouj、durflingerkh等，2008，j.immunother.，31：742-751和dudleyme、wunderlichjr、sheltonte等，2003，j.immunother.，26：332-342)或透气性g-rex烧瓶进行。在一些实施方式中，第二次扩增使用烧瓶进行。在一些实施方式中，第二次扩增使用透气性g-rex烧瓶进行。在一些实施方式中，第二次扩增在t-175烧瓶中进行，将约1×106til悬浮于约150ml培养基中，将它加至每个t-175烧瓶中。将til与经辐照的(50gy)同种异体pbmc(作为“饲养”细胞)以1：100比率一起培养，将细胞在cm和aim-v培养基的1：1混合物(50/50培养基)中培养，补充有3000iu/ml的il-2和30ng/ml的抗cd3。将t-175烧瓶在37℃、5％co2中孵育。在一些实施方式中，在第5天，使用含有3000iu/mlil-2的50/50培养基更换一半培养基。在一些实施方式中，在第7天，将来自2个t-175烧瓶的细胞合并于3l袋中，将300ml含有5％人ab血清和3000iu/mlil-2的aim-v添加至300mltil悬液中。可以每天或每2天计数各个袋中的细胞数，并且可以添加新鲜培养基以使细胞计数保持为约0.5×106至约2.0×106个细胞/ml。在一些实施方式中，第二次扩增(包括称为rep的扩增)在具有100cm2透气性硅底(g-rex100，wilsonwolf)的500ml容量的烧瓶中进行(图1)，约5×106或10×106til与经辐照同种异体pbmc以1：100的比率在400ml的50/50培养基中培养，该50/50培养基补充有3000iu/ml的il-2和30ng/ml的抗cd3。将g-rex100烧瓶在37℃、5％co2中孵育。在一些实施方式中，在第5天，取出250ml上清液并置于离心瓶中并以1500rpm(491g)离心10分钟。然后可以用150ml含有3000iu/ml的il-2的新鲜50/50培养基重悬til沉淀，并加回到原来的g-rex100烧瓶中。在til在g-rex100烧瓶中连续扩增的实施方式中，在第7天，将每个g-rex100中的til悬浮于各个烧瓶中存在的300ml培养基中，将细胞悬液分成用于接种3个g-rex100烧瓶的3个100ml等分试样。然后向各个烧瓶中添加150ml含有5％人ab血清和3000iu/mlil-2的aim-v。g-rex100烧瓶在37℃、5％co2中孵育，4天后，向每个g-rex100烧瓶中添加150ml含有3000iu/mlil-2的aim-v。在培养的第14天收获细胞。t和b淋巴细胞的多种抗原受体是通过有限但大量的基因片段的体细胞重组产生的。这些基因片段：v(可变区)、d(多变区)、j(结合区)和c(恒定区)，确定免疫球蛋白和t细胞受体(tcr)的结合特异性和下游应用。本发明提供了产生til的方法，其显示并增加t细胞谱系的多样性。在一些实施方式中，通过本方法获得的til显示出t细胞谱系多样性的增加。在一些实施方式中，在第二次扩增中获得的til显示出t细胞谱系多样性的增加。在一些实施方式中，多样性的增加是免疫球蛋白多样性和/或t细胞受体多样性的增加。在一些实施方式中，多样性是免疫球蛋白多样性，是免疫球蛋白重链多样性。在一些实施方式中，多样性是免疫球蛋白多样性，是免疫球蛋白轻链多样性。在一些实施方式中，多样性是t细胞受体多样性。在一些实施方式中，多样性是选自α、β、γ和δ受体之一的t细胞受体的多样性。在一些实施方式中，t细胞受体(tcr)α和/或β的表达增加。在一些实施方式中，t细胞受体(tcr)α的表达增加。在一些实施方式中，t细胞受体(tcr)β的表达增加。在一些实施方式中，tcrab(即tcrα/β)的表达增加。在一些实施方式中，第二次扩增培养基(例如有时称为cm2或第二细胞培养基)包含il-2、okt-3以及抗原呈递饲养细胞(apc)，如下文更详细讨论的。在一些实施方式中，第二次扩增(例如根据图27的步骤d)在封闭系统生物反应器中进行。在一些实施方式中，如本文所述，采用封闭系统进行til扩增。在一些实施方式中，采用单个生物反应器。在一些实施方式中，例如，采用的单个生物反应器是g-rex-10或者g-rex-100。在一些实施方式中，封闭系统生物反应器是单个生物反应器。1、饲养细胞和抗原呈递细胞在一个实施方式中，在reptil扩增期间和/或在第二次扩增期间，本文所述的第二次扩增步骤(例如，包括例如图27的步骤d中所述的那些以及称为rep的那些扩增)需要过量的饲养细胞。在许多实施方式中，饲养细胞是从健康献血者的标准全血单位获得的外周血单核细胞(pbmc)。使用标准方法(如ficoll-paque梯度分离)获得pbmc。通常，同种异体pbmc通过辐照或热处理被灭活并用于rep步骤，如实施例(特别是实施例14)所述，它提供了评估经辐照的同种异体pbmc的复制机能不全(replicationincompetence)的示例性方案。在一些实施方式中，如果第14天的活细胞总数小于在rep的第0天和/或第二次扩增的第0天(即第二次扩增的开始日)投入培养的初始活细胞数，则认为pbmc复制机能不全并接受pbmc用于本文所述的til扩增步骤。例如参见实施例14。在一些实施方式中，如果在okt3和il-2存在下，与rep的第0天和/或第二次扩增的第0天(即第二次扩增的开始日)投入培养的初始活细胞数相比，第7天和第14天培养的活细胞的总数没有增加，则认为pbmc复制机能不全并接受pbmc用于本文所述的til扩增步骤。在一些实施方式中，pbmc在30ng/mlokt3抗体和3000ru/mlil-2的存在下培养。例如参见实施例13。在一些实施方式中，如果在okt3和il-2存在下，与rep的第0天和/或第二次扩增的第0天(即第二次扩增的开始日)投入培养的初始活细胞数相比，第7天和第14天培养的活细胞的总数没有增加，则认为pbmc复制机能不全并接受pbmc用于本文所述的til扩增步骤。在一些实施方式中，pbmc在5-60ng/mlokt3抗体和1000-6000iu/mlil-2的存在下培养。在一些实施方式中，pbmc在10-50ng/ml的okt3抗体和2000-5000iu/ml的il-2的存在下培养。在一些实施方式中，pbmc在20-40ng/mlokt3抗体和2000-4000iu/mlil-2的存在下培养。在一些实施方式中，pbmc在25-35ng/mlokt3抗体和2500-3500iu/mlil-2的存在下培养。在一些实施方式中，抗原呈递饲养细胞是pbmc。在一些实施方式中，抗原呈递饲养细胞是人工抗原呈递饲养细胞。在一个实施方式中，第二次扩增中til与抗原呈递饲养细胞的比率为约1：25、约1：50、约1：100、约1：125、约1：150、约1：175、约1：200、约1：225、约1：250、约1：275、约1：300、约1：325、约1：350、约1：375、约1：400，或者约1：500。在一个实施方式中，第二次扩增中til与抗原呈递饲养细胞的比率为1：50至1：300。在一个实施方式中，第二次扩增中til与抗原呈递饲养细胞的比率为1：100至1：200。在一个实施方式中，本文所述的第二次扩增步骤需要约2.5×109个饲养细胞比约100×106个til的比率。在另一个实施方式中，本文所述的第二次扩增步骤需要约2.5×109个饲养细胞比约50×106个til的比率。在又一个实施方式中，本文所述的第二次扩增步骤需要约2.5×109个饲养细胞比约25×106个til。在一个实施方式中，本文所述的第二次扩增步骤在第二次扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施方式中，饲养细胞是从健康献血者的标准全血单位获得的外周血单核细胞(pbmc)。使用标准方法如ficoll-paque梯度分离获得pbmc。在一个实施方式中，使用人工抗原呈递(aapc)细胞代替pbmc。通常，同种异体pbmc通过辐照或者热处理被灭活，并用于本文所述的til扩增步骤，包括图4、图5和图27中所述的示例性步骤。在一个实施方式中，在第二次扩增中使用人工抗原呈递细胞替代pbmc或者与pbmc组合。2、细胞因子如本领域已知，本文所述的扩增方法通常使用含有高剂量细胞因子(特别是il-2)的培养基。或者，另外可以使用细胞因子的组合进行til的快速扩增和/或第二次扩增；其中，il-2、il-15和il-21中的两种以上的组合如国际公开号wo2015/189356和国际公开号wo2015/189357中概述的那样，其全部内容通过引用明确并入本文。因此，可能的组合包括il-2和il-15；il-2和il-21；il-15和il-21；以及il-2、il-15和il-21，发现后者在许多实施方式中特别有用。使用细胞因子的组合特别有利于淋巴细胞(特别是其中所述的t细胞)的产生。3、抗cd3抗体在一些实施方式中，本文所述的扩增方法(包括称为rep的那些，参见例如图27)中使用的培养基还包含抗cd3抗体。与il-2组合的抗cd3抗体诱导til群的t细胞活化和细胞分裂。用全长抗体以及fab和f(ab′)2片段可以看到此种效果，前者通常是优选的；例如参见tsoukas等，j.immunol.，1985，135，1719，其全部内容通过引用并入本文。如本领域技术人员将理解，有许多可用于本发明的合适的抗人cd3抗体，包括来自各种哺乳动物的抗人cd3多克隆和单克隆抗体，包括但不限于鼠、人类、灵长类动物、大鼠和犬抗体。在具体实施方式中，使用okt3抗cd3抗体(可从ortho-mcneil，拉里坦，新泽西州或miltenyibiotech，奥本，加利福尼亚州商购)。e、步骤e：收获til在第二次扩增步骤后，可以收获细胞。在一些实施方式中，例如，在如图27中所提供的一个、两个、三个、四个或者更多个扩增步骤之后收获til。在一些实施方式中，例如，在如图27中所提供的两个扩增步骤之后收获til。可以以任何适当和无菌的方式收获til，包括例如通过离心。收获til的方法是本领域熟知的，并且任何这样的已知方法可与本发明方法一起使用。在一些实施方式中，使用自动化系统收获til。细胞收集器和/或细胞处理系统可从多种来源商购获得，包括例如freseniuskabi、tomteclifescience、perkinelmer和inotechbiosystemsinternational,inc.。任何基于细胞的收集器均可用于本方法。在一些实施方式中，细胞收集器和/或细胞处理系统是基于膜的细胞收集器。在一些实施方式中，细胞收集是通过细胞处理系统，例如lovo系统(由freseniuskabi制造)。术语“lovo细胞处理系统”还指任何供应商制造的可在无菌和/或封闭系统环境中将包含细胞的溶液泵送通过膜或者过滤器(例如旋转膜或者旋转过滤器)的任何仪器或者设备，其允许连续流动和细胞处理以除去上清液或不含沉淀的细胞培养基。在一些实施方式中，细胞收集器和/或细胞处理系统可以在封闭的无菌系统中进行细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其他细胞处理步骤。在一些实施方式中，收获(例如根据图27的步骤e)是在封闭系统生物反应器中进行的。在一些实施方式中，如本文所述，采用封闭系统进行til扩增。在一些实施方式中，采用单个生物反应器。在一些实施方式中，例如，采用的单个生物反应器是g-rex-10或者g-rex-100。在一些实施方式中，封闭系统生物反应器是单个生物反应器。在一些实施方式中，根据实施例30中所述过程进行图27的步骤e。在一些实施方式中，通过注射器在无菌条件下进入封闭系统，以保持系统的封闭性和无菌性。在一些实施方式中，采用如实施例30所述的封闭系统。在一些实施方式中，根据实施例30中所述的方法收获til。在一些实施方式中，使用第8.5节中所述的方法收获第1天至第11天的til(在实施例30中称为第11天til收获)。在一些实施方式中，使用第8.12节中所述的方法收获第12天至第22天的til(在实施例30中称为第22天til收获)。f、步骤f：最终制剂/转移至输液袋在如图27中以示例性顺序提供的步骤a至e之后以及如上文和此处详述的概述完成后，将细胞转移至容器以用于对患者给药。在一些实施方式中，一旦使用上述扩增方法获得治疗足够数量的til，将它们转移至容器以用于对患者给药。在一个实施方式中，将使用本公开的apc扩增的til作为药物组合物施用于患者。在一个实施方式中，药物组合物是til在无菌缓冲液中的悬液。使用本公开的pbmc扩增的til可通过本领域已知的任何合适的途径施用。在一个实施方式中，t细胞以单次动脉内或静脉内输注，输注优选持续约30至60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内。1、药物组合物、剂量和施用方案在一个实施方式中，将使用本公开方法扩增的til作为药物组合物施用于患者。在一个实施方式中，药物组合物是til在无菌缓冲液中的悬液。使用本公开的pbmc扩增的til可通过本领域已知的任何合适途径施用。在一些实施方式中，t细胞以单次动脉内或静脉内输注施用，输注优选持续约30至60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。可以施用任何合适剂量的til。在一些实施方式中，特别是当癌是黑色素瘤时，施用约2.3×1010至约13.7×1010个til，平均约7.8×1010个til。在一个实施方式中，施用约1.2×1010至约4.3×1010个til。在一些实施方式中，施用约3×1010至约12×1010个til。在一些实施方式中，施用约4×1010至约10×1010个til。在一些实施方式中，施用约5×1010至约8×1010个til。在一些实施方式中，施用约6×1010至约8×1010个til。在一些实施方式中，施用约7×1010至约8×1010个til。在一些实施方式中，治疗有效剂量为约2.3×1010至约13.7×1010。在一些实施方式中，特别是当癌是黑色素瘤时，治疗有效剂量为约7.8×1010个til。在一些实施方式中，治疗有效剂量为约1.2×1010至约4.3×1010个til。在一些实施方式中，治疗有效剂量为约3×1010至约12×1010个til。在一些实施方式中，治疗有效剂量为约4×1010至约10×1010个til。在一些实施方式中，治疗有效剂量为约5×1010至约8×1010个til。在一些实施方式中，治疗有效剂量为约6×1010至约8×1010个til。在一些实施方式中，治疗有效剂量为约7×1010至约8×1010个til。在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的til的数量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013，以及9×1013。在一个实施方式中，本发明的药物组合物中提供的til数量的范围为1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012，以及5×1012至1×1013。在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的til的浓度小于药物组合物的例如100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％，或0.0001％w/w、w/v或者v/v。在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的til的浓度大于药物组合物的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19.75％、19.50％、19.25％、19％、18.75％、18.50％、18.25％、18％、17.75％、17.50％、17.25％、17％、16.75％、16.50％、16.25％、16％、15.75％、15.50％、15.25％、15％、14.75％、14.50％、14.25％、14％、13.75％、13.50％、13.25％、13％、12.75％、12.50％、12.25％、12％、11.75％、11.50％、11.25％、11％、10.75％、10.50％、10.25％、10％、9.75％、9.50％、9.25％、9％、8.75％、8.50％、8.25％、8％、7.75％、7.50％、7.25％、7％、6.75％、6.50％、6.25％、6％、5.75％、5.50％、5.25％、5％、4.75％、4.50％、4.25％、4％、3.75％、3.50％、3.25％、3％、2.75％、2.50％、2.25％、2％、1.75％、1.50％、125％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％，或者0.0001％w/w、w/v或v/v。在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的til的浓度范围为药物组合物的约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％，或约1％至约10％w/w、w/v或者v/v。在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的til的浓度范围为药物组合物的约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、约0.1％至约0.9％w/w、w/v或者v/v。在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的til的量等于或小于10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g，或者0.0001g。在一些实施方式中，本发明的药物组合物中提供的til的量大于0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5g、3g、3.5g、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g，或者10g。本发明的药物组合物中提供的til在宽剂量范围内有效。精确的剂量取决于施用途径、施用化合物的形式、待治疗对象的性别和年龄、待治疗对象的体重，以及主治医师的偏好和经验。如果合适，也可以使用临床确定的til剂量。使用本文方法施用的药物组合物的量，例如til的剂量，将取决于所治疗的人或哺乳动物、病症或病症的严重程度、施用率、活性药物成分的配置和处方医生的自由裁量权。在一些实施方式中，til可以单剂量施用。此种施用可通过注射，例如静脉内注射。在一些实施方式中，til可以多剂量施用。剂量可以是每年一次、两次、三次、四次、五次、六次或超过六次。剂量可以是每月一次、每两周一次、每周一次或每2天一次。只要有必要，til的施用可以继续。在一些实施方式中，til的有效剂量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013，以及9×1013。在一些实施方式中，til的有效剂量的范围为1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012，以及5×1012至1×1013。在一些实施方式中，til的有效剂量的范围为约0.01mg/kg至约4.3mg/kg、约0.15mg/kg至约3.6mg/kg、约0.3mg/kg至约3.2mg/kg、约0.35mg/kg至约2.85mg/kg、约0.15mg/kg至约2.85mg/kg、约0.3mg至约2.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1.7mg/kg、约0.15mg/kg至约1.3mg/kg、约0.3mg/kg至约1.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1mg/kg、约0.55mg/kg至约0.85mg/kg、约0.65mg/kg至约0.8mg/kg、约0.7mg/kg至约0.75mg/kg、约0.7mg/kg至约2.15mg/kg、约0.85mg/kg至约2mg/kg、约1mg/kg至约1.85mg/kg、约1.15mg/kg至约1.7mg/kg、约1.3mg/kg至约1.6mg/kg、约1.35mg/kg至约1.5mg/kg、约2.15mg/kg至约3.6mg/kg、约2.3mg/kg至约3.4mg/kg、约2.4mg/kg至约3.3mg/kg、约2.6mg/kg至约3.15mg/kg、约2.7mg/kg至约3mg/kg、约2.8mg/kg至约3mg/kg，或者约2.85mg/kg至约2.95mg/kg。在一些实施方式中，til的有效剂量的范围为约1mg至约500mg、约10mg至约300mg、约20mg至约250mg、约25mg至约200mg、约1mg至约50mg、约5mg至约45mg、约10mg至约40mg、约15mg至约35mg、约20mg至约30mg、约23mg至约28mg、约50mg约150mg、约60mg至约140mg、约70mg至约130mg、约80mg至约120mg、约90mg至约110mg、约95mg至约105mg、约98mg至约102mg、约150mg至约250mg、约160mg至约240mg、约170mg至约230mg、约180mg至约220mg、约190mg至约210mg、约195mg至约205mg，或者约198至约207mg。有效量的til可通过具有类似用途的药剂的任何可接受的施用方式以单剂量或多剂量施用，包括鼻内和透皮途径，通过动脉内注射、静脉内、腹膜内、肠胃外、肌内、皮下、局部，通过移植或者通过吸入。g、可选的细胞活力分析可选地，可以使用本领域已知的标准检测法在步骤b第一次扩增后进行细胞活力检测。例如，可以对大量til的样品进行台盼蓝拒染检测，其选择性地标记死细胞并允许活力评估。用于测试活力的其他检测可包括但不限于阿尔玛蓝测定法(alamarblueassay)以及mtt检测。1、细胞计数、活力、流式细胞术在一些实施方式中，进行细胞计数和/或测量活力。可以使用facscantotm流式细胞仪(bdbiosciences)，用抗体(例如但不限于可从bdbio-sciences(bdbiosciences,加利福尼亚圣何塞)商购的那些)通过流式细胞术来测量标志物(例如但不限于cd3、cd4、cd8和cd56)以及本文公开或描述的任何其他标志物的表达。可以使用一次性c-芯片血细胞计数器(vwr，巴达维亚，伊利诺伊州)手动计数细胞，并且可以使用本领域已知的任何方法评估活力，包括但不限于台盼蓝染色。在一些实施方式中，分析til的cd3+细胞群百分比。在一些实施方式中，分析用于治疗的til的cd3+细胞群百分比。在一些实施方式中，til是cd3+/cd45+til。在一些实施方式中，cd3+百分比为约70％至约99.9％。在一些实施方式中，cd3+百分比为约74％至约99.9％。在一些实施方式中，cd3+百分比为约74％至约99.9％。在一些实施方式中，cd3+百分比为约74％至约97.1％。在一些实施方式中，cd3+百分比为约80％至约99.9％。在一些实施方式中，cd3+百分比为约85％至约99.9％。在一些实施方式中，cd3+百分比为约90％至约99.9％。在一些实施方式中，cd3+百分比为约85％至约95％。在一些实施方式中，cd3+百分比为约80％至约95％。在一些实施方式中，cd3+百分比为约95％至约99.9％。在一些实施方式中，cd3+/cd45+百分比为约70％至约99.9％。在一些实施方式中，cd3+/cd45+百分比为约74％至约99.9％。在一些实施方式中，cd3+/cd45+百分比为约74％至约99.9％。在一些实施方式中，cd3+/cd45+百分比为约74％至约97.1％。在一些实施方式中，cd3+/cd45+百分比为约80％至约99.9％。在一些实施方式中，cd3+/cd45+百分比为约85％至约99.9％。在一些实施方式中，cd3+/cd45+百分比为约90％至约99.9％。在一些实施方式中，cd3+/cd45+百分比为约85％至约95％。在一些实施方式中，cd3+/cd45+百分比为约80％至约95％。在一些实施方式中，cd3+/cd45+百分比为约95％至约99.9％。在一些情况下，可以使用下文讨论的方案立即冷冻保存大量til群。或者，可以对大量til群进行rep，然后如下所述进行冷冻保存。类似地，在经基因修饰的til将会用于治疗的情况下，可以对大量til群或reptil群进行基因修饰以用于合适的治疗。2、细胞培养在一个实施方式中，用于扩增til的方法可包括使用约5,000ml至约25,000ml的细胞培养基，约5,000ml至约10,000ml的细胞培养基，或约5,800ml至约8,700ml的细胞培养基。在一个实施方式中，使用不超过一种类型的细胞培养基来扩增til的数量。可以使用任何合适的细胞培养基，例如aim-v细胞培养基(l-谷氨酰胺、50μm硫酸链霉素和10μm硫酸庆大霉素)细胞培养基(invitrogen,carlsbadca)。在这方面，本发明的方法有利地减少了扩增til数量所需的培养基的量和培养基的种类数量。在一个实施方式中，扩增til的数量可以包括以不超过每三天一次或每四天一次的频率将新鲜细胞培养基添加到细胞(也称为喂养细胞)。用透气性容器扩增细胞数量通过降低扩增细胞所需的饲养频率，简化了扩增细胞数量所需的步骤。在一个实施方式中，第一和/或第二透气性容器中的细胞培养基未经过滤。使用未过滤的细胞培养基可以简化扩增细胞数量所需的步骤。在一个实施方式中，第一和/或第二透气性容器中的细胞培养基不含β-巯基乙醇(bme)。在一个实施方式中，该方法的持续时间包括从哺乳动物获得肿瘤组织样品；在含有细胞培养基的第一透气性容器中培养肿瘤组织样品；从肿瘤组织样品中获得til；在含有细胞培养基的第二透气性容器中，使用aapc扩增til的数量持续约14天至约42天(例如约28天)。在一个实施方式中，在透气性容器中扩增til。使用本领域已知的方法、组分和装置，包括在美国专利申请公开号us2005/0106717a1所述的那些(其公开内容通过引用并入本文)，使用透气性容器，用pbmc来扩增til。在一个实施方式中，til在透气袋中扩增。在一个实施方式中，使用细胞扩增系统扩增til，该细胞扩增系统在透气袋中扩增til，例如xuri细胞扩增系统w25(xuricellexpansionsystemw25)(gehealthcare)。在一个实施方式中，使用细胞扩增系统扩增til，该细胞扩增系统在透气袋中扩增til，例如wave生物反应器系统，也称为xuri细胞扩增系统w5(gehealthcare)。在一个实施方式中，细胞扩增系统包括透气性细胞袋，其体积选自：约100ml、约200ml、约300ml、约400ml、约500ml、约600ml、约700ml、约800ml、约900ml、约1l、约2l、约3l、约4l、约5l、约6l、约7l、约8l、约9l和约10l。在一个实施方式中，可以在g-rex烧瓶(可从wilsonwolfmanufacturing商购)中扩增til。此类实施方式允许细胞群从约5×105个细胞/cm2扩增至10×106～30×106个细胞/cm2。在一个实施方式中，进行该扩增而不向细胞添加新鲜细胞培养基(也称为喂养细胞)。在一个实施方式中，只要培养基在g-rex烧瓶中位于约10cm的高度，就不进行喂养。在一个实施方式中，不进行喂养但是添加一种以上细胞因子。在一个实施方式中，细胞因子可以作为丸剂(bolus)添加而无需将细胞因子与培养基混合。此种容器、装置和方法在本领域中是已知的并且已经用于扩增til，并且包括在美国专利申请公开号us2014/0377739a1、国际公开号wo2014/210036a1、美国专利申请公开号us2013/0115617al、国际公开号wo2013/188427a1、美国专利申请公开号us2011/0136228a1、美国专利号8,809,050、国际公开号wo2011/072088a2、美国专利申请公开号us2016/0208216a1、美国专利申请公开号us2012/0244133a1、国际公开号wo2012/129201a1、美国专利申请公开号us2013/0102075a1、美国专利号8,956,860、国际公开号wo2013/173835a1和美国专利申请公开号us2015/0175966al所述的那些，其公开内容通过引用并入本文。这些方法也描述于jin等，j.immunotherapy2012，35，283-292，其其公开内容通过引用并入本文。可选的til的基因工程化在一些实施方式中，可选地对til进行基因工程改造以包括另外的功能，包括但不限于高亲和力t细胞受体(tcr)，例如靶向肿瘤相关抗原(例如mage-1、her2或者ny-eso-1)的tcr，或者与肿瘤相关细胞表面分子(例如间皮素)或者谱系限制性细胞表面分子(lineage-restrictedcellsurfacemolecule)(例如cd19)结合的嵌合抗原受体(car)。h、可选的til的冷冻保存如上所述和在图27中提供的步骤a至e中所举例说明的，冷冻保存可发生在整个til扩增过程中的许多节点。在一些实施方式中，可以冷冻保存第二次扩增后的扩增的til群(例如，如根据图27的步骤d提供的)。通常可通过将til群置于冷冻溶液(例如85％补体灭活的ab血清和15％二甲基亚砜(dmso))中来实现冷冻保存。将溶液中的细胞置于冻存管中并在-80℃下储存24小时，可选地转移至气态氮冷冻机中进行冷冻保存。参见sadeghi等，actaoncologica2013,52,978-986。在一些实施方式中，til在5％dmso中冷冻保存。在一些实施方式中，til在细胞培养基加5％dmso中冷冻保存。在一些实施方式中，根据实施例8和9中提供的方法冷冻保存til。适当时，将细胞从冰箱中取出并在37℃水浴中解冻至约4/5的溶液被解冻。通常将细胞重悬于完全培养基中并可选洗涤一次以上。在一些实施方式中，可以如本领域已知地对解冻的til进行计数并评估活力。i、扩增的til的表型特征在一些实施方式中，分析til在扩增后多种表型标志物的表达，包括本文和实施例中描述的那些。在一个实施方式中，研究一种以上表型标志物的表达。在一些实施方式中，在步骤b中的第一次扩增后，分析til的表型特征。在一些实施方式中，在步骤c的转变期间，分析til的表型特征。在一些实施方式中，在根据步骤c的转变期间和冷冻保存后，分析til的表型特征。在一些实施方式中，在根据步骤d的第二次扩增后，分析til的表型特征。在一些实施方式中，在根据步骤d的两次以上扩增后，分析til的表型特征。在一些实施方式中，标志物选自tcrab(即tcrα/β)、cd57、cd28、cd4、cd27、cd56、cd8a、cd45ra、cd8a、ccr7、cd4、cd3、cd38和hla-dr。在一些实施方式中，标志物选自tcrab(即tcrα/β)、cd57、cd28、cd4、cd27、cd56和cd8a。在一个实施方式中，标志物选自cd45ra、cd8a、ccr7、cd4、cd3、cd38和hla-dr。在一些实施方式中，研究一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种或十四种标志物的表达。在一些实施方式中，研究来自每组的一种以上标志物的表达。在一些实施方式中，与解冻的til相比，新鲜的til维持了hla-dr、cd38和cd69表达中的一种以上(即，未显示统计学上显著的差异)。在一些实施方式中，在解冻的til中维持了til的活化状态。在一个实施方式中，测量一种以上调节性标志物的表达。在一些实施方式中，调节性标志物选自cd137、cd8a、lag3、cd4、cd3、pd-1、tim-3、cd69、cd8a、tigit、cd4、cd3、klrg1和cd154。在一些实施方式中，调节性标志物选自cd137、cd8a、lag3、cd4、cd3、pd-1和tim-3。在一些实施方式中，调节性标志物选自cd69、cd8a、tigit、cd4、cd3、klrg1和cd154。在一些实施方式中，与新鲜til相比，解冻的til中调节性分子的表达降低。在一些实施方式中，与新鲜til相比，解冻的til中调节性分子lag-3和tim-3的表达降低。在一些实施方式中，cd4、cd8、nk、tcrαβ的表达无显著差异。在一些实施方式中，与解冻的til相比，新鲜til中cd4、cd8、nk、tcrαβ的表达和/或记忆标志物无显著差异。在一些实施方式中，通过本文提供的方法产生的til(例如图27中举例说明)和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(例如，除了图27中包含的那些方法之外的方法)制备的til在cd4、cd8、nk、tcrαβ表达上无显著差异。在一些实施方式中，在任何步骤(包括上文讨论的步骤或者例如如图27中所提供的步骤)中，不进行基于cd4、cd8和/或nk、tcrαβ表达的第一til群、第二til群、第三til群、收获的til群和/或治疗性til群的选择。在一些实施方式中，不进行基于cd4、cd8和/或nk、tcrαβ的第一til群的选择。在一些实施方式中，不进行基于cd4、cd8和/或nk、tcrαβ表达的第二til群的选择。在一些实施方式中，不进行基于cd4、cd8和/或nk、tcrαβ表达的第三til群的选择。在一些实施方式中，不进行基于cd4、cd8和/或nk、tcrαβ表达的收获的til群的选择。在一些实施方式中，不进行基于cd4、cd8和/或nk、tcrαβ表达的治疗性til群的选择。在一个实施方式中，在将肿瘤浸润淋巴细胞(til)扩增为治疗性til群的方法的步骤(a)至步骤(f)的任何步骤中，不进行基于cd4、cd8和/或nk、tcr-αβ表达的第一til群、第二til群、第三til群或收获的til群的选择，该方法包括以下步骤：(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，从患者切除的肿瘤中获得第一til群；(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；(c)通过在包含il-2的细胞培养基中培养第一til群来进行第一次扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)通过向第二til群的细胞培养基中补充另外的il-2、okt-3和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；其中，第三til群是治疗性til群，相对于第二til群，该治疗性til群包含增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)收获从步骤(d)获得的治疗性til群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(f)将从步骤(e)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生。在一个实施方式中，在治疗患有癌症的受试者的方法的步骤(a)至步骤(h)的任何步骤中，不进行基于cd4、cd8和/或nk、tcr-αβ表达的第一til群、第二til群、第三til群或收获的til群的选择，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(til)，包括以下步骤：(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，从患者切除的肿瘤中获得第一til群；(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；(c)通过在包含il-2的细胞培养基中培养第一til群来进行第一次扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)通过向第二til群的细胞培养基中补充另外的il-2、okt-3和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；其中，第三til群是治疗性til群，相对于第二til群，该治疗性til群包含增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)收获从步骤(d)获得的治疗性til群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(f)将从步骤(e)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；(g)可选地，使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的til群的输液袋；以及(h)给患者施用治疗有效剂量的第三til群，该第三til群来自步骤(g)的输液袋。在一些实施方式中，记忆标志物选自ccr7和cd62l。在一些实施方式中，与解冻的til相比，新鲜的til的活力为至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或者至少98％。在一些实施方式中，新鲜的til和解冻的til的活力均大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或者大于98％。在一些实施方式中，新鲜和解冻产物的活力均大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％或者大于90％。在一些实施方式中，新鲜和解冻产物的活力均大于86％。在一个实施方式中，还可以使用细胞因子释放检测方法，来评估再刺激的til的细胞因子释放。在一些实施方式中，可评估til响应于okt3刺激或与自体肿瘤消化液共培养的干扰素-7(ifn-7)分泌。例如在采用okt3刺激的实施方式中，彻底洗涤til，在预先涂有磷酸盐缓冲盐水稀释的0.1或1.0μg/mlokt3的96孔平底板中，用0.2mlcm中的1×105个细胞制备重复(duplicate)的孔。孵育过夜后，收获上清液，通过elisa(ppierce/endogen，沃本，马萨诸塞州)测量上清液中的ifn-7。对于共培养实验，将1×105个til细胞置于含有自体肿瘤细胞(1：1比率)的96孔板中。孵育24小时后，收获上清液，例如可通过elisa定量检测ifn-7的释放。细胞表面生物标志物的流式细胞术分析：将til样品等分用于细胞表面标志物的流式细胞术分析，参见实施例7、8和9。在一些实施方式中，评估til的各种调节性标志物。在一些实施方式中，调节性标志物选自tcrα/β、cd56、cd27、cd28、cd57、cd45ra、cd45ro、cd25、cd127、cd95、il-2r、ccr7、cd62l、klrg1和cd122组成的组。在一些实施方式中，调节性标志物是tcrα/β。在一些实施方式中，调节性标志物是cd56。在一些实施方式中，调节性标志物是cd27。在一些实施方式中，调节性标志物是cd28。在一些实施方式中，调节性标志物是cd57。在一些实施方式中，调节性标志物是cd45ra。在一些实施方式中，调节性标志物是cd45ro。在一些实施方式中，调节性标志物是cd25。在一些实施方式中，调节性标志物是cd127。在一些实施方式中，调节性标志物是cd95。在一些实施方式中，调节性标志物是il-2r。在一些实施方式中，调节性标志物是ccr7。在一些实施方式中，调节性标志物是cd62l。在一些实施方式中，调节性标志物是klrg1。在一些实施方式中，调节性标志物是cd122。在一个实施方式中，分析扩增的til的多种表型标志物的表达，包括本文和实施例中所述的那些。在一个实施方式中，研究一种以上表型标志物的表达。在一些实施方式中，标志物选自tcrab(即tcrα/β)、cd57、cd28、cd4、cd27、cd56、cd8a、cd45ra、cd8a、ccr7、cd4、cd3、cd38和hla-dr。在一些实施方式中，标志物选自tcrab(即tcrα/β)、cd57、cd28、cd4、cd27、cd56和cd8a。在一个实施方式中，标志物选自cd45ra、cd8a、ccr7、cd4、cd3、cd38和hla-dr。在一些实施方式中，研究一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种或十四种标志物的表达。在一些实施方式中，研究来自每组的一种以上标志物的表达。在一些实施方式中，与解冻的til相比，新鲜的til维持了hla-dr、cd38和cd69表达中的一种以上(即，未显示统计学上显著的差异)。在一些实施方式中，在解冻的til中维持了til的活化状态。在一个实施方式中，测量一种以上调节性标志物的表达。在一些实施方式中，调节性标志物选自cd137、cd8a、lag3、cd4、cd3、pd-1、tim-3、cd69、cd8a、tigit、cd4、cd3、klrg1和cd154。在一些实施方式中，调节性标志物选自cd137、cd8a、lag3、cd4、cd3、pd-1和tim-3。在一些实施方式中，调节性标志物选自cd69、cd8a、tigit、cd4、cd3、klrg1和cd154。在一些实施方式中，与新鲜til相比，解冻的til中调节性分子的表达降低。在一些实施方式中，与新鲜til相比，解冻的til中调节性分子lag-3和tim-3的表达降低。在一些实施方式中，cd4、cd8、nk、tcrαβ的表达无显著差异。在一些实施方式中，与解冻的til相比，新鲜til中cd4、cd8、nk、tcrαβ的表达和/或记忆标志物无显著差异。在一些实施方式中，记忆标志物选自ccr7和cd62l。在一些实施方式中，与解冻的til相比，新鲜的til的活力为至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或者至少98％。在一些实施方式中，新鲜的和解冻的til的活力均大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或者大于98％。在一些实施方式中，新鲜和解冻产物的活力均大于80％、大于81％、大于82％、大于83％、大于84％、大于85％、大于86％、大于87％、大于88％、大于89％或者大于90％。在一些实施方式中，新鲜和解冻产物的活力均大于86％。在一个实施方式中，还可以使用细胞因子释放测定，来评估再刺激的til的细胞因子释放。在一些实施方式中，可以评估til响应于okt3刺激或者与自体肿瘤消化液共培养的干扰素7(ifn-7)分泌。例如，在采用okt3刺激的实施方式中，彻底洗涤til，在预先涂有磷酸盐缓冲液稀释的0.1或1.0μg/mlokt3预涂的96孔平底板中，用0.2mlcm中的1×105个细胞制备重复的孔。孵育过夜后，收获上清液，通过elisa(pierce/endogen，沃本，马萨诸塞州)检测上清液中的ifn-7。对于共培养测定，将1×105个til细胞置于含有自体肿瘤细胞的96孔板中(比率为1：1)。孵育24小时后，收集上清液，例如可通过elisa定量ifn-7的释放。在一些实施方式中，在冷冻保存后研究表型表征。j、扩增的til的代谢健康与新鲜收获的til和/或解冻后的til相比，再刺激的til的特征在于基础糖酵解的显著增强。在一个实施方式中，在任何步骤(包括上文讨论的步骤或者例如如图27中所提供的步骤)中，不进行基于cd8表达的第一til群、第二til群、第三til群、收获的til群和/或治疗性til群的选择。在一些实施方式中，不进行基于cd8表达的第一til群的选择。在一些实施方式中，不进行基于cd8表达的第二til群的选择。在一些实施方式中，不进行基于cd8表达的第三til群的选择。在一些实施方式中，不进行基于cd8表达的收获的til群的选择。在一些实施方式中，不进行基于cd8表达的治疗性til群的选择。在一个实施方式中，在将肿瘤浸润淋巴细胞(til)扩增为治疗性til群的方法的步骤(a)至步骤(f)的任何步骤中，不进行基于cd8表达的第一til群、第二til群、第三til群或收获的til群的选择，该方法包括以下步骤：(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，从患者切除的肿瘤中获得第一til群；(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；(c)通过在包含il-2的细胞培养基中培养第一til群来进行第一次扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)通过向第二til群的细胞培养基中补充另外的il-2、okt-3和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；其中，第三til群是治疗性til群，相对于第二til群，该治疗性til群包含增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)收获从步骤(d)获得的治疗性til群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(f)将从步骤(e)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生。在一个实施方式中，在治疗患有癌症的受试者的方法的步骤(a)至步骤(h)的任何步骤中，不进行基于cd8表达的第一til群、第二til群、第三til群或收获的til群的选择，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(til)，包括以下步骤：(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，从患者切除的肿瘤中获得第一til群；(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；(c)通过在包含il-2的细胞培养基中培养第一til群来进行第一次扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)通过向第二til群的细胞培养基中补充另外的il-2、okt-3和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；其中，第三til群是治疗性til群，相对于第二til群，该治疗性til群包含增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)收获从步骤(d)获得的治疗性til群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(f)将从步骤(e)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；(g)可选地，使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的til群的输液袋；以及(h)给患者施用治疗有效剂量的第三til群，该第三til群来自步骤(g)的输液袋。例如，与新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til相比，通过本文所述的方法制备的til的特征在于显著增强的基础糖酵解。在一个实施方式中，在任何步骤(包括上文讨论的步骤或者例如如图27中所提供的步骤)中，不进行基于cd8表达的第一til群、第二til群、第三til群、收获的til群和/或治疗性til群的选择。在一些实施方式中，不进行基于cd8表达的第一til群的选择。在一些实施方式中，不进行基于cd8表达的第二til群的选择。在一些实施方式中，不进行基于cd8表达的第三til群的选择。在一些实施方式中，不进行基于cd8表达的收获的til群的选择。在一些实施方式中，不进行基于cd8表达的治疗性til群的选择。在一个实施方式中，在步骤(a)至步骤(h)中的任何步骤中，不进行基于cd8表达的第一til群、第二til群、第三til群或者收获的til群的选择。可以评估用本公开的不同方法扩增的til的备用呼吸能力(src)和糖酵解储备。seahorsexf细胞线粒体压力测试通过使用靶向线粒体中电子传递链组分的呼吸调节剂直接测量细胞的耗氧率(ocr)来测量线粒体功能。连续注射测试化合物(寡霉素、fccp以及鱼藤酮和抗霉素a的混合物，如下所述)以分别测量atp产生、最大呼吸和非线粒体呼吸。然后使用这些参数和基础呼吸来计算质子泄漏和备用呼吸能力。每种调节剂靶向电子传递链的一种特定组分。寡霉素抑制atp合成酶(复合物v)，并且注射寡霉素后ocr的减少与细胞atp产生相关的线粒体呼吸相关。碳酰氰-4(三氟甲氧基)苯腙(fccp)是一种解偶联剂，可破坏质子梯度并破坏线粒体膜电位。结果是，电子流过电子传输链不受抑制，并且氧最大程度地被复合物iv所消耗。然后，fccp刺激的ocr可用于计算备用呼吸容量，其被定义为最大呼吸和基础呼吸之间的差值。备用呼吸能力(src)是细胞响应增加的能量需求的能力的量度。第三次注射是鱼藤酮(一种复合物i抑制剂)和抗霉素a(一种复合物iii抑制剂)的混合物。此种组合可以关闭线粒体呼吸，并能够计算由线粒体外的过程驱动的非线粒体呼吸。在一些实施方式中，例如，比较是例如与新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til相比。在一些实施方式中，代谢检测是基础呼吸。通常，第二次扩增til的基础呼吸速率是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或者至少99％。在一些实施方式中，基础呼吸速率是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约50％至约99％。在一些实施方式中，基础呼吸速率是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约60％至约99％。在一些实施方式中，基础呼吸速率是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约70％至约99％。在一些实施方式中，基础呼吸速率是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约80％至约99％。在一些实施方式中，基础呼吸速率是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约90％至约99％。在一些实施方式中，基础呼吸速率是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约95％至约99％。在一些实施方式中，第二次扩增til或者另外的第二次扩增til(例如，如图27的步骤d中描述的那些，包括称为rereptil的til)的基础呼吸速率与新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率在统计学上无显著差异。在一些实施方式中，例如，比较是与新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til相比。在一些实施方式中，代谢检测是备用呼吸能力。通常，第二次扩增til或者另外的第二次扩增til(例如，图27的步骤d中所描述的那些，包括称为rereptil的til)的备用呼吸能力至少是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或者至少99％。在一些实施方式中，备用呼吸能力是新获得的til的基础呼吸速率的约50％至约99％。在一些实施方式中，备用呼吸能力是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约50％至约99％。在一些实施方式中，备用呼吸能力是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约60％至约99％。在一些实施方式中，备用呼吸能力是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约70％至约99％。在一些实施方式中，备用呼吸能力是新获得的til的基础呼吸速率的约80％至约99％。在一些实施方式中，备用呼吸能力是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约90％至约99％。在一些实施方式中，备用呼吸能力是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约95％至约99％。在一些实施方式中，第二次扩增til或者另外的第二次扩增til(例如，图27的步骤d中描述的那些，包括被称为rereptil的til)的备用呼吸能力与新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率在统计学无显著差异。通常，第二次扩增til或者另外的第二次扩增til(例如，图27的步骤d中所描述的那些，包括称为rereptil的til)的备用呼吸能力至少是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或者至少99％。在一些实施方式中，所测量的代谢检测是糖酵解储备。在一些实施方式中，代谢检测是备用呼吸能力。为了测量细胞(呼吸)代谢，用线粒体呼吸和糖酵解抑制剂处理细胞，以测定til的代谢图谱，由以下测量组成：基础氧化磷酸化(通过ocr测量)、备用呼吸能力、基础糖酵解活性(通过ecar测量)和糖酵解储备。使用seahorse线粒体/糖酵解综合压力测试(包括可从商购的试剂盒)，进行代谢图谱检测，该seahorse线粒体/糖酵解综合压力测试可以测定在阻断线粒体atp产生时细胞进行糖酵解的能力。在一些实施方式中，使细胞缺乏葡萄糖，然后注射葡萄糖，然后注射压力剂(stressagent)。在一些实施方式中，压力剂选自寡霉素、fccp、鱼藤酮、抗霉素a和/或2-脱氧葡萄糖(2-dg)组成的组，以及它们的组合。在一些实施方式中，以10mm加入寡霉素。在一些实施方式中，以10mm加入fccp。在一些实施方式中，以2.5mm加入鱼藤酮。在一些实施方式中，以2.5mm加入抗霉素a。在一些实施方式中，以500mm加入2-脱氧葡萄糖(2-dg)。在一些实施方式中，测量糖酵解能力、糖酵解储备和/或非糖酵解酸化。通常，til的糖酵解储备是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或者至少99％。在一些实施方式中，糖酵解储备是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约50％至约99％。在一些实施方式中，糖酵解储备是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约60％至约99％。在一些实施方式中，糖酵解储备是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约70％至约99％。在一些实施方式中，糖酵解储备是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约80％至约99％。在一些实施方式中，糖酵解储备是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约90％至约99％。在一些实施方式中，糖酵解储备是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约95％至约99％。在一些实施方式中，代谢检测是基础糖酵解。在一些实施方式中，与新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率相比，第二次扩增til或者另外的第二次扩增til(例如，图27的步骤d中所描述的那些，包括称为rereptil的til)的基础糖酵解增加至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍或至少10倍。在一些实施方式中，与新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率相比，第二次扩增til或者另外的第二次扩增til(例如，图27的步骤d中所描述的那些，包括称为rereptil的til)的基础糖酵解增加约2倍至约10倍。在一些实施方式中，与新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率相比，第二次扩增til或者另外的第二次扩增til(例如，图27的步骤d中所描述的那些，包括称为rereptil的til)的基础糖酵解增加约2倍至约8倍。在一些实施方式中，与新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率相比，第二次扩增til或者另外的第二次扩增til(例如，图27的步骤d中所描述的那些，包括称为rereptil的til)的基础糖酵解增加约3倍至约7倍。在一些实施方式中，与新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率相比，第二次扩增til或者另外的第二次扩增til(例如，图27的步骤d中所描述的那些，包括称为rereptil的til)的基础糖酵解增加约2倍至约4倍。在一些实施方式中，与新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率相比，第二次扩增til或者另外的第二次扩增til(例如，图27的步骤d中所描述的那些，包括称为rereptil的til)的基础糖酵解增加约2倍至约3倍。通常，第二次扩增til或者另外的第二次扩增til(例如，图27的步骤d中所描述的那些，包括称为rereptil的til)的糖酵解储备是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或者至少99％。在一些实施方式中，糖酵解储备是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约60％至约99％。在一些实施方式中，糖酵解储备是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约70％至约99％。在一些实施方式中，糖酵解储备是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约80％至约99％。在一些实施方式中，糖酵解储备是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约90％至约99％。在一些实施方式中，糖酵解储备是新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til的基础呼吸速率的约95％至约99％。颗粒酶b产生：颗粒酶b是til杀死靶细胞的能力的另一种量度。根据制造商的说明书，使用humangranzymebduosetelisakit(r&dsystems,明尼阿波利斯,明尼苏达州)，还对使用针对cd3、cd28和cd137/4-1bb的抗体如上所述进行再刺激的培养基上清液的颗粒酶b水平进行了评估。在一些实施方式中，第二次扩增til或另外的第二次扩增til(例如图27的步骤d中的那些，包括被称为rereptil的til)具有增加的颗粒酶b产生。在一些实施方式中，第二次扩增til或另外的第二次扩增til(例如图27的步骤d中的那些，包括被称为rereptil的til)具有增加的细胞毒性活性。在一些实施方式中，端粒长度可以用作细胞活力和/或细胞功能的量度。在一些实施方式中，与使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til相比，本发明产生的til的端粒长度出乎意料地相同。端粒长度测量：已经使用多种方法来测量基因组dna和细胞制剂中端粒的长度。端粒限制性片段(trf，telomererestrictionfragment)分析是测量端粒长度的黄金标准(delange等，1990年)。但是，trf的主要局限性在于需要大量dna(1.5^g)。本发明可以采用两种被广泛用于测量端粒长度的技术，即荧光原位杂交(fish；agilenttechnologies，santaclara，ca)和定量pcr。在一些实施方式中，如图27中所提供的，步骤a中最初收获的til和来自例如步骤d的扩增的til之间的端粒长度没有变化。在一些实施方式中，通过ifn-伽马(ifn-γ)分泌来检测til健康。在一些实施方式中，ifn-γ分泌指示活性til。在一些实施方式中，采用ifn-γ产生的效价测定(potencyassay)。ifn-γ产生是细胞毒性潜力的另一种量度。可通过测定用cd3、cd28和cd137/4-1bb抗体刺激的til培养基中细胞因子ifn-γ的水平，来检测ifn-γ产生。可通过检测ifn-γ释放来确定这些经刺激的til的培养基中的ifn-γ水平。在一些实施方式中，与图27中提供的例如步骤a中的最初收获的til相比，图27中提供的例如步骤d中的ifn-γ产生增加，表明步骤dtil的细胞毒性潜力增加。在一些实施方式中，ifn-γ分泌增加了1倍、2倍、3倍、4倍或者5倍或者更多倍。在一些实施方式中，ifn-γ分泌增加了1倍。在一些实施方式中，ifn-γ分泌增加了2倍。在一些实施方式中，ifn-γ分泌增加了3倍。在一些实施方式中，ifn-γ分泌增加了4倍。在一些实施方式中，ifn-γ分泌增加了5倍。在一些实施方式中，使用quantikineelisa试剂盒检测ifn-γ。在一些实施方式中，检测离体til中的ifn-γ。在一些实施方式中，检测离体til中的ifn-γ，包括通过本发明的方法(包括例如图27的方法)产生的til，以及新鲜收获的til或者通过其他方法产生的那些til，例如如图83中所提供的那些til(例如过程1ctil)。在一些实施方式中，根据用于til测定的生物发光重定向裂解测定(效价测定，其以高度敏感的剂量依赖性方式检测til的细胞毒性)，使用til与生物发光细胞系p815(克隆g6)的共培养实验，来评估til裂解靶细胞的细胞毒性潜力。在一些实施方式中，本发明的方法提供了使用如上所述的方法评估til活力的检测。在一些实施方式中，如上所述(包括例如如图27)扩增til。在一些实施方式中，在评估活力之前对til进行冷冻保存。在一些实施方式中，活力评估包括在进行第一次扩增、第二次扩增和另外的第二次扩增之前，解冻til。在一些实施方式中，本方法提供用于评估细胞增殖、细胞毒性、细胞死亡和/或与til群的活力相关的其他方面的检测。活力可通过上述任何til代谢检测法以及本领域已知的任何已知用于评估细胞活力的方法来测量。在一些实施方式中，本发明方法提供用于评估细胞增殖、细胞毒性、细胞死亡和/或与使用本文所述方法(包括图27中举例说明的那些)扩增的til活力相关的其他方面的检测。本发明还提供了检测til活力的测定方法。在一些实施方式中，与新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til相比，til具有相同的活力。在一些实施方式中，与新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til相比，til具有增加的活力。本公开提供了通过将肿瘤浸润淋巴细胞(til)扩增为更大的til群来检测til的活力的方法，该方法包括以下步骤：(i)获得预先扩增的第一til群；(ii)通过在包含il-2的细胞培养基中培养第一til群进行第一次扩增，产生第二til群；以及(iii)通过用另外的il-2、okt-3和抗原呈递细胞(apc)补充第二til群的细胞培养基进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第三til群的数量比第二til群高100倍；其中，第二次扩增进行至少14天，获得第三til群；其中，相对于第二til群，第三til群包含增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，进一步检测第三群的活力。在一些实施方式中，该方法还包括以下步骤：(iv)通过用另外的il-2、另外的okt-3和另外的apc补充第三til群的细胞培养基进行另外的第二次扩增；其中，另外的第二次扩增进行至少14天，获得比步骤(iii)中所得更大的til群；其中，相对于第三til群，所述更大的til群包含增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，进一步检测第三群的活力。在一些实施方式中，在步骤(i)之前冷冻保存细胞。在一些实施方式中，在进行步骤(i)之前解冻细胞。在一些实施方式中，为了获得足够的til用于分析，重复步骤(iv)一至四次。在一些实施方式中，步骤(i)至(iii)或(iv)进行约40天至约50天。在一些实施方式中，步骤(i)至(iii)或(iv)进行约42天至约48天。在一些实施方式中，步骤(i)至(iii)或(iv)进行约42天至约45天。在一些实施方式中，步骤(i)至(iii)或(iv)进行约44天。在一些实施方式中，来自步骤(iii)或(iv)的细胞表达cd4、cd8和tcrαβ的水平与新鲜收获的细胞相似。在一些实施方式中，抗原呈递细胞是外周血单核细胞(pbmc)。在一些实施方式中，在步骤(iii)的第9天至第17天中的任何一天将pbmc添加至细胞培养基中。在一些实施方式中，相对于第三细胞群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，步骤(iv)中的更大的til群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出选自下组的一种以上特征：cd27表达、cd28表达、端粒更长、cd57表达增加和cd56表达降低。在一些实施方式中，效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出cd57表达增加和cd56表达降低。在一些实施方式中，apc是人工apc(aapc)。在一些实施方式中，该方法还包括用表达载体转导第一til群的步骤，所述表达载体包含编码高亲和力t细胞受体的核酸。在一些实施方式中，转导步骤发生在步骤(i)之前。在一些实施方式中，该方法还包括用表达载体转导第一til群的步骤，所述表达载体包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸，所述嵌合抗原受体包含与t细胞信号传导分子的至少一个内结构域融合的单链可变片段抗体。在一些实施方式中，转导步骤发生在步骤(i)之前。在一些实施方式中，检测til的活力。在一些实施方式中，在冷冻保存后检测til的活力。在一些实施方式中，在冷冻保存后和步骤(iv)后，检测til的活力。t和b淋巴细胞的多种抗原受体是通过有限但大量的基因片段的体细胞重组产生的。这些基因片段：v(可变区)、d(多变区)、j(结合区)和c(恒定区)，确定免疫球蛋白和t细胞受体(tcr)的结合特异性和下游应用。本发明提供了产生til的方法，其显示并增加t细胞谱系的多样性(有时称为多克隆性)。在一些实施方式中，t细胞谱系多样性的增加是与新鲜收获的til和/或使用除本文提供的方法之外的其他方法(包括例如除了图27中所示那些之外的方法)制备的til相比的。在一些实施方式中，通过本发明方法获得的til显示出t细胞谱系多样性的增加。在一些实施方式中，在第一次扩增中获得的til表现出t细胞谱系多样性的增加。在一些实施方式中，多样性的增加是免疫球蛋白多样性和/或t细胞受体多样性的增加。在一些实施方式中，多样性是免疫球蛋白多样性，是免疫球蛋白重链多样性。在一些实施方式中，多样性是免疫球蛋白多样性，是免疫球蛋白轻链多样性。在一些实施方式中，多样性是t细胞受体多样性。在一些实施方式中，多样性是选自α、β、γ和δ受体之一的t细胞受体的多样性。在一些实施方式中，t细胞受体(tcr)α和/或β的表达增加。在一些实施方式中，t细胞受体(tcr)α的表达增加。在一些实施方式中，t细胞受体(tcr)β的表达增加。在一些实施方式中，tcrab(即tcrα/β)的表达增加。根据本公开，提供了检测til的活力和/或进一步用于给受试者施用的方法。在一些实施方式中，检测肿瘤浸润淋巴细胞(til)的方法包括以下步骤：(i)获得第一til群；(ii)通过在包含il-2的细胞培养基中培养第一til群进行第一次扩增，产生第二til群；以及(iii)通过用另外的il-2、okt-3和抗原呈递细胞(apc)补充第二til群的细胞培养基进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第三til群的数量比第二til群的数量高至少50倍；(iv)收获、洗涤和冷冻保存第三til群；(v)将冷冻保存的til储存在低温下；(vi)解冻第三til群，提供解冻的第三til群；以及(vii)在至少3天的另外的扩增期(有时称为rerep期)，通过用il-2、okt-3和apc补充第三til群的细胞培养基，对解冻的第三til群的一部分进行另外的第二次扩增；其中，进行第三次扩增，获得第四til群；其中，将第四til群中的til数量与第三til群中的til数量进行比较，获得比率；(viii)基于步骤(vii)中的比率，确定解冻的til群是否适合施用于患者；(ix)当在步骤(viii)中确定第四til群中til数量与第三til群中til数量的比率大于5：1时，给患者施用治疗有效剂量的解冻的第三til群。在一些实施方式中，进行另外的扩增期(有时称为rerep期)，直至第四til群中til数量与第三til群中til数量的比率大于50：1。在一些实施方式中，足以达到治疗有效剂量的til的数量为约2.3×1010至约13.7×1010。在一些实施方式中，步骤(i)至(vii)进行约40天至约50天。在一些实施方式中，步骤(i)至(vii)进行约42天至约48天。在一些实施方式中，步骤(i)至(vii)进行约42天至约45天。在一些实施方式中，步骤(i)至(vii)进行约44天。在一些实施方式中，来自步骤(iii)或(vii)的细胞表达cd4、cd8和tcrαβ的水平与新鲜收获的细胞相似。在一些实施方式中，细胞是til。在一些实施方式中，抗原呈递细胞是外周血单核细胞(pbmc)。在一些实施方式中，在步骤(iii)的第9天至第17天中的任何一天将pbmc添加至细胞培养基中。在一些实施方式中，相对于第三细胞群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，步骤(iii)或(vii)中更大的til群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出选自下组的一种以上特征：cd27表达、cd28表达、端粒更长、cd57表达增加和cd56表达降低。在一些实施方式中，效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出cd57表达增加和cd56表达降低。在一些实施方式中，apc是人工apc(aapc)。在一些实施方式中，用表达载体转导第一til群的步骤，所述表达载体包含编码高亲和力t细胞受体的核酸。在一些实施方式中，转导步骤发生在步骤(i)之前。在一些实施方式中，用表达载体转导第一til群的步骤，所述表达载体包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸，所述嵌合抗原受体包含与t细胞信号传导分子的至少一个内结构域融合的单链可变片段抗体。在一些实施方式中，转导步骤发生在步骤(i)之前。在一些实施方式中，在步骤(vii)后检测til的活力。本公开还提供了用于检测til的其他方法。在一些实施方式中，本公开提供了检测til的方法，该方法包括以下步骤：(i)获得冷冻保存的第一til群的一部分；(ii)解冻冷冻保存的第一til群的所述部分；(iii)通过在包含il-2、okt-3和抗原呈递细胞(apc)的细胞培养基中培养第一til群的所述部分进行第一次扩增，以进行至少3天的另外的扩增期(有时称为rerep)，产生第二til群；其中，将来自第一til群的所述部分与第二til群进行比较，获得til数量的比率；其中，第二til群中til数量与第一til群的所述部分中til数量的比率大于5：1；(iv)基于步骤(iii)中的比率，确定第一til群是否适用于治疗性施用于患者；以及(v)当在步骤(iv)中确定第二til群中til数量与第一til群中til数量的比率大于5：1时，确定第一til群适用于治疗性施用。在一些实施方式中，第二til群中til数量与第一til群的所述部分中til数量的比率大于50：1。在一些实施方式中，该方法还包括根据如本文提供的任何实施方式中所述的方法，扩增来自步骤(i)的冷冻保存的全部第一til群。在一些实施方式中，该方法还包括将来自步骤(i)的冷冻保存的全部第一til群施用于患者。k、用于生产til的封闭系统本发明提供了til培养期间封闭系统的使用。此种封闭系统允许预防和/或减少微生物污染，允许使用更少的烧瓶，并允许降低成本。在一些实施方式中，封闭系统使用两个容器。此种封闭系统在本领域中是公知的，并且可以在例如http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm和https://www.fda.gov/biologicsbloodvaccines/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/blood/ucm076779.htm上找到。在一些实施方式中，封闭系统包括如实施例30中所述的鲁尔锁和热封系统。在一些实施方式中，在无菌条件下通过注射器进入封闭系统，以保持系统的无菌性和封闭性。在一些实施方式中，采用如实施例30所述的封闭系统。在一些实施方式中，根据实施例30第8.14节“最终制剂和填充”中所述方法，将til配制成最终产品制剂。如fda网站上所提供的，采用无菌方法的封闭系统是已知的，并且已得到充分描述。参见，https://www.fda.gov/biologicsbloodvaccines/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/blood/ucm076779.htm，如上文所述，在下文相关部分中提供。介绍无菌连接设备(stcd，sterileconnectingdevice)在两根兼容管之间产生无菌连接处。该步骤允许无菌连接各种容器和管径。本指南描述了使用这些设备的推荐操作和步骤。本指南未发布无菌连接设备制造商为了获得上市批准或许可必须提交给fda的数据或信息。同样重要的是要注意，根据美国联邦食品、药品和化妆品法(federalfood,drug和cosmeticact.)，将经批准或许可的无菌连接设备用于标签中未授权的目的，可能会导致该设备被视为混淆品和贴假商标。1、fda建议建议常规使用经fda许可的stcd的血液制品制造商应在各个血液制品的标准操作程序(sop，standardoperatingprocedure)手册中纳入有关此类使用的信息。这些条目应包括：记录保存、产品跟踪、管连接质量控制、软件批次和一次性用品(包括要添加的元素的来源)。质量控制程序应包括各个连接处的完整性的测试。2、stcd的应用用户应注意，使用该设备可能会产生新产品或者显著改变尚未证明安全性和有效性的受管制产品的配置。对于那些需要许可、申请或者补充申请的“新产品”，除提交给sop之外，还必须提交给fda。通常，涉及细胞成分的合并或者混合表示产品的改变，需要提交和批准许可证申请或者补充申请。此类申请和补充申请应包含证明“新产品”在建议的整个有效期(datingperiod)内其预期用途均安全有效的生产程序的数据和说明。提供以下评论，作为关于fda许可或者批准的stcd的更常见用途的指导：l、将新的或者更小的针添加到血液采集装置中不认为在开始操作(全血采集、血小板单采或者原料血浆采集)之前使用stcd添加针打开了功能性封闭的系统(functionallyclosedsystem)。如果在操作期间添加了针，则仅应使用经批准可连接(weld)液体填充管的stcd。如果连接完整性测试令人满意，则不认为stcd的使用打开了功能性封闭的系统。在开放系统中制备的单采血小板应标明24小时过期，以及在功能性封闭的系统中制备的单采血小板产品应标明5天过期(参见revisedguidelineforcollectionofplatelets,pheresis，1988年10月7日)。应在血液中心的sop和记录中说明添加的管和针的来源和规格。使用stcd添加针并不代表需要许可机构预先批准的生产中的重大变化。m、使用stcd准备组分当使用stcd连接另外的组分准备袋时，应妥善保存记录，以识别转运包的来源以及对血液单元编号和abo/rh的适当验证。所有血液和血液成分必须适当标记(21cfr606.121)。示例：·在全血采集三包(triple-pack)中增加第4个袋子，以从新鲜冷冻血浆生产冷冻沉淀的ahf。·将添加剂溶液连接至红血球单元。·添加经fda批准用于生产组分的在线过滤器。·将第三个储存容器加到血小板单采线束中。·对于上述用途，应制定程序并保持记录，但被许可方无需获得fda批准即可制定程序。1、使用stcd合并血液制品适当使用stcd合并由全血采集制备的血小板可以避免由加标和通常使用的端口进入所造成的潜在污染。在输血之前立即进行合并是此种适当使用的一个示例。合并的血小板应在合并后不超过4小时内施用(参见21cfr606.122(1)(2))。但是，与随机捐赠单元的施用相比，合并和后续储存可能会增加风险。在施用前，如果将一个受污染单元与其他单元合并并储存，则由于在额外体积中的复制，所施用的总体细菌培养液可能会增加。因此，建议使用stcd收集和储存血小板4小时以上应得到圆满解决了此种合并是否与增加的风险相关的数据的支持。此种血小板合并构成了新产品的生产。如果储存时间超过4个小时，则涉及血小板的合并或者混合被认为是需要提交和批准许可证申请或者补充申请的新产品的生产。2、使用stcd制备供儿科使用的等分试样(aliquot)和分装单位(dividedunit)在满足以下条件的前提下，使用stcd制备的全血、红细胞和新鲜冷冻血浆的儿科单位和分装单位，将不被视为需要补充生物许可证申请(bla，biologicslicenseapplication)的新产品：制造商应具有针对原始(即未分装)产品的批准的生物许可证或者补充许可证，包括所用每种抗凝剂的批准。标签应在分发前提交以进行审查和批准。应在fda表格2567的注释部分“标签和通函的传送(transmittaloflabels和circulars)”下注明。应使用经批准用于储存所制备组分的最终产品容器。经许可生产的血小板必须包含至少5.5×(10)10个血小板(21cfr640.24(c))。经许可生产的单采血小板应包含至少3.0×(10)11个血小板(参阅revisedguidelineforthecollectionofplatelets,pheresis，1988年10月7日)。关于使用stcd由全血收集物和血浆制备分装产品以及通过自动血液成分单采程序(automatedhemapheresisprocedure)制备血小板要遵循的程序，应包括以下内容的说明：·如何使用经fda许可的stcd改进采血线束或者收集容器；·分离血浆或者全血制品的最小体积；·分离的血小板单采产品的体积和血小板浓度；·产品的储存时间。产品应放在批准容器中，并应与该容器标签上的储存时间保持一致；·用于标记和追踪血液中心记录中的分装产品的方法。注：标记等分试样的程序应在程序记录中明确说明，应足以允许跟踪和召回所有组分(视需要)。3、在自动血液成分单采程序中，使用stcd连接另外的盐水或者抗凝剂管线应与仪器制造商的使用说明一致地制定程序并保持记录，但被许可方制定程序无需获得fda许可。4、使用stcd连接处理溶液当使用stcd将装有处理溶液的容器连接到经洗涤或者冷冻的红细胞制品时，所得制品的有效期为24小时，除非在cber许可证申请或者补充申请的表格中提供支持更长有效期的数据(21cfr610.53(c))。免除或者修改必须获得cber主任的书面批准(21cfr610.53(d))。5、使用stcd添加fda许可的去白细胞过滤器(leukocytereductionfilter)一些去白细胞过滤器未被整体连接至全血收集系统。将stcd用于储存前过滤的程序应与过滤器制造商的使用说明相一致。发布前的白细胞去除构成了主要的生产变化。因此，对于使用stcd制备的白细胞去除的新制品，制造商必须向fda提交生物许可证申请(21cfr601.2)或者补充事先批准申请(21cfr601.12)。使用stcd从血液制品容器中取出样品进行测试(例如，使用stcd从血小板或者单采血小板容器中提取血小板样品进行交叉匹配)。如果收回样品后产品的体积和/或细胞计数与原始标签或者信息通报中声称的不同，则应修改产品标签以反映新的体积和/或细胞计数。例如，可能无法去除样品，将每单位血小板的血小板计数减少至小于5.5×(10)10个血小板(21cfr640.24(c))。6、fda指南的其他信息fda指南提供了有关向fda提交解决stcd的使用的申请和补充申请的一般指南以及特定信息和示例。如果对合理使用stcd产生进一步的疑问，则应联系血液研究与审查办公室(officeofbloodresearch和review)、生物制品评估与研究中心(centerforbiologicsevaluation和research)。在一些实施方式中，从获得肿瘤碎片的时间开始直至til准备好施用于患者或者冷冻保存，封闭系统使用一个容器。在一些实施方式中，当使用两个容器时，第一容器是封闭g容器，并且在不打开第一封闭g容器的情况下将til群离心并转移至输液袋。在一些实施方式中，当使用两个容器时，输液袋是含有hypothermosol的输液袋。封闭系统或者封闭til细胞培养系统的特征在于，一旦添加了肿瘤样品和/或肿瘤碎片，系统就紧密密封与外界隔离，形成了一个不受细菌、真菌和/或任何其他微生物污染入侵的封闭环境。在一些实施方式中，微生物污染的减少为约5％至约100％。在一些实施方式中，微生物污染的减少为约5％至约95％。在一些实施方式中，微生物污染的减少为约5％至约90％。在一些实施方式中，微生物污染的减少为约10％至约90％。在一些实施方式中，微生物污染的减少为约15％至约85％。在一些实施方式中，微生物污染的减少为约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％或者约100％。封闭的系统允许在无微生物污染和/或微生物污染显著减少的情况下的til生长。此外，各个til细胞培养环境的ph、二氧化碳分压和氧气分压随着细胞的培养而变化。因此，即使循环了适用于细胞培养的培养基，封闭的环境仍然需要持续保持til增殖的最佳环境。为此，期望通过传感器来监测封闭环境的培养液中的物理因素(ph、二氧化碳分压和氧气分压)，其信号用于控制安装在培养环境入口处的气体交换器，根据培养液的变化实时调节封闭环境的气体分压，从而优化细胞培养环境。在一些实施方式中，本发明提供了封闭细胞培养系统，该系统包括在封闭环境入口处的配备有监测装置的气体交换器，该监测装置测量封闭环境的ph、二氧化碳分压和氧气分压，并根据来自监控设备的信号自动调整气体浓度来优化细胞培养环境。在一些实施方式中，连续或者间歇地控制封闭环境内的压力。即，例如可通过压力维持装置来改变封闭环境中的压力，从而确保该空间处于适用于til生长的正压状态，或者处于促进流体渗出的负压状态，从而促进细胞增殖。此外，通过间歇地施加负压，可通过封闭环境的体积的暂时收缩来均匀且有效地替换封闭环境中的循环液体。在一些实施方式中，可以更换或者添加用于til增殖的最佳培养组分，并且可以添加例如il-2和/或okt3的因子及其组合。c、细胞培养在一个实施方式中，扩增til的方法，包括上文讨论以及在图27中举例说明的那些，可以包括使用约5,000ml至约25,000ml的细胞培养基、约5,000ml至约10,000ml的细胞培养基或者约5,800ml至约8700ml的细胞培养基。在一些实施方式中，例如，如实施例21中所述，培养基是无血清培养基。在一些实施方式中，第一次扩增中的培养基是无血清的。在一些实施方式中，第二次扩增中的培养基是无血清的。在一些实施方式中，第一次扩增和第二次扩增中的培养基均是无血清的。在一个实施方式中，使用不超过一种类型的细胞培养基扩增til的数量。可以使用任何合适的细胞培养基，例如aim-v细胞培养基(l-谷氨酰胺、50μm硫酸链霉素和10μm硫酸庆大霉素)细胞培养基(invitrogen，carlsbadca)。在这方面，本发明的方法有利地减少了扩增til数量所需的培养基的量和培养基的种类数量。在一个实施方式中，扩增til的数量可以包括以不超过每三天一次或每四天一次的频率喂养细胞。在透气性容器中扩增细胞的数量通过降低扩增细胞所需的喂养频率，简化了扩增细胞数量所需的程序。在一个实施方式中，第一和/或第二透气性容器中的细胞培养基未经过滤。使用未过滤的细胞培养基可以简化扩增细胞数量所需步骤。在一个实施方式中，第一和/或第二透气性容器中的细胞培养基不含β-巯基乙醇(bme)。在一个实施方式中，该方法的持续时间包括：从哺乳动物获得肿瘤组织样品；在其中装有细胞培养基的第一透气性容器中培养肿瘤组织样品；从肿瘤组织样品中获得til；在装有细胞培养基的第二透气性容器中扩增til的数量持续约7天至14天，例如约11天。在一些实施方式中，pre-rep为约7天至14天，例如约11天。在一些实施方式中，rep为约7天至14天，例如约11天。在一个实施方式中，在透气性容器中扩增til。使用本领域已知的方法、组成和装置，包括在美国专利申请公开号us2005/0106717a1中描述的那些(其公开内容通过引用并入本文)，使用透气性容器，用pbmc来扩增til。在一个实施方式中，til在透气袋中扩增。在一个实施方式中，使用细胞扩增系统扩增til，所述细胞扩增系统在透气袋中扩增til，例如xuri细胞扩增系统w25(xuricellexpansionsystemw25)(gehealthcare)。在一个实施方式中，使用细胞扩增系统扩增til，所述细胞扩增系统在透气袋中扩增til，例如wave生物反应器系统，也称为xuri细胞扩增系统w5(gehealthcare)。在一个实施方式中，细胞扩增系统包括透气性细胞袋，其体积选自约100ml、约200ml、约300ml、约400ml、约500ml、约600ml、约700ml、约800ml、约900ml、约1l、约2l、约3l、约4l、约5l、约6l、约7l、约8l、约9l和约10l。在一个实施方式中，可以在g-rex烧瓶(可从wilsonwolfmanufacturing商购)中扩增til。此类实施方式允许细胞群从约5×105个细胞/cm2扩增为10×106～30×106个细胞/cm2。在一个实施方式中，无需喂养细胞。在一个实施方式中，只要培养基在g-rex烧瓶中位于约10cm的高度，就不进行喂养。在一个实施方式中，不进行喂养但是添加一种以上细胞因子。在一个实施方式中，细胞因子可以作为丸剂添加而无需将细胞因子与培养基混合。此种容器、装置和方法在本领域中是已知的并且已经用于扩增til，并且包括在美国专利申请公开号us2014/0377739a1、国际公开号wo2014/210036a1、美国专利申请公开号us2013/0115617al、国际公开号wo2013/188427a1、美国专利申请公开号us2011/0136228a1、美国专利号us8,809,050b2、国际公开号wo2011/072088a2、美国专利申请公开号us2016/0208216a1、美国专利申请公开号us2012/0244133a1、国际公开号wo2012/129201a1、美国专利申请公开号us2013/0102075a1，美国专利号us8,956,860b2、国际公开号wo2013/173835a1和美国专利申请公开号us2015/0175966a1中描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。这些方法也描述于jin等，j.immunotherapy2012,35,283-292。d、可选的til的基因工程在一些实施方式中，可选地对til进行基因工程改造以包括另外的功能，包括但不限于高亲和力t细胞受体(tcr)，例如靶向肿瘤相关抗原(例如mage-1、her2或者ny-eso-1)的tcr，或者与肿瘤相关细胞表面分子(例如间皮素)或者谱系限制性细胞表面分子(例如cd19)结合的嵌合抗原受体(car)。e、可选的til的冷冻保存可以可选地冷冻保存大量til群或者扩增til群。在一些实施方式中，冷冻保存发生在治疗性til群上。在一些实施方式中，对第二次扩增后获得的til进行冷冻保存。在一些实施方式中，在图27的示例性步骤f中，对til进行冷冻保存。在一些实施方式中，对til进行冷冻保存在输液袋中。在一些实施方式中，在放入输液袋中之前对til进行冷冻保存。在一些实施方式中，对til进行冷冻保存并且不放置在输液袋中。在一些实施方式中，使用冷冻保存培养基进行冷冻保存。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含二甲基亚砜(dmso)。这通常是通过将til群置于冷冻溶液中来完成，例如85％补体灭活的ab血清和15％二甲基亚砜(dmso)。将溶液中的细胞放入冻存管中，在-80℃下储存24小时，并可选地转移至气态氮气冷冻机以冷冻保存。参见sadeghi等，actaoncologica2013,52,978-986。适当时，将细胞从冰箱中取出，在37℃水浴中解冻，直至约4/5的溶液被解冻。通常将细胞重悬于完全培养基中，并可选地洗涤一次以上。在一些实施方式中，如本领域中已知的，可以对解冻的til进行计数并评估活力。在一个优选实施方式中，使用cs10冷冻保存培养基(cryostor10，biolifesolutions)对til群进行冷冻保存。在一个优选实施方式中，使用包含二甲基亚砜(dmso)的冷冻保存培养基对til群进行冷冻保存。在一个优选实施方式中，使用1：1(体积：体积)比率的cs10和细胞培养基对til群进行冷冻保存。在一个优选实施方式中，使用约1∶1(体积：体积)比率的cs10和细胞培养基(还包含另外的il-2)对til群进行冷冻保存。如以上在步骤a至e中所讨论的，冷冻保存可能发生在整个til扩增过程中的许多节点。在一些实施方式中，可以冷冻保存根据步骤b的第一次扩增后的大量til群或者根据步骤d的一个以上第二次扩增后的扩增的til群。冷冻保存通常可通过将til群放入冷冻溶液(例如85％补体灭活的ab血清和15％二甲亚砜(dmso))中完成。将溶液中的细胞放入冻存管中，在-80℃下储存24小时，并可选地转移至气态氮气冷冻机以冷冻保存。参见sadeghi等，actaoncologica2013,52,978-986。适当时，将细胞从冰箱中取出，在37℃水浴中解冻，直至约4/5的溶液被解冻。通常将细胞重悬于完全培养基中，并可选地洗涤一次以上。在一些实施方式中，如本领域中已知的，可以对解冻的til进行计数并评估活力。在一些情况下，可以使用下文讨论的方案立即对步骤b的til群进行冷冻保存。或者，可以对大量til群进行步骤c和d，然后在步骤d之后进行冷冻保存。类似地，在将基因修饰的til用于治疗的情况下，可以对步骤b或者步骤d的til群进行基因修饰以用于适当的治疗。f、可选的细胞活力分析可选地，可以使用本领域已知的标准检测法，在第一次扩增(有时称为初始大量扩增)之后进行细胞活力检测。例如，可以对大量til样品进行台盼蓝拒染实验，该试验可以选择性标记死细胞并允许评估活力。用于测试活力的其他检测法可以包括但不限于阿尔玛蓝测定法以及mtt测定法。1、细胞计数、活力、流式细胞术在一些实施方式中，进行细胞计数和/或测量活力。可以使用facscantotm流式细胞仪(bdbiosciences)，用抗体(例如但不限于可从bdbio-sciences(bdbiosciences，圣何塞，加利福尼亚)商购的那些)通过流式细胞术来检测标志物(例如但不限于cd3、cd4、cd8和cd56以及本文公开或描述的任何其他标志物)的表达。可以使用一次性c芯片血细胞计数器(vwr，巴达维亚，伊利诺伊州)手动对细胞进行计数，并且可以使用本领域已知的任何方法评估活力，包括但不限于台盼蓝染色。在某些情况下，可以使用下文讨论的方案立即对大量til群进行冷冻保存。或者，可以如下所述地，对大量的til群进行rep，然后冷冻保存。类似地，在将基因修饰的til用于治疗的情况下，可以对大量或者reptil群进行基因修饰以用于适当的治疗。2、细胞培养在一个实施方式中，扩增til的方法可包括使用约5,000ml至约25,000ml的细胞培养基、约5,000ml至约10,000ml的细胞培养基或约5,800ml至约8,700ml的细胞培养基。在一个实施方式中，使用不超过一种类型的细胞培养基来扩增til的数量。可以使用任何合适的细胞培养基，例如aim-v细胞培养基(l-谷氨酰胺、50μm硫酸链霉素和10μm硫酸庆大霉素)细胞培养基(invitrogen，carlsbadca)。在这方面，本发明的方法有利地减少了扩增til数量所需的培养基的量和培养基的种类数量。在一个实施方式中，扩增til的数量可以包括以不超过每三天一次或者每四天一次的频率喂养细胞。在透气性容器中扩增细胞的数量通过降低扩增细胞所需的喂养频率，简化了扩增细胞数量所需的程序。在一个实施方式中，第一和/或第二透气性容器中的细胞培养基未经过滤。使用未过滤的细胞培养基可以简化扩增细胞数量所需步骤。在一个实施方式中，第一和/或第二透气性容器中的细胞培养基不含β-巯基乙醇(bme)。在一个实施方式中，该方法的持续时间包括：从哺乳动物获得肿瘤组织样品；在其中装有细胞培养基的第一透气性容器中培养肿瘤组织样品；从肿瘤组织样品中获得til；使用aapc在装有细胞培养基的第二透气性容器中扩增til的数量持续约14天至约42天(例如约28天)。在一个实施方式中，在透气性容器中扩增til。使用本领域已知的方法、组分和装置，包括在美国专利申请公开号us2005/0106717a1所述的那些(其公开内容通过引用并入本文)，使用透气性容器，用pbmc来扩增til。在一个实施方式中，til在透气袋中扩增。在一个实施方式中，使用细胞扩增系统扩增til，该细胞扩增系统在透气袋中扩增til，例如xuri细胞扩增系统w25(xuricellexpansionsystemw25)(gehealthcare)。在一个实施方式中，使用细胞扩增系统扩增til，该细胞扩增系统在透气袋中扩增til，例如wave生物反应器系统，也称为xuri细胞扩增系统w5(gehealthcare)。在一个实施方式中，细胞扩增系统包括透气性细胞袋，其体积选自：约100ml、约200ml、约300ml、约400ml、约500ml、约600ml、约700ml、约800ml、约900ml、约1l、约2l、约3l、约4l、约5l、约6l、约7l、约8l、约9l和约10l。在一个实施方式中，可以在g-rex烧瓶(可从wilsonwolfmanufacturing商购)中扩增til。此类实施方式可以将细胞群从约5×105个细胞/cm2扩增为10×106～30×106个细胞/cm2。在一个实施方式中，无需喂养细胞。在一个实施方式中，只要培养基在g-rex烧瓶中位于约10cm的高度，就不进行喂养。在一个实施方式中，不进行喂养但是添加一种以上细胞因子。在一个实施方式中，细胞因子可以作为丸剂添加而无需将细胞因子与培养基混合。此种容器、装置和方法在本领域中是已知的并且已经用于扩增til，并且包括在美国专利申请公开号us2014/0377739a1、国际公开号wo2014/210036a1、美国专利申请公开号us2013/0115617al、国际公开号wo2013/188427a1、美国专利申请公开号us2011/0136228a1、美国专利号us8,809,050b2、国际公开号wo2011/072088a2、美国专利申请公开号us2016/0208216a1、美国专利申请公开号us2012/0244133a1、国际公开号wo2012/129201a1、美国专利申请公开号us2013/0102075a1，美国专利号us8,956,860b2、国际公开号wo2013/173835a1和美国专利申请公开号us2015/0175966a1中描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。这些方法也描述于jin等，j.immunotherapy2012,35,283-292。可选的til的基因工程在一些实施方式中，可选地对til进行基因工程改造以包括另外的功能，包括但不限于高亲和力t细胞受体(tcr)，例如靶向肿瘤相关抗原(例如mage-1、her2或者ny-eso-1)的tcr，或者与肿瘤相关细胞表面分子(例如间皮素)或者谱系限制性细胞表面分子(例如cd19)结合的嵌合抗原受体(car)。iv、治疗患者的方法治疗方法从初始til的收集和til的培养开始。例如，此类方法在本领域中已被jin等，j.immunotherapy，2012，35(3)：283-292描述，其通过引用整体并入本文。下文整个部分(包括实施例)描述了治疗方法的实施方式。发现根据本文所述的方法(包括例如在上述步骤a至f中所述或者根据上述步骤a至f(例如也在图27中所示))产生的扩增的til在治疗癌症患者中具有特定用途(例如，如在goff等，j.clinicaloncology,2016,34(20):2389-239以及补充内容中所述；通过引用全文并入本文)。在一些实施方式中，如先前所述，由切除的转移性黑色素瘤的沉积物中生长til(参见，dudley等，jimmunother.,2003,26:332-342；通过引用整体并入本文)。新鲜肿瘤可在无菌条件下解剖。可以收集代表性样品用于正式病理分析。可以使用2mm3至3mm3的单个碎片。在一些实施方式中，每位患者获得5、10、15、20、25或者30个样品。在一些实施方式中，每位患者获得20、25或者30个样品。在一些实施方式中，每位患者获得20、22、24、26或者28个样品。在一些实施方式中，每位患者获得24个样品。可以将样品置于24孔板的各个孔中，保持在具有高剂量il-2(6,000iu/ml)的生长培养基中，并监测肿瘤的破坏和til的增殖。如本文所述，可将处理后剩余有活细胞的任何肿瘤酶消化成单细胞悬液并冷冻保存。在一些实施方式中，可以对成功生长的til进行取样以进行表型分析(cd3、cd4、cd8和cd56)，在有条件时针对自体肿瘤进行测试。如果过夜共培养产生的干扰素-γ(ifn-γ)水平>200pg/ml且是背景的2倍，则认为til具有活性(reactive)。(goff等，jimmunother.,2010,33:840-847；通过引用整体并入本文)。在一些实施方式中，可以选择表现出自体反应性(autologousreactivity)或者充分生长模式的培养物用于第二次扩增(例如在根据图27的步骤d中所提供的第二次扩增)，包括有时称为快速扩增(rep)的第二次扩增。在一些实施方式中，选择具有高自体反应性(例如，第二次扩增期间的高增殖)的扩增的til用于另外的第二次扩增。在一些实施方式中，选择具有高自体反应性(例如，在如图27的步骤d中所提供的第二次扩增期间的高增殖)的til用于根据图27的步骤d的另外的第二次扩增。在一些实施方式中，患者不直接进行act(过继性细胞转移)，例如，在一些实施方式中，在收获肿瘤和/或第一次扩增后，不立即使用细胞。在此类实施方式中，til可以冷冻保存并在给患者施用前2天解冻。在此类实施方式中，til可以冷冻保存并在给患者施用前1天解冻。在一些实施方式中，til可以冷冻保存并在给患者施用前即刻解冻。可通过流式细胞术(例如flowjo)以及本文所述的任何方法，分析冷冻保存的输液袋til样品的细胞表型的表面标志物cd3、cd4、cd8、ccr7和cd45ra(bdbiosciences)。通过使用标准酶联免疫吸附测定技术，检测血清细胞因子。血清ifn-g升高被定义为>100pg/ml且大于43基线水平。在一些实施方式中，通过本文提供的方法产生的til(例如图27中示例的那些)提供了令人惊讶的til的临床疗效的改善。在一些实施方式中，与通过除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27示例的那些之外的方法)产生的til相比，通过本文提供的方法产生的til(例如图27中示例的那些)显示出增加的临床疗效。在一些实施方式中，除本文所述那些之外的方法包括被称为过程1c和/或第1代(gen1)的方法。在一些实施方式中，增加的疗效通过dcr、orr和/或其他临床反应来测量。在一些实施方式中，与通过除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27中示例的那些之外的方法，例如gen1过程)产生的til相比，通过本文提供的方法(例如图27中示例的那些)产生的til显示出相似的反应时间和安全性特征。在一些实施方式中，ifn-伽马(ifn-γ)指示治疗疗效和/或增加的临床疗效。在一些实施方式中，用til治疗的受试者血液中的ifn-γ指示活性til。在一些实施方式中，采用ifn-γ产生的效价测定。ifn-γ产生是细胞毒性潜力的另一种量度。可通过测定用本发明方法(包括例如图27所述的那些)制备的til治疗的受试者离体血液、血清或者til中细胞因子ifn-γ的水平，来检测ifn-γ的产生。在一些实施方式中，ifn-γ的增加指示用本发明方法产生的til治疗患者的治疗疗效。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，ifn-γ增加了1倍、2倍、3倍、4倍或者5倍或者更多倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，ifn-γ的分泌增加了1倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，ifn-γ的分泌增加了2倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，ifn-γ的分泌增加了3倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，ifn-γ的分泌增加了4倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，ifn-γ的分泌增加了5倍。在一些实施方式中，使用quantikineelisa试剂盒检测ifn-γ。在一些实施方式中，在用本发明方法制备的til治疗的受试者的离体til中检测ifn-γ，包括例如图27中描述的那些。在一些实施方式中，检测用本发明方法(包括例如图27所述的那些)制备的til治疗的受试者的血液中的ifn-γ。在一些实施方式中，检测用本发明方法(包括例如图27所述的那些)制备的til治疗的受试者的til血清中的ifn-γ。在一些实施方式中，更高的平均ip-10指示治疗疗效和/或增加的临床疗效。在一些实施方式中，用til治疗的受试者的血液中更高的平均ip-10指示活性til。可通过测定用本发明方法(包括例如图27中所述那些)制备的til治疗的受试者血液中ip-10的水平，来检测ip-10的产生。在一些实施方式中，更高的平均ip-10指示用本发明方法产生的til治疗的患者中的治疗疗效。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均ip-10与增加1倍、2倍、3倍、4倍或者5倍或者更多倍相关。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均ip-10与增加1倍相关。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均ip-10与增加2倍相关。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均ip-10与增加3倍相关。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均ip-10与增加4倍相关。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均ip-10与增加5倍相关。在一些实施方式中，检测用本发明方法(包括例如图27中所述那些)制备的til治疗的受试者的血液中的ip-10。在一些实施方式中，检测用本发明方法(包括例如图27中所述那些)制备的til治疗的受试者的til血清中的ip-10。在一些实施方式中，更高的平均mcp-1指示治疗疗效和/或增加的临床疗效。在一些实施方式中，用til治疗的受试者的血液中更高的平均mcp-1指示活性til。可通过测定用本发明方法(包括例如图27中所述那些)制备的til治疗的受试者血液中mcp-1的水平，来检测mcp-1的产生。在一些实施方式中，更高的平均mcp-1指示在用本发明方法产生的til治疗的患者中的治疗疗效。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均mcp-1与增加1倍、2倍、3倍、4倍或者5倍或者更多倍相关。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均mcp-1与增加1倍相关。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均mcp-1与增加2倍相关。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均mcp-1与增加3倍相关。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均mcp-1与增加4倍相关。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均mcp-1与增加5倍相关。在一些实施方式中，检测用本发明方法(包括例如图27中所述那些)制备的til治疗的受试者的血液中的mcp-1。在一些实施方式中，检测用本发明方法(包括例如图27中所述那些)制备的til治疗的受试者的til血清中的mcp-1。在一些实施方式中，与通过其他方法(包括在图27中未示例说明的那些，例如称为过程1c的方法)产生的til相比，通过本发明的方法(包括例如图27中所述那些)制备的til显示出增加的多克隆性。在一些实施方式中，显著改善的多克隆性和/或增加的多克隆性指示治疗疗效和/或增加的临床疗效。在一些实施方式中，多克隆性指t细胞谱系多样性。在一些实施方式中，多克隆性的增加可以指示关于施用本发明方法产生的til的治疗疗效。在一些实施方式中，与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til相比，多克隆性增加了1倍、2倍、10倍、100倍、500倍或者1000倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，多克隆性增加了1倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，多克隆性增加了2倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，多克隆性增加了10倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，多克隆性增加了100倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，多克隆性增加了500倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，多克隆性增加了1000倍。如本领域已知以及本文所提供的实施例(包括实施例28)中所述，疗效的量度可以包括疾病控制率(dcr，diseasecontrolrate)量度以及总反应率(orr，overallresponserate)。1、治疗癌症和其他疾病的方法本文所述的组合物和方法可用于治疗疾病的方法中。在一个实施方式中，它们用于治疗过度增殖性疾病。它们还可以用于治疗如此处及以下段落中描述的其他病症。在一些实施方式中，过度增殖性疾病是癌症。在一些实施方式中，过度增殖性疾病是实体瘤癌症。在一些实施方式中，实体瘤癌症选自黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(nsclc)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(hnscc))、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方式中，过度增殖性疾病是血液恶性肿瘤。在一些实施方式中，实体瘤癌症选自慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、弥漫性大b细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。在一个实施方式中，本发明包括用til群治疗癌症的方法，其中，根据本公开内容，在输注til之前用非清髓性化疗预治疗患者。在一个实施方式中，非清髓性化疗是以60mg/kg/天施用环磷酰胺持续2天(til输注前第27和26天)和以25mg/m2/天施用氟达拉滨持续5天(til输注前第27至23天)。在一个实施方式中，在根据本公开内容的非清髓性化疗和til输注(在第0天)后，患者以720,000iu/kg每8小时接受一次il-2的静脉输注，直至生理耐受。本文所述化合物和化合物组合在治疗、预防和/或控制所示疾病或病症中的疗效可使用本领域已知的各种模型进行测试，为人类疾病的治疗提供指导。例如，用于确定卵巢癌治疗疗效的模型描述于例如mullany等，endocrinology2012,153,1585-92；以及fong等，j.ovarianres.2009,2,12。用于确定胰腺癌治疗疗效的模型描述于herreros-villanueva等，worldj.gastroenterol.2012,18,1286-1294。用于确定乳腺癌治疗疗效的模型描述于例如fantozzi，breastcancerres.2006,8,212。用于确定黑色素瘤治疗疗效的模型描述于例如damsky等，pigmentcell&melanomares.2010,23,853–859。用于确定肺癌治疗疗效的模型描述于例如meuwissen等，genes&development,2005,19,643-664。用于确定肺癌治疗疗效的模型描述于例如kim,clin.exp.otorhinolaryngol.2009,2,55-60；以及sano,headneckoncol.2009,1,32。在一些实施方式中，ifn-伽马(ifn-γ)指示过度增殖性疾病治疗的治疗疗效。在一些实施方式中，用til治疗的受试者的血液中的ifn-γ指示活性til。在一些实施方式中，采用了ifn-γ产生的效价测定。ifn-γ产生是细胞毒性潜力的另一种量度。可通过测定用本发明方法(包括例如图27中所述那些)制备的til治疗受试者的血液中细胞因子ifn-γ的水平，来检测ifn-γ的产生。在一些实施方式中，与用称为过程1c的方法(如图83中所示)制备的til治疗的受试者相比，本发明方法获得的til在用本发明方法的til治疗的受试者的血液中提供增加的ifn-γ。在一些实施方式中，ifn-γ的增加指示用本发明方法产生的til治疗的患者的治疗疗效。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，ifn-γ增加了1倍、2倍、3倍、4倍或者5倍或者更多倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，ifn-γ的分泌增加了1倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，ifn-γ的分泌增加了2倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，ifn-γ的分泌增加了3倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，ifn-γ的分泌增加了4倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，ifn-γ的分泌增加了5倍。在一些实施方式中，使用quantikineelisa试剂盒检测ifn-γ。在一些实施方式中，使用quantikineelisa试剂盒检测ifn-γ。在一些实施方式中，在用本发明的方法产生的til治疗的患者离体的til中，测量ifn-γ。在一些实施方式中，检测用本发明方法产生的til治疗的患者的血液中的ifn-γ。在一些实施方式中，检测用本发明方法产生的til治疗的患者的血清中的ifn-γ。在一些实施方式中，更高的平均ip-10指示过度增殖性疾病治疗的治疗疗效和/或增加的临床疗效。在一些实施方式中，用til治疗的受试者的血液中更高的平均ip-10指示活性til。在一些实施方式中，与用称为过程1c的方法(如图83中所示)制备的til治疗的受试者相比，本发明方法获得的til在用本发明方法的til治疗的受试者的血液中提供更高的平均ip-10。可通过测定用本发明方法(包括图27中所述那些)制备的til治疗的受试者血液中ip-10的水平，来检测ip-10的产生。在一些实施方式中，更高的平均ip-10指示用本发明方法产生的til治疗的患者的治疗疗效。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均ip-10与增加1倍、2倍、3倍、4倍或者5倍或者更多倍相关。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均ip-10与增加1倍相关。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均ip-10与增加2倍相关。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均ip-10与增加3倍相关。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均ip-10与增加4倍相关。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均ip-10与增加5倍相关。在一些实施方式中，更高的平均mcp-1指示过度增殖性疾病治疗的治疗疗效和/或增加的临床疗效。在一些实施方式中，用til治疗的受试者的血液中更高的平均mcp-1指示活性til。在一些实施方式中，与用称为过程1c的方法(如图83中所示)制备的til治疗的受试者相比，本发明的方法获得的til在用本发明方法的til治疗的受试者的血液中提供更高的平均mcp-1。可通过测定用本发明方法制备的til治疗的受试者血液中mcp-1的水平，来检测mcp-1产生。在一些实施方式中，更高的平均mcp-1指示用本发明方法产生的til治疗的患者的治疗疗效。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均mcp-1与增加1倍、2倍、3倍、4倍或者5倍或者更多倍相关。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均mcp-1与增加1倍相关。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均mcp-1与增加2倍相关。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均mcp-1与增加3倍相关。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均mcp-1与增加4倍相关。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，更高的平均mcp-1与增加5倍相关。在一些实施方式中，与通过其他方法(包括在图27中未示例说明的那些，例如称为过程1c的方法)产生的til相比，通过本发明的方法(包括例如图27中所述那些)制备的til显示出增加的多克隆性。在一些实施方式中，显著改善的多克隆性和/或增加的多克隆性指示癌症治疗的疗效和/或增加的临床疗效。在一些实施方式中，多克隆性指t细胞谱系多样性。在一些实施方式中，多克隆性的增加可以指示关于施用本发明方法产生的til的治疗疗效。在一些实施方式中，与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til相比，多克隆性增加了1倍、2倍、10倍、100倍、500倍或者1000倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，多克隆性增加了1倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，多克隆性增加了2倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，多克隆性增加了10倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，多克隆性增加了100倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，多克隆性增加了500倍。在一些实施方式中，与未经治疗的患者相比和/或与使用除本文所述那些之外的方法(包括例如除了图27所示那些之外的方法)制备的til治疗的患者相比，多克隆性增加了1000倍。2、共同施用的方法在一些实施方式中，如本文所述产生的til，包括例如来自图27的步骤a至f中所述方法的til，可与一种以上免疫检查点调节剂组合施用，例如下文描述的抗体。例如，靶向pd-1并且可与本发明的til共同施用的抗体包括例如但不限于：尼沃鲁单抗(bms-936558，百时美施贵宝；)，兰洛利珠单抗(lambrolizumab，mk03475或mk-3475，默克；)，人源化抗pd-1抗体js001(shanghaijunshi)，单克隆抗pd-1抗体tsr-042(tesaro,inc.)，匹地利珠单抗(抗pd-1mabct-011,medivation)，抗pd-1单克隆抗体bgb-a317(beigene)和/或抗pd-1抗体shr-1210(shanghaihengrui)，人单克隆抗体regn2810(regeneron)，人单克隆抗体mdx-1106(bristol-myerssquibb)，和/或人源化抗pd-1igg4抗体pdr001(novartis)。在一些实施方式中，pd-1抗体来自克隆：rmp1-14(大鼠igg)-bioxcell目录号bp0146。适用于根据本文所述步骤a至f产生的til的共同施用方法的其它合适的抗体是美国专利号8,008,449中公开的抗pd-1抗体，其通过引用并入本文。在一些实施方式中，抗体或其抗原结合部分特异性结合pd-l1并抑制其与pd-1的相互作用，从而增加免疫活性。任何本领域已知的与pd-l1结合并破坏pd-1和pd-l1之间相互作用并刺激抗肿瘤免疫应答的抗体，均适合用于根据本文所述步骤a至f产生的til的共同施用方法。例如，靶向pd-l1并且处于临床试验中的抗体包括bms-936559(bristol-myerssquibb)和mpdl3280a(genentech)。靶向pd-l1的其他合适的抗体公开于美国专利号7,943,743中，其通过引用并入本文。本领域普通技术人员将理解，任何与pd-1或pd-l1结合、破坏pd-1/pd-l1相互作用并刺激抗肿瘤免疫应答的抗体，均适合用于根据本文所述步骤a至f产生的til的共同施用方法。在一些实施方式中，当患者具有难以用单独施用抗pd-1抗体治愈的癌症类型时，施用根据步骤a至f产生的til组合的受试者被共同施用抗pd-1抗体。在一些实施方式中，当患者患有重构黑色素瘤(refractorymelanoma)时，给患者施用与抗pd-1组合的til。在一些实施方式中，当患者患有非小细胞肺癌(nsclc)时，给患者施用与抗pd-1组合的til。3、可选的患者的淋巴细胞耗竭预处理在一个实施方式中，本发明包括用til群治疗癌症的方法，其中，根据本公开内容，在输注til之前用非清髓性化疗对患者进行预处理。在一个实施方式中，本发明包括用于治疗患者的癌症的til群，该患者已用非清髓性化疗进行预处理。在一个实施方式中，til群用于通过输注施用。在一个实施方式中，非清髓性化疗是以60mg/kg/天施用环磷酰胺持续2天(til输注前第27和26天)和以25mg/m2/天施用氟达拉滨持续5天(til输注前第27至23天)。在一个实施方式中，在根据本公开内容的非清髓性化疗和til输注(在第0天)后，患者以720,000iu/kg每8小时接受一次il-2(阿地白介素，作为proleuktn市售)的静脉输注，直至生理耐受。在某些实施方式中，til群与il-2组合用于治疗癌症；其中，il-2在til群之后施用。实验结果表明，过继性转移肿瘤特异性t淋巴细胞之前的淋巴细胞耗竭通过消除调节性t细胞和免疫系统的竞争成分(“细胞因子沉降”)而在提高治疗疗效中起关键作用。因此，本发明的一些实施方式在引入本发明的til之前对患者使用淋巴细胞耗竭步骤(有时也称为“免疫抑制调节”)。通常，采用施用氟达拉滨或环磷酰胺(活性形式称为马磷酰胺)，及它们的组合来完成淋巴细胞耗竭。此种方法描述于gassner等，cancerimmunolimmunother.2011，60，75–85；muranski等，nat.clin.pract.oncol.，2006，3，668–681、dudley等；j.clin.oncol.2008，26，5233-5239和dudley等，j.clin.oncol.2005，23，2346–2357，所有这些文献都通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，氟达拉滨以0.5μg/ml至10μg/ml氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方式中，氟达拉滨以1μg/ml氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方式中，氟达拉滨治疗施用1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更长时间。在一些实施方式中，氟达拉滨以10mg/kg/天、15mg/kg/天、20mg/kg/天、25mg/kg/天、30mg/kg/天、35mg/kg/天、40mg/kg/天或45mg/kg/天的剂量施用。在一些实施方式中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天施用2至7天。在一些实施方式中，氟达拉滨治疗以35mg/kg/天施用4至5天。在一些实施方式中，氟达拉滨治疗以25mg/kg/天施用4至5天。在一些实施方式中，通过施用环磷酰胺获得0.5μg/ml至10μg/ml浓度的马磷酰胺(环磷酰胺的活性形式)。在一些实施方式中，通过施用环磷酰胺获得1μg/ml浓度的马磷酰胺(活性形式的环磷酰胺)。在一些实施方式中，环磷酰胺治疗施用1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更长时间。在一些实施方式中，环磷酰胺以100mg/m2/天、150mg/m2/天、175mg/m2/天、200mg/m2/天、225mg/m2/天、250mg/m2/天、275mg/m2/天或300mg/m2/天的剂量施用。在一些实施方式中，静脉注射(即i.v.)施用环磷酰胺。在一些实施方式中，环磷酰胺治疗以35mg/kg/天施用2至7天。在一些实施方式中，环磷酰胺治疗以250mg/m2/天静脉注射施用4至5天。在一些实施方式中，环磷酰胺治疗以250mg/m2/天静脉注射施用4天。在一些实施方式中，通过将氟达拉滨和环磷酰胺共同施用于患者来进行淋巴细胞耗竭。在一些实施方式中，氟达拉滨以25mg/m2/天静脉注射施用且环磷酰胺以250mg/m2/天静脉注射施用，持续4天。在一个实施方式中，通过以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续5天，来进行淋巴细胞耗竭。4、il-2方案在一个实施方式中，il-2方案包括高剂量il-2方案；其中，高剂量il-2方案包括：在施用治疗有效份的第三til群之后的第二天开始静脉内施用阿地白介素或其生物类似物或变体；其中，阿地白介素或其生物类似物或变体以0.037mg/kg或0.044mg/kgiu/kg(患者体重)的剂量每8小时一次静脉推注施用15分钟，直至耐受，最多14剂。休息9天后，可以重复该时间表进行另外14个剂量，总共最多28个剂量。在一个实施方式中，il-2方案包括递减型(decrescendo)il-2方案。递减型il-2方案已描述于o'day等，j.clin.oncol.1999，17，2752-61和eton等，cancer2000，88，1703-9，其公开内容通过引用并入本文。在一个实施方式中，递减型il-2方案包括在6小时内静脉内施用18×106iu/m2，然后在12小时内静脉内施用18×106iu/m2，然后在24小时内静脉内施用18×106iu/m2，然后在72小时内静脉内施用4.5×106iu/m2。该治疗循环可每28天重复一次，最多4个循环。在一个实施方式中，递减型il-2方案包括在第1天18,000,000iu/m2，在第2天9,000,000iu/m2，在第3和4天4,500,000iu/m2。在一个实施方式中，il-2方案包括每天、每2天、每4天、每6天、每7天、每14天或每21天，以0.10mg/天至50mg/天的剂量施用聚乙二醇化的il-2。5、过继性细胞转移(adoptivecelltransfer)过继性细胞转移(act)是一种非常有效的免疫治疗形式，涉及将具有抗肿瘤活性的免疫细胞转移至癌症患者体内。act是一种治疗方法，涉及体外识别具有抗肿瘤活性的淋巴细胞，将这些细胞大量体外扩增，以及将其输注到患癌宿主中。用于过继性转移的淋巴细胞可以来自切除肿瘤的基质(肿瘤浸润淋巴细胞或til)。可以如本文所述制备用于act的til。在一些实施方式中，例如根据图27中描述的方法来制备til。如果它们经基因工程改造以表达抗肿瘤t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)，富含混合淋巴细胞肿瘤细胞培养物(mltc)，或使用自体抗原呈递细胞和肿瘤衍生肽克隆，则它们也可来源或来自血液。淋巴细胞来源于待输注的患癌宿主的act称为自体act。美国公开号2011/0052530涉及用于实施过继性细胞治疗以促进癌症消退的方法，主要用于治疗患有转移性黑色素瘤的患者，其通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，til可以如本文所述施用。在一些实施方式中，til可以单剂量施用。此种施用可通过注射，例如静脉内注射。在一些实施方式中，til和/或细胞毒性淋巴细胞可以多剂量施用。剂量可以是每年一次，两次，三次，四次，五次，六次或超过六次。剂量可以是每月一次，每两周一次，每周一次，或隔天一次。只要需要，til和/或细胞毒性淋巴细胞的施用可以继续。6、示例性治疗实施方式在一些实施方式中，本公开提供了用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗癌症的方法，该方法包括以下步骤：(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群；(b)在第一细胞培养基中进行第一til群的初始扩增，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少5倍；其中，第一细胞培养基包含il-2；(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aapc)群对第二til群进行快速扩增，获得第三til群；其中，在快速扩增开始7天后，第三til群的数量比第二til群的数量高至少50倍；其中，第二细胞培养基包含il-2和okt-3；(d)将治疗有效份的第三til群施用于患有癌症的患者。在一些实施方式中，本公开提供了用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(til)群；其中，所述til群可通过包括以下步骤的方法获得：(b)在第一细胞培养基中对获自患者切除肿瘤的第一til群进行初始扩增，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少5倍；其中，第一细胞培养基包含il-2；(c)在第二细胞培养基中，使用骨髓人工抗原呈递细胞(骨髓aapc)群对第二til群进行快速扩增，获得第三til群；其中，在快速扩增开始7天后，第三til群的数量比第二til群的数量高至少50倍；其中，第二细胞培养基包含il-2和okt-3；(d)将治疗有效份的第三til群施用于患有癌症的患者。在一些实施方式中，该方法包括第一步(a)从患者切除的肿瘤中获得第一til群。在一些实施方式中，在第二细胞培养基中，il-2以约3000iu/ml的初始浓度存在，okt-3抗体以约30ng/ml的初始浓度存在。在一些实施方式中，第一次扩增进行不超过14天。在一些实施方式中，使用透气性容器进行第一次扩增。在一些实施方式中，使用透气性容器进行第二次扩增。在一些实施方式中，在快速扩增中，第二til群与aapc群的比率为1：80至1：400。在一些实施方式中，在快速扩增中，第二til群与aapc群的比率为约1：300。在一些实施方式中，治疗的癌症选自黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(nsclc)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(hnscc))、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方式中，治疗的癌症选自黑色素瘤、卵巢癌和宫颈癌。在一些实施方式中，治疗的癌症是黑色素瘤。在一些实施方式中，治疗的癌症是卵巢癌。在一些实施方式中，治疗的癌症是宫颈癌。在一些实施方式中，治疗癌症的方法还包括以下步骤：在给患者施用第三til群之前，用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者。在一些实施方式中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续5天。在一些实施方式中，高剂量il-2方案包括：每8小时以15分钟静脉推注方式施用600,000iu/kg或720,000iu/kg阿地白介素或者它的生物类似物或者它的变体，直至耐受。v、示例性实施方式在一些实施方式中，本发明提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(til)，包括以下步骤：(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，从患者切除的肿瘤中获得第一til群；(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；(c)通过在包含il-2的细胞培养基中培养第一til群进行第一次扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约11天，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)通过向第二til群的细胞培养基中补充另外的il-2、okt-3和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约11天，获得第三til群；其中，第三til群是治疗性til群；其中，第二次扩增在提供第二个透气表面积的封闭容器中进行，并且从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)收获从步骤(d)获得的治疗性til群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(f)将从步骤(e)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；(g)使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的til群的输液袋；以及(h)给患者施用治疗有效剂量的第三til群，该第三til群来自步骤(g)的输液袋。在一些实施方式中，冷冻保存方法包括在包含dmso的培养基中的冷冻保存。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含7％至10％的dmso。在一些实施方式中，冷冻保存培养基为cs10。在一些实施方式中，在步骤(e)收获的治疗性til群包含足以达到til在步骤(h)中施用的治疗有效剂量的til。在一些实施方式中，足以达到til在步骤(h)中施用的治疗有效剂量的til的数量为约2.3×1010至约13.7×1010。在一些实施方式中，抗原呈递细胞(apc)是pbmc。在一些实施方式中，在步骤(d)的第9天至第11天中的任何一天将pbmc添加到细胞培养基中。在一些实施方式中，在步骤(h)中施用治疗有效剂量的til细胞之前，已给患者施用了非清髓性淋巴细胞耗竭方案。在一些实施方式中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续5天。在一些实施方式中，该方法还包括以下步骤：在步骤(h)中给患者施用til细胞后的第二天开始用高剂量il-2方案治疗患者。在一些实施方式中，高剂量il-2方案包括每8小时以15分钟静脉推注方式施用600,000iu/kg或720,000iu/kg，直至耐受。在一些实施方式中，当给受试者施用时，步骤(d)中的第三til群提供了增加的疗效、增加的干扰素-γ(ifn-γ)产生、增加的多克隆性、增加的平均ip-10和/或增加的平均mcp-1。在一些实施方式中，在经til治疗的受试者的血液中检测到ifn-γ增加、平均ip-10增加和/或平均mcp-1增加。在一些实施方式中，癌症选自黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(nsclc)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌，由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(hnscc))、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方式中，癌症选自黑色素瘤、hnscc、宫颈癌和nsclc。在一些实施方式中，癌症是黑色素瘤。在一些实施方式中，癌症是hnscc。在一些实施方式中，癌症是宫颈癌。在一些实施方式中，癌症是nsclc。在一个实施方式中，本发明提供了扩增肿瘤浸润淋巴细胞(til)的方法。本发明提供了扩增肿瘤浸润淋巴细胞(til)的方法，该方法包括：(a)从患者获得肿瘤样品；其中，所述肿瘤样品包含第一til群；(b)将所述肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片；(c)将所述肿瘤碎片加入封闭容器中；(d)在第一细胞培养基中进行所述第一til群的初始扩增，获得第二til群；其中，所述第一细胞培养基包含il-2；其中，所述初始扩增在提供至少100cm2的透气表面积的所述封闭容器中进行；其中，在约7天至14天的第一阶段内进行所述初始扩增，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)在第二细胞培养基中扩增所述第二til群；其中，所述第二细胞培养基包含il-2、okt-3和外周血单核细胞(pbmc，也称为单核细胞(mnc))；其中，在约7天至14天的第二阶段内进行所述扩增，获得第三til群；其中，相对于第二til群，所述第三til群表现出增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，所述扩增在提供至少500cm2的透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；(f)收获从步骤(e)获得的所述第三til群；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(g)将所述从步骤(f)收获的til群转移至输液袋；其中，所述从步骤(f)到步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生。在一些实施方式中，该方法是体外或者离体方法。在一些实施方式中，该方法还包括通过细胞处理系统(例如freseniuskabi制造的lovo系统)进行步骤(f)中的收获。术语“lovo细胞处理系统”还指任何供应商制造的可在无菌和/或封闭系统环境中将包含细胞的溶液泵送通过膜或者过滤器(例如旋转膜或者旋转过滤器)的任何仪器或者设备，其允许连续流动和细胞处理以除去上清液或不含沉淀的细胞培养基。在一些实施方式中，细胞处理系统可以在封闭的无菌系统中进行细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其他细胞处理步骤。在一些实施方式中，封闭容器选自由g容器和xuri细胞袋。在一些实施方式中，步骤(g)中的输液袋是含有hypothermosol的输液袋。在一些实施方式中，步骤(d)中的第一阶段和步骤(e)中的所述第二阶段各自在10天、11天或12天内进行。在一些实施方式中，步骤(d)中的第一阶段和步骤(e)中的所述第二阶段各自在11天内进行。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(g)进行约25天至约30天。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(g)进行约20天至约25天。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(g)进行约20天至约22天。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(g)进行22天以下。在一些实施方式中，步骤(c)至(f)在单个容器中进行；其中，与在超过一个的容器中进行步骤(c)至(f)相比，在单个容器中进行步骤(c)至(f)使得每个切除的肿瘤的til产量增加。在一些实施方式中，在步骤(e)的第二阶段期间，在不打开系统的情况下将pbmc添加到til中。在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，获自第三til群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出选自下组的一种以上特征：cd27+表达、cd28+表达、端粒更长、cd57表达增加和cd56表达降低。在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，获自第三til群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出：cd57表达增加和cd56表达降低。在一些实施方式中，与开放系统相比，所述方法降低微生物污染的风险。在一些实施方式中，将来自步骤(g)的til输注到患者体内。本发明还提供了用肿瘤浸润淋巴细胞(til)群治疗患者的癌症的方法，该方法包括以下步骤：(a)从患者获得肿瘤样品；其中，所述肿瘤样品包含第一til群；(b)将所述肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片；(c)将所述肿瘤碎片加入封闭容器中；(d)在第一细胞培养基中进行所述第一til群的初始扩增，获得第二til群；其中，所述第一细胞培养基包含il-2；其中，所述初始扩增在提供至少100cm2的透气表面积的所述封闭容器中进行；其中，在约7天至14天的第一阶段内进行所述初始扩增，获得第二til群；其中，所述第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)在第二细胞培养基中扩增所述第二til群；其中，所述第二细胞培养基包含il-2、okt-3和外周血单核细胞(pbmc)；其中，在约7天至14天的第二阶段内进行所述扩增，获得第三til群；其中，相对于第二til群，所述第三til群表现出增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，所述扩增在提供至少500cm2的透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；(f)收获从步骤(e)获得的所述第三til群；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；(g)将所述从步骤(f)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(f)到步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(h)给所述患者施用治疗有效量的til细胞，所述til细胞来自步骤(g)的所述输液袋。在一些实施方式中，本发明还包括用于治疗癌症的肿瘤浸润淋巴细胞(til)群；其中，所述til群可由包括以下步骤的方法获得：(b)将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片；其中，所述肿瘤样品包含第一til群；(c)将所述肿瘤碎片加入封闭容器中；(d)在第一细胞培养基中进行所述第一til群的初始扩增，获得第二til群；其中，所述第一细胞培养基包含il-2；其中，所述初始扩增在提供至少100cm2的透气表面积的所述封闭容器中进行；其中，在约7天至14天的第一阶段内进行所述初始扩增，获得第二til群；其中，所述第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)在第二细胞培养基中扩增所述第二til群；其中，所述第二细胞培养基包含il-2、okt-3和外周血单核细胞(pbmc)；其中，在约7天至14天的第二阶段内进行所述扩增，获得第三til群；其中，相对于第二til群，所述第三til群显示出增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，所述扩增在提供至少500cm2透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；(f)收获从步骤(e)获得的所述第三til群；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；(g)将所述从步骤(f)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(f)到步骤(g)的转变在不打开系统的情况下发生。在一些实施方式中，该方法包括从患者获得肿瘤样品的第一步骤(a)；其中，所述肿瘤样品包含第一til群。在一些实施方式中，以治疗有效量施用来自步骤(g)中的所述输液袋的til群。在一些实施方式中，在步骤(h)中施用治疗有效量的til细胞之前，已给所述患者施用了非清髓性淋巴细胞耗竭方案。在一些实施方式中，til群用于给已经历非清髓性淋巴细胞耗竭方案的患者施用。在一些实施方式中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续5天。在一些实施方式中，该方法还包括以下步骤：在步骤(h)中向所述患者施用所述til细胞后的第二天开始用高剂量il-2方案治疗所述患者。在一些实施方式中，til群在高剂量il-2方案之前施用。在一些实施方式中，til群在高剂量il-2方案开始的前一天施用。在一些实施方式中，高剂量il-2方案包括每8小时以15分钟静脉推注方式施用600,000iu/kg或720,000iu/kg，直至耐受。在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，获自第三细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出选自下组的一种以上特征：cd27+表达、cd28+表达、端粒更长、cd57表达增加和cd56表达降低。在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，获自第三til群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出：cd57表达增加和cd56表达降低。本发明还提供了扩增肿瘤浸润淋巴细胞(til)的方法，该方法包括以下步骤：(a)将经处理的肿瘤碎片加入封闭系统中；(b)在第一细胞培养基中对所述第一til群进行第一次扩增，获得第二til群；其中，所述第一细胞培养基包含il-2；其中，所述第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，在约3天至14天的第一阶段内进行所述第一次扩增，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(a)到步骤(b)的转变在不打开系统的情况下发生；(c)在第二细胞培养基中扩增所述第二til群；其中，所述第二细胞培养基包含il-2、okt-3和抗原呈递细胞；其中，所述扩增进行约7天至14天，获得第三til群；其中，相对于第二til群，所述第三til群显示出增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，所述扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)收获从步骤(c)获得的所述第三til群；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)将所述从步骤(d)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生。在一些实施方式中，该方法还包括以下步骤：使用冷冻保存方法冷冻保存包含收获的til群的输液袋。在一些实施方式中，冷冻保存方法使用1：1比率的收获的til群与cs10培养基进行。在一些实施方式中，抗原呈递细胞是外周血单核细胞(pbmc)。在一些实施方式中，抗原呈递细胞是人工抗原呈递细胞。在一些实施方式中，使用lovo细胞处理系统进行步骤(d)中的收获。在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片；其中，每个碎片的体积为约27mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约30个至约60个碎片，碎片总体积为约1300mm3至约1500mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总体积为约1350mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总质量为约1克至约1.5克。在一些实施方式中，在选自g容器和xuri细胞袋的容器中提供第二细胞培养基。在一些实施方式中，步骤(e)中的输液袋是含有hypothermosol的输液袋。在一些实施方式中，步骤(b)中的第一阶段和步骤(c)中的所述第二阶段各自在10天、11天或12天内进行。在一些实施方式中，步骤(b)中的第一阶段和步骤(c)中的所述第二阶段各自在11天内进行。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(e)进行约25天至约30天。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(e)进行约20天至约25天。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(e)进行约20天至约22天。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(e)进行22天以下。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(e)和冷冻保存进行22天以下。在一些实施方式中，步骤(b)至步骤(e)在单个封闭系统中进行；其中，与在超过一个的容器中进行步骤(b)至步骤(e)相比，在单个容器中进行步骤(b)至步骤(e)使得每个切除的肿瘤的til产量增加。在一些实施方式中，在步骤(c)的第二阶段期间，在不打开系统的情况下将抗原呈递细胞添加到til中。在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，获自第三til群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出选自下组的一种以上特征：cd27+表达、cd28+表达、端粒更长、cd57表达增加和cd56表达降低。在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，获自第三til群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出：cd57表达增加和cd56表达降低。在一些实施方式中，与开放系统相比，所述方法降低了微生物污染的风险。在一些实施方式中，将来自步骤(e)的til输注到患者体内。在一些实施方式中，封闭容器包括单个生物反应器。在一些实施方式中，封闭容器包括g-rex-10。在一些实施方式中，封闭容器包括g-rex-100。在一些实施方式中，封闭容器包括g-rex500。在一些实施方式中，封闭容器包括xuri或者wave生物反应器透气袋。在一些实施方式中，本公开提供了将肿瘤浸润淋巴细胞(til)扩增为治疗性til群的方法，该方法包括以下步骤：(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；其中，所述肿瘤碎片包含第一til群；(c)通过在包含il-2的细胞培养基中培养第一til群进行第一次扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)通过向第二til群的细胞培养基中补充另外的il-2、okt-3和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；其中，第三til群是治疗性til群，相对于第二til群，该治疗性til群包含增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)收获从步骤(d)获得的治疗性til群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(f)将从步骤(e)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生。在一些实施方式中，该方法还包括以下步骤作为第一步骤：(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，从患者切除的肿瘤中获得第一til群。在一个实施方式中，该方法是体外或者离体方法。在一些实施方式中，本公开提供了将肿瘤浸润淋巴细胞(til)扩增为治疗性til群的方法，该方法包括以下步骤：(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，从患者切除的肿瘤中获得第一til群；(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；(c)通过在包含il-2的细胞培养基中培养第一til群进行第一次扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)通过向第二til群的细胞培养基中补充另外的il-2、okt-3和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；其中，第三til群是治疗性til群，相对于第二til群，该治疗性til群包含增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)收获从步骤(d)获得的治疗性til群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(f)将从步骤(e)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生。在一个实施方式中，该方法是体外或者离体方法。在一些实施方式中，该方法还包括以下步骤：使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的til群的输液袋。在一些实施方式中，冷冻保存方法使用1：1比率的收获的til群与冷冻保存培养基进行。在一些实施方式中，冷冻保存培养基包含二甲基亚砜。在一些实施方式中，冷冻保存培养基选自cryostorcs10、hypothermasol或者它们的组合。在一些实施方式中，抗原呈递细胞是外周血单核细胞(pbmc)。在一些实施方式中，pbmc是经辐照且同种异体的。在一些实施方式中，在步骤(d)的第9天至14天中的任何一天将pbmc添加到细胞培养基中。在一些实施方式中，抗原呈递细胞是人工抗原呈递细胞。在一些实施方式中，步骤(e)中的收获使用lovo细胞处理系统进行。在一些实施方式中，肿瘤碎片是多个碎片，并且包含约4个至约50个碎片；其中，每个碎片的体积为约27mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约30个至约60个碎片，碎片总体积为约1300mm3至约1500mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总体积为约1350mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总质量为约1克至约1.5克。在一些实施方式中，在选自g容器和xuri细胞袋的容器中提供细胞培养基。在一些实施方式中，步骤(f)中的输液袋是含有hypothermosol的输液袋。在一些实施方式中，步骤(c)中的第一阶段和步骤(e)中的第二阶段各自在10天、11天或12天内进行。在一些实施方式中，步骤(c)中的第一阶段和步骤(e)中的第二阶段各自在11天内进行。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行约25天至约30天。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行约20天至约25天。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行约20天至约22天。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)进行22天以下。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)和冷冻保存进行22天以下。在一些实施方式中，在步骤(e)中收获的治疗性til群包含足以达到til的治疗有效剂量的til。在一些实施方式中，足以达到治疗有效剂量的til的数量为约2.3×1010至约13.7×1010。在一些实施方式中，步骤(b)至步骤(e)在单个容器中进行；其中，与在超过一个的容器中进行步骤(b)至步骤(e)相比，在单个容器中进行步骤(b)至步骤(e)使得每个切除的肿瘤的til产量增加。在一些实施方式中，在步骤(d)的第二阶段期间，在不打开系统的情况下将抗原呈递细胞添加到til中。在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，治疗性til群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出选自下组的一种以上特征：cd27+表达、cd28+表达、端粒更长、cd57表达增加和cd56表达降低。在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，获自第三til群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出：cd57表达增加和cd56表达降低。在一些实施方式中，与开放系统相比，所述方法降低了微生物污染的风险。在一些实施方式中，将来自步骤(f)的til输注到患者体内。在一些实施方式中，多个碎片包括约4个碎片。在一些实施方式中，将4个碎片置于g-rex-100中。在一些实施方式中，4个碎片的直径为约0.5cm。在一些实施方式中，将4个碎片置于g-rex-100中。在一些实施方式中，4个碎片的直径为约0.1cm、0.2cm、0.3cm、0.4cm、0.5cm、0.6cm、0.7cm、0.8cm、0.9cm或1cm。在一些实施方式中，4个碎片的直径为约0.1cm、0.2cm、0.3cm、0.4cm、0.5cm、0.6cm、0.7cm、0.8cm、0.9cm或1cm且置于g-rex-100中。在一些实施方式中，4个碎片的直径为约0.1cm、0.2cm、0.3cm、0.4cm、0.5cm、0.6cm、0.7cm、0.8cm、0.9cm或1cm且置于与g-rex-100等体积的容器中。在一些实施方式中，4个碎片的直径为约0.5cm且置于g-rex-100中。在一些实施方式中，4个碎片的直径为约0.5cm且置于与g-rex-100等体积的容器中。下文提供了步骤(a)、(b)、(c)、(d)、(e)和(f)的进一步细节，包括例如但不限于在“步骤a：获得患者肿瘤样品”、“步骤b：第一次扩增”、“步骤c：第一次扩增向第二次扩增的转变”、“步骤d：第二次扩增”、“步骤e：收获til”以及“步骤f：最终制剂/转移至输液袋”标题下描述的实施方式。在一些实施方式中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(til)，包括以下步骤：(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，从患者切除的肿瘤中获得第一til群；(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；(c)通过在包含il-2的细胞培养基中培养第一til群进行第一次扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)通过向第二til群的细胞培养基中补充另外的il-2、okt-3和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；其中，第三til群是治疗性til群，相对于第二til群，该治疗性til群包含增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)收获从步骤(d)获得的治疗性til群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；(f)将从步骤(e)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；(g)可选地，使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的til群的输液袋；以及(h)给患者施用治疗有效剂量的第三til群，该第三til群来自步骤(g)的输液袋。在一些实施方式中，本发明提供了用于治疗癌症的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(til)群；其中，该群可由包括以下步骤的方法获得：(b)将肿瘤碎片加入封闭的系统中；其中，肿瘤碎片包含第一til群；(c)通过在包含il-2的细胞培养基中培养第一til群进行第一次扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)通过向第二til群的细胞培养基中补充另外的il-2、okt-3和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；其中，第三til群是治疗性til群，相对于第二til群，该治疗性til群包含增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)收获从步骤(d)获得的治疗性til群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(f)将从步骤(e)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(g)可选地，使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的til群的输液袋。在一些实施方式中，可获得该群的方法还包括以下步骤作为第一步骤：(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，从自患者切除的肿瘤中获得第一til群。在一个实施方式中，该方法是体外或者离体方法。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(f)中的任何一个都包括本文所公开的一个以上特征，例如在“步骤a：获得患者肿瘤样品”、“步骤b：第一次扩增”、“步骤c：第一次扩增向第二次扩增的转变”、“步骤d：第二次扩增”、“步骤e：收获til”以及“步骤f：最终制剂/转移至输液袋”标题下公开的一个以上特征。在一些实施方式中，步骤(g)包括本文公开的一个以上特征，例如在“步骤h：可选的til的冷冻保存”标题下公开的一个以上特征。在一些实施方式中，步骤(h)包括本文公开的一个以上特征，例如在“步骤f：1、药物组合物、剂量和施用方案”标题下公开的一个以上特征。在一些实施方式中，在步骤(e)收获的治疗性til群包含足以达到til在步骤(h)中施用的治疗有效剂量的til。在一些实施方式中，足以达到til在步骤(h)中施用的治疗有效剂量的til的数量为约2.3×1010至约13.7×1010。在一些实施方式中，抗原呈递细胞(apc)是pbmc。在一些实施方式中，在步骤(d)的第9天至14天中的任何一天将pbmc添加到细胞培养基中。在一些实施方式中，在步骤(h)中施用治疗有效剂量的til细胞之前，已给患者施用了非清髓性淋巴细胞耗竭方案。在一些实施方式中，提供了用于治疗癌症的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(til)群，并与非清髓性淋巴细胞耗竭方案组合。在一些实施方式中，在施用治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(til)群之前，施用非清髓性淋巴细胞耗竭方案。在一些实施方式中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续5天。在一些实施方式中，在步骤(h)中给患者施用til细胞后的第二天开始用高剂量il-2方案治疗患者的步骤。在一些实施方式中，提供了用于治疗癌症的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(til)群，并与非清髓性淋巴细胞耗竭方案组合。在一些实施方式中，在治疗性til细胞群施用后的第二天开始高剂量il-2方案在一些实施方式中，高剂量il-2方案包括每8小时以15分钟静脉推注方式施用600,000iu/kg或720,000iu/kg，直至耐受。在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，治疗性til群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出选自下组的一种以上特征：cd27+表达、cd28+表达、端粒更长、cd57表达增加和cd56表达降低。在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，治疗性til群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出：cd57表达增加和cd56表达降低。本公开还提供了将肿瘤浸润淋巴细胞(til)扩增为治疗性til群的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将来自患者切除肿瘤的经处理的肿瘤碎片加入封闭系统中，获得第一til群；(b)通过在包含il-2的细胞培养基中培养第一til群进行第一次扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(a)到步骤(b)的转变在不打开系统的情况下发生；(c)通过向第二til群的细胞培养基补充另外的il-2、okt-3和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；其中，第三til群是治疗性til群，相对于第二til群，该治疗性til群包含增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)收获从步骤(c)获得的治疗性til群；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(e)将从步骤(d)收获的til群转移至输液袋，其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生。在一些实施方式中，在步骤(d)中收获的治疗性til群包含足以达到til的治疗有效剂量的til。在一些实施方式中，足以达到治疗有效剂量的til的数量为约2.3×1010至约13.7×1010。在一些实施方式中，该方法还包括以下步骤：使用冷冻保存方法冷冻保存包含收获的til群的输液袋。在一些实施方式中，冷冻保存方法使用1：1比率的收获的til群与cs10培养基进行。在一些实施方式中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(til)，包括以下步骤：(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，从患者切除的肿瘤中获得第一til群；(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；(c)通过在包含il-2的细胞培养基中培养第一til群进行第一次扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)通过向第二til群的细胞培养基中补充另外的il-2、okt-3和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；其中，第三til群是治疗性til群，相对于第二til群，该治疗性til群包含增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)收获从步骤(d)获得的治疗性til群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(f)将从步骤(e)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；(g)可选地，使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的til群的输液袋；以及(h)给患者施用治疗有效剂量的第三til群，该第三til群来自步骤(g)的输液袋。其中，在步骤(a)至步骤(h)的任何步骤中，不进行til群的选择。在一个实施方式中，在进行步骤(d)的第二次扩增之前，不进行基于表型的第二til群(pre-rep群)的选择。在一个实施方式中，在步骤(a)至步骤(h)中的任何步骤中，不进行基于cd8表达的第一til群、第二til群、第三til群或收获的til群的选择。在一些实施方式中，本公开提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(til)，包括以下步骤：(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，从患者切除的肿瘤中获得第一til群；(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；(c)通过在包含il-2的细胞培养基中培养第一til群进行第一次扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)通过向第二til群的细胞培养基中补充另外的il-2、okt-3和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；其中，第三til群是治疗性til群，相对于第二til群，该治疗性til群包含增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)收获从步骤(d)获得的治疗性til群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(f)将从步骤(e)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；(g)使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的til群的输液袋；其中，所述冷冻保存方法包括将冷冻保存培养基与收获的til群混合；(h)给患者施用治疗有效剂量的第三til群，该第三til群来自步骤(g)的输液袋。其中，在步骤(a)至步骤(h)的任何步骤中，不进行til群的选择。在一个实施方式中，在进行步骤(d)的第二次扩增之前，不进行基于表型的第二til群(例如pre-rep群)的选择。在一个实施方式中，在步骤(a)至步骤(h)中的任何步骤中，不进行基于cd8表达的第一til群、第二til群、第三til群或收获的til群的选择。在一些实施方式中，在施用收获的til群之前，施用非清髓性淋巴细胞耗竭方案。在一些实施方式中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续2天，然后以25mg/m2的剂量施用氟达拉滨持续5天。在一些实施方式中，抗原呈递细胞是外周血单核细胞(pbmc)。在一些实施方式中，pbmc是经辐照且同种异体的。在一些实施方式中，在步骤(c)的第9天至14天中的任何一天将pbmc添加到细胞培养基中。在一些实施方式中，抗原呈递细胞是人工抗原呈递细胞。在一些实施方式中，使用lovo细胞处理系统进行步骤(d)中的收获。在一些实施方式中，该方法包括通过lovo细胞处理系统(例如freseniuskabi制造的lovo系统)进行步骤(d)中的收获。术语“lovo细胞处理系统”还指任何供应商制造的可在无菌和/或封闭系统环境中将包含细胞的溶液泵送通过膜或者过滤器(例如旋转膜或者旋转过滤器)的任何仪器或者设备，其允许连续流动和细胞处理以除去上清液或不含沉淀的细胞培养基。在一些情况下，细胞处理系统可以在封闭的无菌系统中进行细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其他细胞处理步骤。在一些实施方式中，肿瘤碎片是多个碎片，并且包含约4个至约50个碎片；其中，每个碎片的体积为约27mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约30个至约60个碎片，碎片总体积为约1300mm3至约1500mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总体积为约1350mm3。在一些实施方式中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总质量为约1克至约1.5克。在一些实施方式中，多个碎片包括约4个碎片。在一些实施方式中，将4个碎片置于g-rex-100中。在一些实施方式中，4个碎片的直径为约0.1cm、0.2cm、0.3cm、0.4cm、0.5cm、0.6cm、0.7cm、0.8cm、0.9cm或1cm。在一些实施方式中，4个碎片的直径为约0.1cm、0.2cm、0.3cm、0.4cm、0.5cm、0.6cm、0.7cm、0.8cm、0.9cm或1cm且置于g-rex-100中。在一些实施方式中，4个碎片的直径为约0.1cm、0.2cm、0.3cm、0.4cm、0.5cm、0.6cm、0.7cm、0.8cm、0.9cm或1cm且置于与g-rex-100等体积的容器中。在一些实施方式中，4个碎片的直径为约0.5cm且置于g-rex-100中。在一些实施方式中，4个碎片的直径为约0.5cm且置于与g-rex-100等体积的容器中。在一些实施方式中，在选自g容器和xuri细胞袋的容器中提供细胞培养基。在一些实施方式中，步骤(e)中的输液袋是含有hypothermosol的输液袋。在一些实施方式中，步骤(b)中的第一阶段和步骤(c)中的第二阶段各自在10天、11天或12天内进行。在一些实施方式中，步骤(b)中的第一阶段和步骤(c)中的第二阶段各自在11天内进行。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(e)进行约25天至约30天。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(e)进行约20天至约25天。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(e)进行约20天至约22天。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(e)进行22天以下。在一些实施方式中，步骤(a)至步骤(e)和冷冻保存进行22天以下。在一些实施方式中，步骤(b)至步骤(e)在单个容器中进行；其中，与在超过一个的容器中进行步骤(b)至步骤(e)相比，在单个容器中进行步骤(b)至步骤(e)使得每个切除的肿瘤的til产量增加。在一些实施方式中，在步骤(c)的第二阶段期间，在不打开系统的情况下将抗原呈递细胞添加到til中。在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，治疗性til群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出选自下组的一种以上特征：cd27+表达、cd28+表达、端粒更长、cd57表达增加和cd56表达降低。在一些实施方式中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，治疗性til群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出：cd57表达增加和cd56表达降低。在一些实施方式中，与开放系统相比，所述方法降低了微生物污染的风险。在一些实施方式中，将来自步骤(e)的til输注到患者体内。在一些实施方式中，封闭容器包括单个生物反应器。在一些实施方式中，封闭容器包括g-rex-10。在一些实施方式中，封闭容器包括g-rex-100。vi、其他示例性实施方式1.将肿瘤浸润淋巴细胞(til)扩增为治疗性til群的方法，其中，所述方法包括：(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，从患者切除的肿瘤中获得第一til群；(b)将肿瘤碎片添加到封闭系统中；(c)通过在包含il-2和可选的okt-3的细胞培养基中培养第一til群进行第一次扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)通过向第二til群的细胞培养基中补充另外的il-2、可选的okt-3和抗原呈递细胞(apc)来进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；其中，第三til群是治疗性til群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)收获从步骤(d)获得的治疗性til群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(f)将从步骤(e)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生。2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括以下步骤：使用冷冻保存方法冷冻保存步骤(f)中包含收获的til群的输液袋。3.根据权利要求1所述的方法，其中，冷冻保存方法使用1：1比率的收获的til群与冷冻保存培养基进行。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗原呈递细胞是外周血单核细胞(pbmc)。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述pbmc是经辐照且同种异体的。6.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤(d)的第9天至14天中的任何一天将pbmc添加到细胞培养基中。7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述抗原呈递细胞是人工抗原呈递细胞。8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(e)中的收获使用基于膜的细胞处理系统进行。9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(e)中的收获使用lovo细胞处理系统进行。10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多个碎片包括约4个至约50个碎片，其中，每个碎片的体积为约27mm3。11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多个碎片包括约30个至约60个碎片，碎片总体积为约1300mm3至约1500mm3。12.根据权利要求9所述的方法，其中，所述多个碎片包括约50个碎片，碎片总体积为约1350mm3。13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多个碎片包括约50个碎片，碎片总质量为约1克至约1.5克。14.根据权利要求1所述的方法，其中，在选自g容器和xuri细胞袋的容器中提供细胞培养基。15.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(d)中的细胞培养基还包含il-15和/或il-21。16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，il-2浓度为约10,000iu/ml至约5,000iu/ml。17.根据权利要求15所述的方法，其中，il-15浓度为约500iu/ml至约100iu/ml。18.根据权利要求1所述的方法，其中，il-21浓度为约20iu/ml至约0.5iu/ml。19.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(f)中的输液袋是含有hypothermosol的输液袋。20.根据权利要求3所述的方法，其中，所述冷冻保存培养基包含二甲基亚砜(dmso)。21.根据权利要求17所述的方法，其中，所述冷冻保存培养基包含7％至10％的dmso。22.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(c)中的第一阶段和步骤(e)中的第二阶段各自在10天、11天或12天内进行。23.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(c)中的第一阶段和步骤(e)中的第二阶段各自在11天内进行。24.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行约10天至约22天。25.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行约20天至约22天。26.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行约15天至约20天。27.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行约10天至约20天。28.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行约10天至约15天。29.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行22天以下。30.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行20天以下。31.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行15天以下。32.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行10天以下。33.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)和冷冻保存进行22天以下。34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中，在步骤(e)中收获的治疗性til群包含足以达到til的治疗有效剂量的til。35.根据权利要求34所述的方法，其中，足以达到治疗有效剂量的til的数量为约2.3×1010至约13.7×1010。36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中，步骤(b)至步骤(e)在单个容器中进行；其中，与在超过一个的容器中进行步骤(b)至步骤(e)相比，在单个容器中进行步骤(b)至步骤(e)使得每个切除的肿瘤的til产量增加。37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中，在步骤(d)的第二阶段期间，在不打开系统的情况下将抗原呈递细胞添加到til中。38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中，当给受试者施用时，步骤(d)中的第三til群提供增加的疗效、增加的干扰素-γ产量、增加的多克隆性、增加的平均ip-10和/或增加的平均mcp-1。39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其中，步骤(d)中的第三til群提供至少5倍以上的干扰素-γ产量。40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中，步骤(d)中的第三til群是治疗性til群，相对于第二til群，该治疗性til群包含增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，获自治疗性til群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出选自下组的一种以上特征：cd27+表达、cd28+表达、端粒更长、cd57表达增加和cd56表达降低。41.根据权利要求1至40中任一项所述的方法，其中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，获自第三til群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出：cd57表达增加和cd56表达降低。42.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其中，与开放系统相比，所述方法降低了微生物污染的风险。43.根据权利要求1至42中任一项所述的方法，其中，将来自步骤(g)的til输注到患者体内。44.根据权利要求1至43中任一项所述的方法，其中，所述多个碎片包括约4个碎片。45.治疗患有癌症的受试者的方法，其中，所述方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(til)，包括以下步骤：(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，从患者切除的肿瘤中获得第一til群；(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；(c)通过在包含il-2和可选的okt-3的细胞培养基中培养第一til群进行第一次扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；所述第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；所述第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)通过向第二til群的细胞培养基中补充另外的il-2、okt-3和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；所述第三til群是治疗性til群；所述第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)收获从步骤(d)获得的治疗性til群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；(f)将从步骤(e)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；(g)可选地，使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的til群的输液袋；以及(h)给患者施用治疗有效剂量的第三til群，所述第三til群来自步骤(g)的输液袋。46.根据权利要求45所述的方法，其中，在步骤(e)收获的治疗性til群包含足以达到til在步骤(h)中施用的治疗有效剂量的til。47.根据权利要求46所述的方法，其中，足以达到til在步骤(h)中施用的治疗有效剂量的til的数量为约2.3×1010至约13.7×1010。48.根据权利要求47所述的方法，其中，所述抗原呈递细胞(apc)是pbmc。49.根据权利要求48所述的方法，其中，在步骤(d)的第9天至14天中的任何一天将pbmc添加到细胞培养基中。50.根据权利要求45至49中任一项所述的方法，其中，在步骤(h)中施用治疗有效剂量的til细胞之前，已给所述患者施用了非清髓性淋巴细胞耗竭方案。51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括如下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续5天。52.根据权利要求45至51中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括如下步骤：在步骤(h)中给患者施用til细胞后的第二天开始用高剂量il-2方案治疗患者。53.根据权利要求52所述的方法，其中，所述高剂量il-2方案包括每8小时以15分钟静脉推注方式施用600,000iu/kg或720,000iu/kg，直至耐受。54.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(d)中的第三til群是治疗性til群，相对于第二til群，所述治疗性til群包含增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，所述治疗性til群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出选自下组的一种以上特征：cd27+表达、cd28+表达、端粒更长、cd57表达增加和cd56表达降低。55.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，所述治疗性til群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出：cd57表达增加和cd56表达降低。56.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述癌症选自：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(nsclc)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌hnscc)、肾癌和肾细胞癌。57.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述癌症选自黑色素瘤、hnscc、宫颈癌和nsclc。58.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述癌症是黑色素瘤。59.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述癌症是hnscc。60.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述癌症是宫颈癌。61.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述癌症是nsclc。62.将肿瘤浸润淋巴细胞(til)扩增为治疗性til群的方法，其中，所述方法包括以下步骤：(a)将来自患者切除的肿瘤的经处理的肿瘤碎片加入封闭系统中，获得第一til群；(b)通过在包含il-2和可选的okt-3的细胞培养基中培养第一til群进行第一次扩增增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；所述第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；所述第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；从步骤(a)到步骤(b)的转变在不打开系统的情况下发生；(c)通过向第二til群的细胞培养基补充另外的il-2、okt-3和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；所述第三til群是治疗性til群；所述第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)收获从步骤(c)获得的治疗性til群；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(e)将从步骤(d)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生。63.根据权利要求62所述的方法，其中，在步骤(d)收获的治疗性til群包含足以达到til的治疗有效剂量的til。64.根据权利要求63所述的方法，其中，足以达到治疗有效剂量的til的数量为约2.3×1010至约13.7×1010。65.根据权利要求64所述的方法，其中，所述方法还包括以下步骤：使用冷冻保存方法冷冻保存包含收获的til群的输液袋。66.根据权利要求65所述的方法，其中，所述冷冻保存方法使用1：1比率的收获的til群与冷冻保存培养基进行。67.根据权利要求62所述的方法，其中，所述抗原呈递细胞是外周血单核细胞pbmc。68.根据权利要求67所述的方法，其中，所述pbmc是经辐照且同种异体的。69.根据权利要求68上述的方法，其中，在步骤(c)的第9天至14天中的任何一天将pbmc添加到细胞培养基中。70.根据权利要求62所述的方法，其中，所述抗原呈递细胞是人工抗原呈递细胞。71.根据权利要求62所述的方法，其中，步骤(d)中的收获使用lovo细胞处理系统进行。72.根据权利要求62所述的方法，其中，多个碎片包括约4个至约50个碎片，每个碎片的体积为约27mm3。73.根据权利要求62所述的方法，其中，多个碎片包括约30个至约60个碎片，碎片总体积为约1300mm3至约1500mm3。74.根据权利要求63所述的方法，其中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总体积为约1350mm3。75.根据权利要求62所述的方法，其中，多个碎片包括约50个碎片，碎片总质量为约1克至约1.5克。76.根据权利要求62所述的方法，其中，多个碎片包括约4个碎片。77.根据权利要求62所述的方法，其中，在选自g-容器和xuri细胞袋的容器中提供第二细胞培养基。78.根据权利要求62所述的方法，其中，步骤(e)中的输液袋是含有hypothermosol的输液袋。79.根据权利要求62所述的方法，其中，步骤(b)中的第一阶段和步骤(c)中的第二阶段各自在10天、11天或12天内进行。80.根据权利要求62所述的方法，其中，步骤(b)中的第一阶段和步骤(c)中的第二阶段各自在11天内进行。81.根据权利要求62所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(e)进行约10天至约22天。82.根据权利要求62所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(e)进行约10天至约20天。83.根据权利要求62所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(e)进行约10天至约15天。84.根据权利要求62所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(e)进行22天以下。85.根据权利要求65所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(e)和冷冻保存进行22天以下。86.根据权利要求62至85中任一项所述的方法，其中，步骤(b)至步骤(e)在单个容器中进行；与在超过一个的容器中进行步骤(b)至步骤(e)相比，在单个容器中进行步骤(b)至步骤(e)使得每个切除的肿瘤的til产量增加。87.根据权利要求62至86中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)的第二阶段期间，在不打开系统的情况下将抗原呈递细胞添加到til中。88.根据权利要求62至87中任一项所述的方法，其中，步骤(d)中的第三til群是治疗性til群，相对于第二til群，所述治疗性til群包含增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，获自治疗性til群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出选自下组的一种以上特征：cd27+表达、cd28+表达、端粒更长、cd57表达增加和cd56表达降低。89.根据权利要求62至88中任一项所述的方法，其中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，获自治疗性til群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出：cd57表达增加和cd56表达降低。90.根据权利要求62至89中任一项所述的方法，其中，与开放系统相比，所述方法降低了微生物污染的风险。91.根据权利要求62至90中任一项所述的方法，其中，将来自步骤(e)的til输注到患者体内。92.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述封闭容器包括单个生物反应器。93.根据权利要求92所述的方法，其中，所述封闭容器包括g-rex-10。94.根据权利要求92所述的方法，其中，所述封闭容器包括g-rex-100。95.根据权利要求1至61中任一项所述的方法，其中，在步骤(d)中，以apc：til为25：1至100：1的比率，将抗原呈递细胞(apc)加到第二til群的细胞培养基中。96.根据权利要求95所述的方法，其中，所述细胞培养基具有2.5×109apc：100×106til的比率。97.根据权利要求62至94中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)中，以apc：til为25：1至100：1的比率，将抗原呈递细胞(apc)加到第二til群的细胞培养基中。98.根据权利要求97所述的方法，其中，所述细胞培养基具有2.5×109apc：100×106til的比率。99.用于治疗患有癌症的受试者的扩增的til群；其中，所述扩增的til群是可通过包括以下步骤的方法获得的第三til群：(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，从患者切除的肿瘤中获得第一til群；(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；(c)通过在包含il-2和可选的okt-3的细胞培养基中培养第一til群进行第一次扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；所述第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；所述第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)通过向第二til群的细胞培养基中补充另外的il-2、okt-3和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；所述第三til群是治疗性til群；所述第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)收获从步骤(d)获得的治疗性til群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；(f)将从步骤(e)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(g)可选地，使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的til群的输液袋。100.根据权利要求99所述的用于治疗患有癌症的受试者的til群；其中，所述方法还包括权利要求1至99中任一项所述的一个以上特征。101.将肿瘤浸润淋巴细胞(til)扩增为治疗性til群的方法，其中，所述方法包括：(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，从患者切除的肿瘤中获得第一til群；(b)将肿瘤碎片添加到封闭系统中；(c)通过在包含il-2、可选的okt-3和可选的肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)激动剂的细胞培养基中培养第一til群来进行第一扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；其中，第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)通过向第二til群的细胞培养基中补充另外的il-2、可选的okt-3、可选的肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)激动剂和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；其中，第三til群是治疗性til群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)收获从步骤(d)获得的治疗性til群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(f)将从步骤(e)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生。102.根据权利要求101所述的方法，所述方法还包括以下步骤：使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的til群的输液袋。103.根据权利要求101所述的方法，其中，使用收获的til群与冷冻保存培养基的比率为1：1进行冷冻保存过程。104.根据权利要求101所述的方法，其中，所述抗原呈递细胞是外周血单核细胞(pbmc)。105.根据权利要求104所述的方法，其中，所述pbmc是经辐照且同种异体的。106.根据权利要求104所述的方法，其中，在步骤(d)的第9天至14天中的任何一天将pbmc添加到细胞培养基中。107.根据权利要求101所述的方法，其中，所述抗原呈递细胞是人工抗原呈递细胞。108.根据权利要求101所述的方法，其中，步骤(e)中的收获使用基于膜的细胞处理系统进行。109.根据权利要求101所述的方法，其中，步骤(e)中的收获使用lovo细胞处理系统进行。110.根据权利要求101所述的方法，其中，所述多个碎片包括约4个至约50个碎片，其中，每个碎片的体积为约27mm3。111.根据权利要求101所述的方法，其中，所述多个碎片包括约30个至约60个碎片，碎片总体积为约1300mm3至约1500mm3。112.根据权利要求109的方法，其中，所述多个碎片包括约50个碎片，碎片总体积为约1350mm3。113.根据权利要求101所述的方法，其中，所述多个碎片包括约50个碎片，碎片总质量为约1克至约1.5克。114.根据权利要求101所述的方法，其中，在选自g容器和xuri细胞袋的容器中提供细胞培养基。115.根据权利要求101所述的方法，其中，步骤(d)中的细胞培养基还包含il-15和/或il-21。116.根据权利要求101至115中任一项所述的方法，其中，il-2浓度为约10,000iu/ml至约5,000iu/ml。117.根据权利要求115所述的方法，其中，il-15浓度为约500iu/ml至约100iu/ml。118.根据权利要求101所述的方法，其中，il-21浓度为约20iu/ml至约0.5iu/ml。119.根据权利要求101所述的方法，其中，步骤(f)中的输液袋是含有hypothermosol的输液袋。120.根据权利要求103所述的方法，其中，所述冷冻保存培养基包括二甲基亚砜(dmso)。121.根据权利要求117的方法，其中，所述冷冻保存培养基包含7％至10％的dmso。122.根据权利要求101所述的方法，其中，步骤(c)中的第一阶段和步骤(e)中的第二阶段各自在10天、11天或12天内进行。123.根据权利要求101所述的方法，其中，步骤(c)中的第一阶段和步骤(e)中的第二阶段各自在11天内进行。124.根据权利要求101所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行约10天至约22天。125.根据权利要求101所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行约20天至约22天。126.根据权利要求101所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行约15天至约20天。127.根据权利要求101所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行约10天至约20天。128.根据权利要求101所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行约10天至约15天。129.根据权利要求101所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行22天以下。130.根据权利要求101所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行20天以下。131.根据权利要求101所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行15天以下。132.根据权利要求101所述的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)进行10天以下。133.根据权利要求102的方法，其中，步骤(a)至步骤(f)和冷冻保存进行22天以下。134.根据权利要求101至133中任一项所述的方法，其中，在步骤(e)中收获的治疗性til群包含足以达到til的治疗有效剂量的til。135.根据权利要求134所述的方法，其中，足以达到治疗有效剂量的til的数量为约2.3×1010至约13.7×1010。136.根据权利要求101至135中任一项所述的方法，其中，步骤(b)至步骤(e)在单个容器中进行；其中，与在超过一个的容器中进行步骤(b)至步骤(e)相比，在单个容器中进行步骤(b)至步骤(e)使得每个切除的肿瘤的til产量增加。137.根据权利要求101至136中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)激动剂是4-1bb抗体。138.根据权利要求101至137中任一项所述的方法，其中，在步骤(d)的第二阶段期间，在不打开系统的情况下将抗原呈递细胞添加到til中。139.根据权利要求101至138中任一项所述的方法，其中，当给受试者施用时，步骤(d)中的第三til群提供增加的疗效、增加的干扰素-γ产量、增加的多克隆性、增加的平均ip-10和/或增加的平均mcp-1。140.根据权利要求101至139中的任一项所述的方法，其中，步骤(d)中的第三til群提供至少5倍以上的干扰素-γ产量。141.根据权利要求101至140中任一项所述的方法，其中，步骤(d)中的第三til群是治疗性til群，相对于第二til群，该治疗性til群包含增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，获自治疗性til群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出选自下组的一种以上特征：cd27+表达、cd28+表达、端粒更长、cd57表达增加和cd56表达降低。142.根据权利要求101至141中任一项所述的方法，其中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，获自第三til群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出：cd57表达增加和cd56表达降低。143.根据权利要求101至142中任一项所述的方法，其中，与开放系统相比，所述方法降低了微生物污染的风险。144.根据权利要求101至143中任一项所述的方法，其中，将来自步骤(g)的til输注到患者体内。145.根据权利要求101至144中任一项所述的方法，其中，所述多个碎片包括约4个碎片。146.治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(til)，其中，所述方法包括：(a)通过将从患者获得的肿瘤样品处理成多个肿瘤碎片，从受试者切除的肿瘤中获得第一til群；(b)将肿瘤碎片加入封闭系统中；(c)通过在包含il-2、可选的okt-3和可选的肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)激动剂的细胞培养基中培养第一til群来进行第一扩增，产生第二til群；其中，第一次扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行；其中，第一次扩增进行约3天至14天，获得第二til群；其中，所述第二til群的数量比第一til群的数量高至少50倍；其中，从步骤(b)到步骤(c)的转变在不打开系统的情况下发生；(d)通过向第二til群的细胞培养基中补充另外的il-2、可选的okt-3、可选的肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)激动剂和抗原呈递细胞(apc)进行第二次扩增，产生第三til群；其中，第二次扩增进行约7天至14天，获得第三til群；其中，第三til群是治疗性til群；其中，第二次扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行；其中，从步骤(c)到步骤(d)的转变在不打开系统的情况下发生；(e)收获从步骤(d)获得的治疗性til群；其中，从步骤(d)到步骤(e)的转变在不打开系统的情况下发生；以及(f)将从步骤(e)收获的til群转移至输液袋；其中，从步骤(e)到步骤(f)的转变在不打开系统的情况下发生；(g)可选地，使用冷冻保存方法冷冻保存来自步骤(f)的包含收获的til群的输液袋；以及(h)给患者施用治疗有效剂量的第三til群，所述第三til群来自步骤(g)的输液袋。147.根据权利要求146所述的方法，其中，在步骤(e)中收获的治疗性til群包含足以达到til在步骤(h)中施用的治疗有效剂量的til。148.根据权利要求147所述的方法，其中，足以达到til在步骤(h)中施用的治疗有效剂量的til的数量为约2.3×1010至约13.7×1010。149.根据权利要求148所述的方法，其中，所述抗原呈递细胞(apc)是pbmc。150.根据权利要求149的方法，其中，在步骤(d)的第9天至14天中的任何一天将pbmc添加到细胞培养基中。151.根据权利要求146至150中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)激动剂是4-1bb抗体。152.根据权利要求146至151中任一项所述的方法，其中，在步骤(h)中施用治疗有效剂量的til细胞之前，已给患者施用了非清髓性淋巴细胞耗竭方案。153.根据权利要求152所述的方法，其中，所述非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺持续2天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨持续5天。154.根据权利要求146至153中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括以下步骤：在步骤(h)中给患者施用til细胞后的第二天开始用高剂量il-2方案治疗患者。155.根据权利要求154所述的方法，其中，所述高剂量il-2方案包括每8小时以15分钟静脉推注方式施用600,000iu/kg或720,000iu/kg，直至耐受。156.根据权利要求146至155中任一项所述的方法，其中，步骤(d)中的第三til群是治疗性til群，相对于第二til群，该治疗性til群包含增加的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞的亚群；其中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，获自治疗性til群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出选自下组的一种以上特征：cd27+表达、cd28+表达、端粒更长、cd57表达增加和cd56表达降低。157.根据权利要求146至156中任一项所述的方法，其中，相对于获自第二细胞群的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞，所述治疗性til群中的效应t细胞和/或中枢记忆t细胞表现出：cd57表达增加和cd56表达降低。158.根据权利要求146至157中任一项所述的方法，其中，所述癌症选自：黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(nsclc)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌hnscc)、肾癌和肾细胞癌。159.根据权利要求146至158中任一项所述的方法，其中，所述癌症选自黑色素瘤、hnscc、宫颈癌和nsclc。160.根据权利要求146至159中任一项所述的方法，其中，所述癌症是黑色素瘤。161.根据权利要求146至160中任一项所述的方法，其中，所述癌症是hnscc。162.根据权利要求146至161中任一项所述的方法，其中，所述癌症是宫颈癌。163.根据权利要求146至162中任一项所述的方法，其中，所述癌症是nsclc。164.冷冻保存组合物，其中，所述冷冻组合物包含前述权利要求中任一项所述的til群、包含二甲基亚砜(dmso)的冷冻保护剂和电解质溶液。165.根据权利要求164所述的冷冻保存组合物，其中，所述冷冻组合物还包含一种以上稳定剂和一种以上淋巴细胞生长因子。166.根据权利要求165所述的冷冻保存组合物，其中，所述一种以上稳定剂包含人血清白蛋白(hsa)，所述一种以上淋巴细胞生长因子包含il-2。167.根据权利要求166所述的冷冻保存组合物，其中，所述组合物可选地包含okt-3。168.根据权利要求164所述的冷冻保存组合物，其中，所述包含dmso的冷冻保护剂和电解质溶液以约1.1：1至约1：1.1的比率存在。169.根据权利要求168所述的冷冻保存组合物，其中，所述包含dmso的冷冻保护剂和电解质溶液以约1：1的比率存在。170.根据权利要求164所述的冷冻保存组合物，其中，100ml的所述组合物包含：约1×106至约9×1014的til群；约30ml至约70ml的包含dmso的冷冻保护剂；约30ml至约70ml的电解质溶液；约0.1g至约1.0g的hsa；约0.001mg至约0.005mg的il-2。171.根据权利要求164所述的冷冻保存组合物，其中，100ml的所述组合物包含：约1×107至约1×1011的til群；约30ml至约70ml的冷冻保护剂，其中所述冷冻保护剂包含约10％的dmso；约30ml至约70ml的电解质溶液；约0.3g至约0.7g的hsa和约0.001mg至约0.003mg的il-2。172.根据权利要求164所述的冷冻保存组合物，其中，100ml的所述组合物基本上由以下组分组成：约1×107至约1×1011的til群；约30ml至约70ml的冷冻保护剂，其中所述冷冻保护剂基本上由约10％的dmso组成；约30ml至约70ml的电解质溶液；约0.3g至约0.7g的hsa和约0.001mg至约0.003mg的il-2。173.根据权利要求164所述的冷冻保存组合物，其中，所述组合物用于治疗患有癌症的受试者。174.冷冻保存组合物，所述冷冻保存组合物包含til群、包含二甲基亚砜(dmso)的冷冻保护剂和电解质溶液；其中，100ml的所述组合物包含：约1×107至约1×1011的til群；约30ml至约70ml的冷冻保护剂，其中所述冷冻保护剂包含约10％的dmso；约30ml至约70ml的电解质溶液；约0.3g至约0.7g的hsa和约0.001mg至约0.003mg的il-2。175.冷冻保存组合物，所述冷冻保存组合物基本上由til群、包含二甲基亚砜(dmso)的冷冻保护剂和电解质溶液组成；其中，100ml的所述组合物基本上由以下组分组成：约1×107至1×1011的til群；约30ml至约70ml的冷冻保护剂，其中所述冷冻保护剂基本上由约10％的dmso组成；约30ml至约70ml的电解质溶液；约0.3g至约0.7g的hsa和约0.001mg至约0.003mg的il-2。176.输液袋，其中，所述输液袋包含权利要求164至175中任一项所述的冷冻保存组合物。177.根据权利要求176所述的输液袋，其中，所述输液袋是含有hypothermosol的输液袋。178.储存袋，其中，所述储存袋包含权利要求164至175中任一项所述的冷冻保存组合物。179.根据权利要求178所述的储存袋，其中，所述储存袋是cryostorecs750冻存袋。实施例现在参考以下实施例描述本文包括的实施方式。提供这些实施例仅用于说明的目的，并且本文包括的公开内容决不应被解释为限于这些实施例，而是应该被解释为包括由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。实施例1：封闭系统实验如本文所讨论，开发了在封闭系统中由患者肿瘤产生til的方案和实验。本实施例描述了一种在g-rex装置中由患者切除的肿瘤组织产生临床上相关数量的til并冷冻保存最终细胞产物的新型简化程序。实施例2至8中描述了此过程的其他方面。定义/缩写bsc：生物安全柜℃：摄氏度co2：二氧化碳cd3：分化簇3cm1：完全培养基1cm2：完全培养基2tiwb：肿瘤分离(tumorisolation)洗涤缓冲液cm4：完全培养基4crf：程序降温仪(controlratefreezer)etoh：乙醇gmp：生产质量管理规范il-2、ril-2：白介素-2、重组人白介素-2，iu：国际单位l：升ln2：液氮ml：毫升μl：微升mm：毫摩尔μm：微米na：不适用pbmc：外周血单核细胞ppe：个人防护装备pre-rep：源自肿瘤碎片的初始til培养rep：快速扩增方案til：肿瘤浸润淋巴细胞tiwb：til分离洗涤缓冲液(tilisolation洗涤缓冲液)sop：标准操作程序程序1.提前准备：第0天(至多提前36小时进行)1.1.通过补充500ml含有50μg/ml庆大霉素的hanks平衡盐溶液来制备til分离洗涤缓冲液(tiwb)。对于10mg/ml的庆大霉素储备溶液，将2.5ml转移至hbss。对于50mg/ml的储备溶液，将0.5ml转移至hbss。1.2.按照用于cm2说明的lab-005“pre-rep和rep的培养基的制备”，使用glutamaxtm来制备cm1培养基。在4℃下储存至多24小时。使用前，使其在37℃下温热至少1小时。1.3.从-20℃冰箱中取出il-2等分试样，将等分试样放入2℃至8℃冰箱中。2.肿瘤组织的接收2.1.保存随肿瘤组织接收的所有文件，并获取运输容器和肿瘤组织的照片。2.2.如果提供了temptale，则打印并保存相关文档；保存pdf。2.3.从托运人处取走肿瘤样品和二次容器(拉链封口袋)，在4℃下保存，直至准备处理为止。2.4未使用的肿瘤在hypothermasol中运送，或者在cryostorcs10中作为冷冻碎片运送，hypothermasol和cryostorcs10均可从biolifesolutions,inc.商购。3.用于til的肿瘤处理3.1.视需要将以下材料无菌转移至bsc，并根据下表3进行标记。表3：用于肿瘤分离的材料3.2.用字母a-j标记“肿瘤碎片”培养皿的圆圈。3.3.用字母a-j标记“良好组织”(favorabletissue)皿的孔底部。3.4.将5ml庆大霉素转移至hbss瓶中。标记为“tiwb”。3.5.漩涡混合。3.6.吸取50mltiwb到以下各个培养皿中：1.“洗涤1”培养皿2.“洗涤2”培养皿3.“洗涤3”培养皿4.“洗涤4”培养皿3.7.吸取2mltiwb至“良好组织”培养皿的a-j孔中。3.8.用相应的“肿瘤碎片”培养皿(6孔板的盖)盖上“良好组织”培养皿(6孔板的底部)。3.9.用长镊子从“样品”瓶中取出肿瘤，然后转移至“洗涤1”培养皿中。3.10.在“洗涤1”培养皿中室温孵育肿瘤3分钟。3.11.孵育期间，将“样品”瓶重新贴上标签“生物负载(bioburden)”，并储存在2℃至8℃下，直至提交“质量控制”进行测试。3.12.丢弃长镊子，并使用短镊子进行进一步操作。3.13.使用镊子将肿瘤转移至“洗涤2”培养皿。3.14.在“洗涤2”培养皿中室温孵育肿瘤3分钟。3.15.使用镊子将肿瘤转移至“洗涤3”培养皿。3.16.在“洗涤3”培养皿中室温孵育肿瘤3分钟。3.17.从“良好组织”培养皿(6孔板的底部)取出“肿瘤碎片”培养皿(6孔板的盖)，然后将“肿瘤碎片”培养皿倒置在bsc表面上。3.18.用移液管将约4滴tiwb均匀间隔地分别滴加到肿瘤碎片培养皿的每个圆圈上。3.19.在“解剖”培养皿下方放置一个标尺。3.20.使用镊子将肿瘤转移至解剖皿。3.21.使用解剖皿下的标尺，测量并记录肿瘤的长度。3.22.对于大于1cm的肿瘤，还要制作另外的“良好组织”培养皿。3.23.在解剖皿中对肿瘤块进行初步解剖，分成10个中间块(intermediatepiece)，并小心保留每个中间块的肿瘤结构。3.24.将未被主动解剖成碎片的任何中间肿瘤碎片转移至“洗涤4”培养皿中，以确保在整个解剖过程中组织保持水分。3.25.一次处理一个中间肿瘤块，在解剖皿中小心地将肿瘤切成3×3×3mm的碎片，并用培养皿下方的标尺作为参考。当解剖刀变钝时，用新的解剖刀代替。3.26.继续从中间肿瘤块解剖碎片，直至中间块中的所有组织均被评估。3.27.选择良好的碎片，并使用移液管将至多4个良好碎片转移至“肿瘤碎片”培养皿中的一个圆圈中的tiwb液滴中。3.28.当方便时，使用移液管将任何剩余的良好碎片从肿瘤块转移至“良好组织”培养皿中相应的孔中。3.29.使用移液管尽可能多地将不良组织和废弃产品转移至“不良组织”培养皿中，以清空解剖皿。不良组织指黄色脂肪组织或者坏死组织。3.30.通过重复步骤7.3.25-7.3.30，继续对剩余的中间肿瘤块进行处理，一次处理一个中间块，直至所有肿瘤均已被处理。3.31.如果“肿瘤碎片”培养皿的相应圆圈中可用肿瘤碎片少于4个，可以使用来自“良好组织”培养皿的非对应孔的碎片以达到40个碎片的目标。当少于40个碎片时，将10至40个碎片放入单个g-rex100m烧瓶中。4.接种g-rex100m烧瓶4.1.视需要，将以下材料无菌转移至bsc，并根据下表4进行标记。表4：接种烧瓶的其他材料项目最小用量处理中标签g-rex100m烧瓶视需要批次#温热的cm1视需要批次#il-2等分试样视需要批次#4.2.向每升cm1中补充1mlil-2储备溶液(6×106iu/ml)。4.3.根据下表5所示，在各个所需的g-rex100m生物反应器中放置1000ml含有6,000iu/mlil-2的预热cm1。4.4.使用移液管转移适当数量的肿瘤碎片至各个g-rex100m烧瓶，按照表5分配碎片。4.5.当转移至g-rex100m烧瓶的一个以上肿瘤碎片漂浮(float)时，从“良好组织”培养皿中获得一个另外的肿瘤碎片(如果有)，将它转移至g-rex100m烧瓶。4.6.记录加到各个烧瓶中的碎片总数。4.7.丢弃“不良组织”培养皿。4.8.将每个g-rex100m生物反应器置于37℃、5％co2恒温箱中。4.9.当有40个以上的碎片可用时：4.9.1.当获得＞41个碎片时，将1000ml预热的完全cm1置于第二个g-rex100m生物反应器中。表5：需要的g-rex生物反应器的数量5.提前准备：第11天(至多提前24小时准备)5.1.用glutamax制备6l的cm2。使用用于cm2说明的参考实验室程序“pre-rep和rep的培养基的制备”。在使用前1小时，在37℃下温热。5.2.解冻il-2等分试样：从冰箱中取出il-2等分试样，置于4℃下。6.收获til(第11天)6.1.从培养箱中小心取出g-rex-100m烧瓶，将其置于bsc2中。小心不要扰动烧瓶底部的细胞。6.2.使用gatherrex或者蠕动泵从烧瓶中吸取约900ml的细胞培养上清液。6.3.轻轻旋动烧瓶以重悬til。观察到所有细胞均已从膜中释放出来。6.4.使用蠕动泵或者gatherrex，将残留的细胞悬液转移至适当尺寸的血液转运包(bloodtransferpack)(300-1000ml)中。注意不要将碎片转移至输血包中。6.5.用4英寸(4")血浆转运装置(transferset)插入转运包(确保夹子已关闭)。6.6.按摩该包，确保细胞悬液充分混合，使用3ml注射器取出1mltil悬液进行细胞计数。用新的无菌鲁尔盖(luercap)夹紧管，重新盖上母鲁尔接头(femaleluerconnector)。6.7.将转运包放入塑料拉链封口袋中，放回培养箱中，直至准备使用。7.制备培养基7.1.使培养基在37℃下温热>1小时。7.2.将3ml的6×106iu/ml的rhil-2储备溶液加到6lcm2中，达到3,000iu/ml的rhil-2终浓度。标签为“完全cm2”。7.3.将带有母鲁尔接头的4"血浆转运装置无菌连接到1l转运包上。7.4.将500ml完全cm2转移至1l转运包中。拆下液体转运装置或注射器，将无菌鲁尔塞连接到母鲁尔端口上。7.5.用取样位点连接器(samplesitecoupler)插入该包。7.6.使用带针头的1.0ml注射器吸取150μl的1mg/ml抗cd3(克隆okt3)，通过取样位点连接器将其转移至500ml“完全cm2”中。抽回注射器，确保已冲洗掉管线上的所有试剂。储存在37℃下，直至使用。8.准备烧瓶8.1.使用烧瓶上的刻度作为参考，将4.5l“完全cm2”转移至g-rex-500m烧瓶中。8.2.将烧瓶放入37℃的培养箱中，直至准备好。9.解冻经辐照的饲养细胞9.1.使用来自两个以上供体的5.0×109个同种异体经辐照的饲养细胞。9.2.从ln2冰箱中取出饲养细胞，将其放入生物危害性转运袋中。9.3.将饲养细胞袋放在生物危害性转运袋中，在37℃培养箱或者恒温珠浴箱(beadbath)中解冻饲养细胞。保持袋子静止并浸没。当饲养细胞几乎完全解冻但仍很冷时，将其从恒温浴中取出。9.4.用70％的乙醇喷洒或者擦拭饲养细胞袋，然后放在bsc2中。将各个饲养细胞袋直接加到开口的g-rex500m中，确保有足够数量的经辐照的细胞(5×109个细胞，+/-20％)。9.5.用公鲁尔锁(maleluerlock)关紧fenwaly型连接器上的两个夹子。9.6.用y型连接器的腿插入每个饲养细胞袋。9.7.取出装有500ml“完全cm2”+okt3的1l转运包，转移至bsc。9.8.将60ml注射器无菌连接到三通旋塞阀，将无菌转运包连接到旋塞阀的公端。9.9.将y型接头无菌连接到三通旋塞阀上。9.10.将饲养细胞袋的全部内容物抽入注射器，记录其体积，然后将5.0×109个同种异体经辐照的饲养细胞注入转运包中。9.11.夹紧转运包，从设备上拆下转运包，用新的无菌鲁尔塞插入母鲁尔锁。9.12.使用针和3ml注射器从取样位点连接器中抽取1ml进行细胞计数。9.13.当达到目标细胞数(5.0×109)的+/-10％且活力＞70％时，继续进行。9.14.当达到目标细胞数量(5.0×109)的小于90％且活力＞70％时，解冻另一袋并重复7.9.4-7.9.12。当达到目标细胞数量的大于110％时，计算期望细胞剂量所需的适当体积，继续进行。10.在g-rex500m烧瓶中共培养til和饲养细胞10.1.从培养箱中取出装有准备好的培养基的g-rex-500m烧瓶，将其置于bsc2中。10.2.将饲养细胞转运包连接到g-rex-500m，使袋中的内容物排入500m。10.3.从培养箱中取出til悬液，将其置于bsc中。10.4.计算实现200×106的活细胞总数所要添加的til悬液的体积。(tvc/ml)/200×106＝ml10.5.当til的活细胞总数为5×106至200×106时，将所有til(总体积)添加至g-rex-500m。当til的活细胞总数计数大于200×106时，添加使200×106个til分配到单个g-rex-500m所需的计算体积。旋转剩余的til，用至少两个冻存管以至多108/ml的浓度将其冷冻在cs10中，标记til标识和冷冻日期。10.6.将g-rex-500m置于37℃、5％co2的培养箱中5天。11.提前准备：第16-18天11.1.在37℃下，加热1个10l的aimv袋，用于初始数量少于50×106til的培养物；加热2个，用于初始数量大于50×106til的培养物，加热至少1个小时或者直至可以使用。12.进行til细胞计数：第16-18天12.1.从培养箱中取出g-rex-500m烧瓶，将其置于bsc2中。小心不要扰动烧瓶底部的细胞培养物。12.2.从g-rex-500m烧瓶中无菌取出4l的细胞培养基，将其放入无菌容器中。12.3.旋动g-rex-500m，直至所有til从膜上重新悬浮。12.4.使用gatherrex或者蠕动泵将细胞悬液转移至2l转运包中。保留该500m烧瓶，以备后用。用取样位点连接器密封端口，以避免损失til。12.5.用取样位点连接器插入转运包，使用3ml注射器和针头取出2×1ml独立样品进行细胞计数。12.6.根据下式计算传代培养(subculture)所需的烧瓶总数。尾数部分上舍入。活细胞总数/1.0×109＝烧瓶#13.制备cm413.1.每两个所需的500m烧瓶准备一个10l的aim-v袋。视需要，加热另外的培养基。13.2.对于每10l所需的aim-v，添加100ml的glutamax以制备cm4。13.3.向cm4培养基中补充rhil-2，终浓度为3,000iu/mlrhil-2。14.分开(split)细胞培养物14.1.使用烧瓶上的刻度，通过重力将各个g-rex-500m装至5l。14.2.在所计算数量的g-rex-500m之间平均分配til的体积。14.3.将烧瓶置于37℃、5％co2的培养箱中，直至在rep的第22天收获。15.提前准备：第22-24天15.1.通过向两个1l的plasmalytea袋中各添加40ml的25％hsa，制备2l的1％hsa洗涤缓冲液。7.4.合并到一个lovo辅助袋中。15.2.用il-2@600iu/ml补充200ml的cs10。15.3.在4℃下预冷却4个750ml铝制冷冻罐。16.收获：第22-24天16.1.从37℃培养箱中取出g-rex-500m烧瓶，将其放入bsc2中。小心不要扰动烧瓶底部的细胞培养物。16.2.从各个烧瓶中吸出4.5l的细胞培养物上清液并丢弃。16.3.旋转g-rex-500m烧瓶以完全重悬til。16.4.在使用前，称重3-5l生物处理袋。16.5.使用gatherrex或者蠕动泵，将til收集到生物处理袋中。16.6.充分混合袋子，使用3ml注射器从注射器取样端口取出2×2ml样品进行细胞计数。16.7.称重袋子，找到初始重量和最终重量之间的差别。使用下列计算公式确定细胞悬液的体积。细胞悬液的净重(ml)/1.03＝体积(ml)17.过滤til并准备lovo“源”(source)袋17.1.将装有细胞培养物的袋子放入bsc2中。17.2.将170μm血液过滤器放入bsc2中并关闭所有夹子。17.3.将过滤器的源腿(sourceleg)无菌连接到细胞悬液。17.4.称重一个新的适当尺寸的生物处理袋(这被称为lovo“源”袋)。17.5.将过滤器的末端无菌连接到lovo“源”袋。17.6.通过将细胞悬挂在静脉输液架(ivpole)上来升高细胞悬液，建立细胞转移的重力流。(注：不允许将源袋悬挂在过滤设备上。)17.7.打开所有必要的夹子，让til从细胞悬液袋中排出，通过过滤器进入lovo“源”袋。17.8.一旦将所有细胞转移至lovo“源”袋，关闭所有夹子，密封lovo“源”袋的管，移除过滤器。17.9.称重lovo“源”袋，计算体积。17.10.lovo“源”袋已准备好用于lovo。17.11.通过密封靠近袋子的管，从一次性套件中取出lovo终产物的袋子。18.以1：1的比率，在补充有600iu/mlrhil-2的冷cs10中配制til18.1.计算所需冻存袋的数量。(细胞产物的体积×2)/100＝所需袋子的数量(下舍入)18.2.计算分配到各个袋子中的体积。(细胞产物的体积×2)/所需袋子的数量＝添加到各个袋子的体积18.3.将表6中的以下材料无菌转移至bsc。表6：用于til冷冻保存的材料19.til制剂19.1.关闭cellconnectcc1上的所有夹子。19.2.将lovo终产物、cs10袋鲁尔锁和适当数量的冻存袋无菌连接至cellconnect设备。用100ml注射器替换60ml注射器。19.3.所需cs10体积等于lovo终产物袋的体积。19.4.打开旋塞阀通道，松开lovo终产物袋和注射器之间的管线，将cs10拉入注射器，重新夹上cs10通道。打开通向细胞袋的通道，将cs10推入lovo终产物袋。使用注射器测量加到lovo终产物袋的体积。视需要，使用新的注射器重复操作，直至转运所需量的cs10。19.5.通过翻转来混合lovo终产物袋。19.6.更换100ml注射器。19.7.一次打开一个750ml冻存袋上的夹子。19.8.在使用中，仅打开与配制的产物和冻存袋直接相关的夹子。19.9.用100ml注射器测量通向冻存袋的配制产物体积。19.10.将100ml配制的产物转移至各个冻存袋中。19.11.添加完各个袋子后，抽回注射器，去除冻存袋中的所有气泡，重新夹紧相关的管线。19.12.在最后一个袋子上吸回10ml保留液，进行qc测试。19.13.密封各个冻存袋，留下尽可能少的管。19.14.取出装有保留样品的注射器，将其转移至50ml锥形管中；将1.5ml转移至各个冻存管中，放入程序降温仪进行冷冻。19.15.准备标签时，将密封好的袋子转移到4℃。19.16.给各个冻存袋贴上具有产品说明、名称和日期、体积、细胞计数和活力的标签。19.17.将各个冻存袋放入预冷的铝制冷冻罐中。20.使用程序降温仪(crf)冷冻保存til。20.1.遵循程序降温仪的标准程序。20.2.使用crf后，将冻存袋保存在液氮(ln2)中。21.确定预期结果和检测接受标准(acceptancecriteria)。实施例2：在8个患者肿瘤上进行的试验使用8个患者肿瘤进行实施例1的过程，产生8个批次的til。得到了良好的培养物回收率、活力、细胞计数、cd3+(指示t细胞含量％)和ifn-γ(ifn-g或者ifn-γ)释放，如下表7和图7至图10所示。表7：实施例1的过程的一致性(identity)、效价强度以及活力/回收率的检测结果。实施例3：改进后的til过程的可扩展性(scalability)此处所述研究是在工艺开发(pd，processdevelopment)实验室中进行的，随后，在生产设施(manufacturingfacility)的gmp洁净室套间中利用工程运行进行了工艺鉴定(pq，processqualification)研究。根据合格方案，gmp设施洁净室完成了三个pq/工程运行，此处介绍了基于pd研究的批次记录。预先设定了工程运行的接受标准。pq研究在下文进一步总结，以下各节提供了工程批次获得的测试结果。由快速前扩增方案(pre-rep)培养物产生的细胞数量通常超过100×106个活细胞。此外，在pre-rep和rep培养步骤之间进行冻-融循环会降低活细胞的产量。通过取消过程中的冷冻保存步骤，可以可靠且正常地启动rep，且til数量增加。通过成比率的量的细胞倍增次数，此种变化使rep的持续时间减少为约11天，而不会影响细胞剂量。此外，从活化到收获所减少的培养时间，使得产物的分化程度降低，产物可能会更好地在体内持久存在(tran2008)。pd研究验证了具有固定数量饲养细胞的高达200×106个细胞的rep培养的启动。然后评估了在9至14天中收获rep培养物的最佳时间。按饲养细胞与til的比率为100：1至25：1，接种培养物。通过检测细胞总数、活力、免疫表型、培养基消耗、代谢物分析、白介素2(il-2)分析和下文所述功能分析，来确定对收获时间的优化。基于下表8中列出的标志物，评估了rep培养结束时细胞的免疫表型。评估了细胞的表型活化和分化状态。在任何实验条件下均未观察到表型的统计学差异。表8：在方法优化培养物上测定的活化和分化标志物缩写：pe/cy7＝藻红蛋白：cy-7串联缀合物(tandemconjugate)；percp-cy5.5＝多甲藻素-叶绿素-蛋白质复合物：cy5.5缀合物；pe＝藻红蛋白；fitc＝荧光素异硫氰酸酯缀合物；apc-h7＝别藻蓝蛋白：h7串联缀合物；apc＝别藻蓝蛋白；pb＝pacificbluetm在所有检测的条件下，培养基消耗和代谢物产生均保持在允许的范围内；il-2水平保持大于150iu/ml培养上清液(数据未显示)。认为t细胞的肿瘤细胞杀伤(tumorcellkilling)由效应t细胞上t细胞受体的活化(响应于肿瘤细胞表面呈递的肽)介导。如果它们要在输注后在体内持续存在并且介导肿瘤退缩(tumorregression)，离体扩增的t细胞必须保留响应于tcr活化而被激活和增殖的能力。为了评估培养的细胞的活化潜力，用装载(load)有okt3的经辐照的同种异体pbmc重新活化在不同时间点获得的til。7天后收获til培养物，分析其倍数扩增。表9总结了此研究的结果。表9：结果总结：用装载有okt3的同种异体pbmc再培养的post-reptil的增殖。此研究表明，直至第11天(第9至11天收获)，此实验中til被活化的潜力随着培养的每一天而增加。与目前方法类似，在改进方法的第11天收获的细胞与对照til类似地进行了14天的培养。这些研究证明了改进的til方法的可扩展性，并建立了til与饲养细胞的接种比率的可接受范围。此外，发现生长特性持续存在直至培养的第14天，而培养条件保持最佳状态直至第11天。据显示，检测的条件对til表型没有可测量的影响。在第11天的rep培养中收获的细胞显示出响应再活化的最佳能力，而细胞培养条件保持在允许范围内。这些变化已被采用并经过全面验证，分开培养物发生在第5天，收获发生在第11天。为了在gmp生产用于给患者施用的自体til产物之前获得生产和检测til产物方面的经验，在工艺开发设施中进行工程运行。用于工程运行的生产程序与用于制造gmptil产物的规模相同。由各种类型的肿瘤(包括黑色素瘤、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌(hnscc)、宫颈癌和肺癌)培养til的经验已确定了：从转移性肿瘤样品中分离和生长til对于这些癌症是相似的(sethuraman2016，jitcp42)。因为肿瘤组织学类型之间的肿瘤碎片的初始分离和淋巴细胞的生长似乎是相似的，这些工程运行足以使由hnscc、宫颈癌和黑色素瘤肿瘤产生til的工艺合格。表10显示了用于工程运行的肿瘤样品的来源和特征。表10：工程运行检测的肿瘤样品肿瘤样品工程运行1工程运行2工程运行3患者id1001185600-d45540231来源biothemeresearchbiooptionsmoffitt组织左肺乳腺，erpr+her2-黑色素瘤处理日期2017年1月5日2017年1月12日2017年1月26日如下所述，在工艺开发设施完成了til的三个工程运行的出货检测(表11)。在第16天和第22天检测了产品。如其他地方所详述的，还确定了三个工程运行的ifn-γ分泌(表12)。表11：在工艺开发设施的工程运行的产品出货检测结果*第16天和第22天的最终无菌结果直至最终产品出货供运输之后才能提供。第22天的革兰氏染色结果用于无菌出货。表12：其他功能表征：ifn-γ分泌的检测总之，工程运行的数据表明，可生产til药物产品用于自体施用于患者的目的。实施例4：淋巴细胞耗竭可在第7天和在淋巴细胞耗竭之前进行细胞计数。最终细胞产物包括高达约150×109个活细胞，其用在plasma-lyteatm中的至少50％hypothermosoltm(体积/体积)和含有300iu/mlil2的至多0.5％hsa(与人输液兼容)配制而成。终产物可按以下两种输注体积之一进行施用：1)当收获的til总数≤75×109时，250ml(在300ml容量的输液袋中)；或者2)当收获的til总数<150×109时，500ml(在600ml容量的输液袋中)。由于患者之间的t细胞扩增速率在rep步骤期间的差异，无法预测每个患者的最终til输注产品可能产生的细胞总数。基于所需的最小细胞数，确定3到14天rep的第3、4、5、6、7天的细胞下限，以决定使用环磷酰胺加氟达拉滨化疗方案对患者进行淋巴细胞耗竭。一旦我们基于该获得的最小细胞数开始淋巴细胞耗竭，我们将致力于在第3天到第14天(在大多数情况下，第7天)中使用我们在rep中产生的可用til数量来治疗患者。输注范围的上限(150×109个活细胞)基于已知公开的已得到临床反应的安全输注的上限。radvanyi等，clincancerres2012，18，6758-6770。实施例5：过程2a-第0天本实施例描述了实施例1至4中所述2a过程的第0天的详细方案。准备。1.确认肿瘤洗涤培养基、cm1和il-2在有效期内。2.将cm1(细胞培养基1)放入培养箱中。方法。1.清洁生物安全柜(bsc)。2.设置过程中的监控板，操作期间留在生物安全柜中1至2小时。3.将til培养基cm1放置在生物安全柜中。4.制备含有6000iu/mlil-2的til培养基cm1：4.1.1lcm1；4.2.1mlil-2(6,000,000iu/ml)；4.3.将25mlcm1+il2放入50ml锥形瓶中，该锥形瓶在加入g-rex时用于碎片；4.4.置于37℃培养箱中预热。5.用70％的酒精擦拭g-rex100mcs包装，将其置于生物安全柜中。关闭除过滤器管线之外的所有夹子。6.进行acacia泵校准。7.将g-rex100mcs烧瓶的红色管线连接到acacia泵套管(pumpboot)的出口管线上。8.将pumpmatic连接到泵套管的入口管线，将其放入装有培养基的瓶子中。松开夹子以启动泵。9.泵送各个g-rex100mcs生物反应器中剩余的975ml预热的cm1(含有6,000iu/mlil-2)。10.热封红色管线，断开泵套管。11.在g-rex上放标签。12.将g-rex100mcs放置在培养箱中，直至需要。组织解剖。1.记录肿瘤处理的开始时间。2.将肿瘤洗涤培养基转移至bsc中。3.将5个100mm培养皿放在生物安全柜中，3个用于洗涤，1个用于存放，1个用于不良组织。相应地给培养皿贴上标签。不良组织指黄色脂肪组织或者坏死组织。4.将3个6孔板放入生物安全柜。5.吸取3-5ml肿瘤洗涤培养基到一个6孔板的各个孔中用于多余的肿瘤块。6.吸取50ml肿瘤洗涤培养基以洗涤培养皿1-3并固定皿(holdingdish)。7.将2个150mm解剖皿放入生物安全柜中。8.将3个50ml无菌锥形管放入bsc中。9.将一个标记为“镊子肿瘤洗涤培养基”，第二个标记为“解剖刀肿瘤洗涤培养基”，第三个标记为“盖子液滴(liddrop)用肿瘤洗涤培养基”。10.向各个锥形管中添加5-20ml肿瘤洗涤培养基。在洗涤和解剖肿瘤的过程中，视需要将镊子和解剖刀浸入肿瘤洗涤培养基中。11.将解剖刀和镊子放在合适的管中。12.使用长镊子从“样品”瓶中取出肿瘤，将其转移至“洗涤1”培养皿中。13.在“洗涤1”培养皿中室温孵育肿瘤≥3分钟。14.孵育期间，给“样品”瓶重新贴上标签“生物负载”，保存在2℃至8℃下，直至最终收获或者需要进一步进行无菌测试。15.使用镊子将肿瘤转移至“洗涤2”培养皿。16.在“洗涤2”培养皿中室温孵育肿瘤≥3分钟。17.孵育期间，使用移液管将约4滴单个的肿瘤洗涤培养基液均匀间隔地滴加到称为“肿瘤碎片”培养皿的6孔板盖的各个圆圈中。18.使用镊子将肿瘤转移至“洗涤3”培养皿。19.在“洗涤3”培养皿中室温孵育肿瘤≥3分钟。20.150mm皿盖被用于解剖。在下方放置一个标尺。21.用镊子将肿瘤转移至解剖皿中，测量并记录肿瘤的长度。22.拍肿瘤的照片。23.在解剖皿中将肿瘤块初步解剖成中间块，注意保留每个中间块的肿瘤结构。24.将未被主动解剖成碎片的任何中间肿瘤块转移至组织存放皿中，以确保组织在整个解剖过程中保持水分。25.一次处理一个中间肿瘤块，在解剖皿中小心地将肿瘤切成3×3×3mm的碎片，并用培养皿下方的标尺作为参考。26.继续从中间肿瘤块中解剖碎片，直至中间块中所有组织被评估。27.选择良好碎片，使用移液管将至多4个良好碎片转移至“肿瘤碎片”培养皿中一个圆圈中的洗涤培养基滴中。使用移液管、解剖刀或者镊子，将尽可能多的不良组织和废弃产物转移至“不良组织”培养皿中以清空解剖皿。将所有剩余组织放入6孔板的一个孔中。(不良组织指黄色脂肪组织或者坏死组织)。28.通过重复步骤23-26来继续处理剩余的中间肿瘤块，一次处理一个中间块，直至整个肿瘤均被处理。(视需要获取新鲜的解剖刀或者镊子，由处理技术员决定)。29.将碎片板移到罩子后部。30.使用移液管、解剖刀或者镊子将至多50个最佳肿瘤碎片转移至标记了含肿瘤碎片的cm1的50ml锥形管中。31.用移液管从50ml锥形管中取出漂浮物。记录碎片和漂浮物数量。32.从通风橱中取出所有多余物品，留下良好组织板(如果它们含有额外的碎片)。用酒精布擦拭罩子。33.从培养箱中取出g-rex100mcs，用70％酒精擦拭，放入生物安全柜中。34.旋转装有肿瘤碎片的锥形瓶，将50ml圆锥瓶的内容物倒入g-rex100mcs烧瓶中。35.如果转移到g-rex100m烧瓶的一个以上肿瘤碎片浮起，从“良好组织”培养皿中获取一个另外的肿瘤碎片，将其转移到g-rex100m烧瓶中。36.记录培养箱号和加入各个烧瓶的碎片总数。37.将g-rex100m生物反应器置于37℃、5％co2培养箱中。38.将所有未使用的肿瘤置于100ml的hypothermosol中，并送至实验室。39.记录肿瘤处理的停止时间。40.丢弃所有未使用的含有il-2的til完全培养基和未使用的il-2等分试样。41.清洁生物安全柜。42.将“生物负载”样品置于适当的储存条件下。43.记录数据。44.将图片另存为文件样品id#肿瘤处理日期，放到准备好的患者档案中。45.下订单并确保沉降板送至微生物实验室。实施例6：过程2a-第11天本实施例描述了实施例1至4中所述2a过程的第11天的详细方案。事先准备。1.处理的前一天：1.1.cm2可以在处理发生的前一天准备好。置于4℃。2.处理当天。2.1.准备饲养细胞线束(harness)。2.1.1.关闭cc2和4s-4m60连接器套件上的所有夹子。2.1.2.将4s-4m60线束的4个尖嘴无菌连接到cc2上的尖嘴管线上，除去尖嘴。2.1.3.搁置用于合并饲养细胞。2.2.根据ctf-form-318制备5ml的冷冻保存培养基，置于4℃直至需要。洁净室环境监控-预处理1.记录洁净室信息。2.用大的饱和酒精布或者酒精喷雾清洁生物安全柜(bsc)。3.在开始处理之前，验证粒子计数10分钟。4.设置过程中的监控板，操作期间留在生物安全柜中1至2小时。准备g-rex500mcs烧瓶：1.对于每升的cm2(细胞培养基2)，使用10ml注射器通过未使用的无菌母鲁尔接头无菌转移0.5mlil-2(储备溶液为6×106iu/ml)到生物处理袋中。2.用注射器中的过量空气清洁管线，从袋中吸出一些培养基，然后将其推回。这样可确保所有il-2已与培养基混合。充分混合。3.打开外部包装，然后将g-rex500mcs放入bsc。关闭设备上除大型过滤器管线外的所有夹子。4.将红色收获管线从g-rex500mcs无菌连接到泵管出口管线。5.将生物处理袋的母鲁尔连接到泵保护套的公鲁尔。6.将生物处理袋悬挂在静脉输液架上，打开夹子，将4.5升cm2培养基泵入g-rex500mcs。清洁管线、夹子和热封。7.保留从泵到培养基的管线。在制备饲养细胞时使用它。8.将g-rex500mcs放在培养箱中。制备经辐照的饲养细胞。1.密封，从1ltp除去尖嘴。夹紧两条管线。2.记录il转运包(tp)的干重。3.将il转运包无菌连接到acacia泵套管，距离袋子约12英寸。4.泵管的另一端仍连接至10llabtainer。5.按重量将500mlcm2泵入tp。6.关闭夹子，在靠近连接处密封。7.放在培养箱中。8.验证并注销饲养细胞袋。9.记录使用的饲养细胞批次。10.用酒精擦拭袋子。11.放入封口袋中。12.在37℃(+/-1℃)水浴中解冻饲养细胞。记录水浴温度。13.取出并用纱布干燥。14.将饲养细胞移入准备室。15.转移至洁净室的bsc中。16.使用先前准备的饲养细胞线束，将装有培养基的1ltp连接到三通旋塞阀样品端口侧未使用的管线之一上，尽可能靠近密封接头，尽可能少地松开管。17.将饲养细胞线束带放入bsc中。18.将从饲养细胞线束进入饲养细胞袋的单个端口的尖嘴插入3个饲养细胞袋中的每一个。19.旋转旋塞阀，使1ltp处于“关闭(off)”位置。20.一次处理一个袋子，打开饲养细胞袋管线上的夹子，将注射器中的空气排出，将饲养细胞袋的内容物吸入注射器。从注射器排出空气有助于回收细胞。关闭饲养细胞袋的夹子。21.记录各个袋子中解冻的饲养细胞回收的体积。22.旋转旋塞阀，以使饲养细胞袋处于“关闭”位置。23.打开tp上的夹子，然后将注射器中的内容物分配到tp中。24.确保已清洁管线并重新夹紧tp。您可能不得不从tp的注射器中吸入一些空气以用于清洁管线。25.充分混合细胞。26.封闭饲养细胞袋的夹子。27.旋转旋塞阀，使注射器端口处于“关闭”位置。断开60ml注射器与旋塞阀的连接。28.为各个饲养细胞袋更换新的注射器。29.将注射器留在最后一个袋子上。30.充分混合最终的饲养细胞制剂。31.旋转旋塞阀，使饲养细胞悬液处于“关闭”位置。32.混合细胞，使用5ml注射器和不必要的端口，用一些细胞溶液冲洗端口以确保准确取样，取出1ml细胞，将其置于标记好的管中用于计数。33.用第二个注射器重复。这两个独立的样品各自进行了一次细胞计数。34.转动旋塞阀，使饲养细胞悬液处于“打开(open)”位置，使用连接至线束的60ml注射器将空气排入tp，清洁管线。35.取下注射器，用新的无菌盖盖住鲁尔端口。36.在靠近焊点处热封tp，拆下线束。37.记录装有细胞悬液的转运包的质量，计算细胞悬液的体积。38.放置于在培养箱中。39.对饲养细胞样品进行单细胞计数，记录数据，将计数原始数据附加到批次记录中。40.记录cellometer计数程序。41.验证进入cellometer中的正确稀释度。42.计算饲养细胞转运包中的总活细胞密度。43.如果细胞计数＜5×109，则解冻更多的细胞、计数并将其添加到饲养细胞中。44.重新称重饲养细胞袋，计算体积。45.计算要取出的细胞体积。将饲养细胞添加到g-rex。1.将4”转运装置无菌连接到饲养细胞tp。2.在bsc中，将适当尺寸的注射器连接到饲养细胞转运包上的母鲁尔接头。3.充分混合细胞，取出在步骤40或者41中计算出的体积，以达到5.0×109个细胞。丢弃不需要的细胞。4.使用1ml注射器和18g针头吸取0.150mlokt3，取下针头，通过母鲁尔接头将其移至饲养细胞tp。5.洗涤具有饲养细胞的管和注射器，充分混合袋子。用注射器中的空气清洁管线。6.从培养箱中取出g-rex500mcs，用酒精布擦拭，放在scd旁边。7.将饲养细胞袋无菌连接到g-rex500mcs的红色管线。松开管线的夹子，使饲养细胞在重力作用下流入烧瓶。8.确保管线已完全清洁干净，然后热封接近原始连接处的管线，取下饲养细胞袋。9.将g-rex500mcs放回培养箱，记录时间。制备til：记录til收获的开始时间1.小心地从培养箱中取出g-rex100mcs，关闭除大型过滤器管线之外的所有夹子。2.将1l转运包连接到g-rex100mcs的红色管线上。3.关闭300mltp上的夹子。热封袋子上离移除尖嘴约12英寸的位置。记录干重/质量。4.将300ml转运包无菌连接到100mcs上靠近热封处的细胞收集管线。夹紧管线。5.松开所有连接到1ltp的夹子。6.使用gatherex将约900ml培养上清液转移至1l转运包中。空气进入管线时，gatherex停止运转。夹住管线并热封。7.旋转烧瓶，直至所有细胞都从膜上脱离。检查膜，确保所有细胞均已脱离。8.倾斜烧瓶，使其远离收集管，使肿瘤碎片沿边缘沉降。9.缓慢向收集管倾斜烧瓶，使碎片留在烧瓶的相对侧。10.使用gatherex将残留的细胞悬液转移至300ml转运包中，避免肿瘤碎片。11.重新检查所有细胞均已从膜上去除。12.如有必要，可通过松开gatherex上的夹子进行反洗，允许一些培养基在重力作用下流入g-rex100mcs烧瓶。13.用力敲击烧瓶以释放细胞，将其泵入300mltp中。14.收集完成后，关闭红色管线，热封。15.热封收集管线，留下与记录干重时大致相同的管线长度。16.记录含有细胞悬液的300mltp的质量(包括干质量)，计算细胞悬液的体积。17.在bsc中，加标带有4"血浆转运装置的300mltp。充分混合细胞。无菌连接5ml注射器，吸取1ml，置于冷冻瓶中。用第二个注射器重复。这些用于细胞计数、活力。18.重新夹紧并用新的无菌鲁尔盖更换鲁尔盖。19.放置在恒温箱中，记录放置在恒温箱中的时间。20.对各个样品进行单细胞计数，记录数据，将计数的原始数据附加到批次记录中。21.记录cellometer计数程序。22.验证已输入到cellometer中的正确的稀释度。23.如有必要，将总存活til密度调节至≤2×108个活细胞。24.计算要取出体积或记录无需调整。25.在bsc中，将大小适当的注射器无菌连接至300mltp。26.如果需要，取出“计算的要取出体积”表格中计算的细胞的计算体积。27.夹紧，热封300mltp。28.将过量的细胞转移至适当尺寸的锥形管中，将其放到培养箱中，松开盖子以备后续冷冻保存。29.从培养箱中取出g-rex500mcs，将其放置在scd旁边。30.将300mltp无菌连接到acacia泵的进口管线上。31.将g-rex500mcs的红色管线无菌连接到acacia泵的出口管线上。32.将细胞泵入烧瓶。33.确保已完全清洁管线，然后将红色管线热封到接近原始连接处的位置。34.检查g-rex500mcs上除大型过滤器管线外的所有夹子均已关闭。35.将g-rex500mcs放回培养箱，记录放置在g-rex培养箱中的时间。36.下订单并确保沉降板送至微生物实验室。过量细胞的冷冻保存计算加到细胞中的冷冻培养基的量：表13：目标细胞浓度为1×108个/mla、(从步骤15)取出的细胞总量mlb、目标细胞浓度1×108个细胞/ml要添加的冷冻培养基的体积(a/b)ml37.在20℃下以全制动和全加速度使til以400×g的转速旋转5分钟。38.无菌吸出上清液。39.轻轻拍打试管底部，将细胞重悬在剩余的液体中。40.在轻轻敲打试管的同时，缓慢加入准备好的冷冻培养基。41.分装到适当尺寸的冻存管中，记录细胞放置在-80℃下的时间。实施例7：过程2a-第16天本实施例描述了实施例1至4中所述2a过程的第16天的详细方案。洁净室环境监控-预处理。1.用大的饱和酒精布或者酒精喷雾清洁生物安全柜。2.在开始处理之前，验证粒子计数10分钟。3.设置过程中的监控板，操作期间留在生物安全柜中1至2小时。til收获和计数。1.对于初始数量少于50×106til的培养物，将一个10l的cm4袋放在37℃恒温箱中加热至少30分钟或者直至可以使用。2.在bsc中，将baxter扩展套件(baxterextensionset)无菌连接到10llabtainer袋。3.从培养箱中取出g-rex500mcs烧瓶，将其放在邻近gatherex的工作台上。检查除大型过滤器管线外的所有夹子均已关闭。将快速连接管线上的夹子移到靠近“t”结的位置。4.通过baxter扩展套件上的可连接管，将10llabtainer无菌连接到g-rex500mcs的红色收获管线上。5.在“y”下方2”热封2l转运包，移除尖嘴，记录干重。将2ltp无菌连接到g-rex500mcs的透明收集管线上。6.将g-rex500mcs放置在水平表面上。7.打开通往10llabtainer的所有夹子，使用gatherex将约4l培养上清液转移至10llabtainer。8.根据适当的gatherex收获说明进行收获。9.夹紧红色管线，记录开始收获的时间。10.当空气进入管线时，gatherex停止。夹住红色管线。11.取出上清液后，旋转烧瓶，直至所有细胞都从膜上脱离。倾斜烧瓶以确保软管在烧瓶的边缘。12.松开所有通向2ltp的夹子，使用gatherex将残留的细胞悬液转移至2ltp中，保持边缘倾斜，直至收集所有细胞。13.检查膜的贴壁细胞。14.如有必要，可通过松开红色管线上的夹子进行反洗，使一些培养基在重力作用下流入烧瓶。15.关闭红色管线，三重热封。16.用力敲击烧瓶，释放细胞。17.将细胞添加到2ltp。18.热封2l转运包，留下与记录干重时大致相同的管线长度。19.留下g-rex500mcs，在分开细胞时会再用到它。20.记录装有细胞悬液的转运包的质量，计算细胞悬液的体积。21.确定细胞悬液体积，包括干重。22.将无菌的4”转运装置连接到细胞悬液袋上。23.在bsc中，轻轻混合细胞，用20cc注射器吸取11ml，如表14所示等分试样：表14：检测参数检测样品体积容器细胞计数和活力2-2ml样品冻存管支原体1ml将冻存管保存在4℃直至检测完成无菌1ml分别往厌氧和好氧培养瓶中接种0.5ml流体(flow)2–2ml未使用的细胞计数(冷冻保存用于后续批次检测)剩余细胞丢弃24.热封。关闭鲁尔连接件，固定住夹子。25.标记细胞悬液，将其置于培养箱中，记录放置在培养箱中的时间。26.计算新的体积。27.基于细胞悬液的体积和qc的取出体积(11ml)，记录2l转运包中的体积。28.接种，进行无菌试验。29.将支原体样品保存在4℃的待测架中以进行支原体检测。30.搁置直至接种til群。细胞计数：进行单细胞计数，记录数据，将计数原始数据附加到批次记录中。记录稀释度。记录cellometer计数程序。验证已输入到cellometer中的正确稀释度。方法继续：31.计算传代所需的烧瓶总数**原始容器再利用，另外的容器的尾数部分上舍入。将il-2添加到cm1.将10l装有glutamax的aimv袋放入bsc中。2.用4"血浆转运装置插入培养基袋。3.将18g针头连接到10ml注射器上，注射器吸入5mlil-2(终浓度为3000iu/ml)。4.取下针头，将注射器无菌连接到血浆转运装置上，将il-2分配到袋子中。5.用空气冲洗管线，吸出一些培养基，分配到袋子中。这确保了所有il-2均在培养基中。6.对剩余aimv袋重复同样的操作。准备g-rex500mcs烧瓶1.确定加入烧瓶中的cm4量。记录各个烧瓶添加的细胞体积和cm45000ml-a的体积。2.关闭除大型过滤器管线外的所有夹子。3.将acacia泵的入口管线无菌连接到装有cm4的培养基袋上的4"血浆转运装置上。4.通过红色收集管线将泵的出口管线无菌连接到g-rex500mcs。5.使用烧瓶上的管线将确定量的cm4泵入g-rex500mcs。6.热封g-rex500mcs红色管线。7.对各个烧瓶重复步骤4至6。使用重力填充或者多个泵，可以同时填充多个烧瓶。可以将“y”连接器连接到泵的出口管线上，将两个臂连接到两个g-rex500mcs烧瓶上同时填充两个烧瓶。8.将烧瓶置于37℃、5％co2中。用til接种烧瓶1.关闭g-rex500mcs上除大型过滤器管线外的所有夹子。2.将细胞产物袋无菌连接到acacia泵的入口管线。3.将泵的另一端无菌连接到g-rex500mcs的红色管线上。4.将泵套管放入泵中。5.将细胞产物袋放在分析天平上，记录til加入g-rex烧瓶中的时间。6.天平清零。7.解开管线的夹子，将所需细胞体积(假设lg＝1ml，按重量计)泵入g-rex500mcs。8.将细胞袋倒置，泵送空气以清洁管线。热封g-rex500mcs的红色管线。将烧瓶放在培养箱中。9.通过红色收集管线将泵的出口管线无菌连接到下一个g-rex500mcs。10.充分混合细胞。11.对所有烧瓶重复细胞转移。12.将烧瓶放置在37℃、5％co2中，记录til加入grex烧瓶中的时间。13.向微生物实验室预定沉降板的检测。14.记录登录号。15.进行有氧和无氧无菌试验。16.确保板和瓶运送到微生物实验室。冷冻保存流体或者过量的细胞：1.计算所需冷冻培养基的量：a.目标细胞浓度为1×108/ml。记录取出的细胞总数。目标细胞浓度为1×108个细胞/ml。计算要添加的冷冻培养基的总体积。2.制备冷冻保存培养基，并放置在40℃直至需要。3.在20℃下以全制动和全加速度将til以400×g的转速旋转5分钟。4.无菌吸出上清液。5.轻轻拍打试管底部，将细胞重悬在剩余的液体中。6.在轻轻敲打试管的同时，缓慢加入准备好的冷冻培养基。7.分装到适当尺寸的贴有标签的冻存管中。8.将冻存管放入mr.frosty或者等同物中，将其置于-80℃的冰箱中。9.在72小时内转移至永久储存地点，记录备案放入-80℃冰箱中的日期和时间。实施例8：过程2a-第22天本实施例描述了实施例1至4中所述2a过程的第22天的详细方案。记录阴性过程中无菌实验结果在开始收获之前，从微生物实验室获得第16天的初步无菌试验结果。如果结果呈阳性，与实验室主任或者指定人员联系以获取进一步说明。洁净室环境监控-预处理1.在开始处理之前，验证粒子计数10分钟。2.用大的饱和酒精布或者酒精喷雾清洁生物安全柜。3.设置过程中的监控板，操作期间留在生物安全柜中1至2小时。预先准备1.在bsc中，将无菌baxter扩展套件固定在10llabtainer袋或者等同物。给lovo滤液袋贴上标签。2.在bsc中放置三个1lplasmalytea袋。3.准备合并，并给具有1％hsa的plasmalytea袋贴标签：3.1.关闭4s-4m60连接器套件上的所有夹子，插入各个plasmalyte袋。3.2.将4s-4m60的公端之一连接到acacia泵套管的入口管线上。3.3.将泵套管的出口管线连接到一个3l收集袋。关闭除泵的管线外的3l袋的所有夹子。3.4.将3lplasmalyte泵入3升袋中。视需要，通过倒转泵除去3l袋中的空气。3.5.关闭所有夹子，除了具有母鲁尔接口的管线。3.6.使用两个100ml注射器和16-18g针头，装入120ml的25％hsa。用红色盖帽盖上注射器。3.7.将一个注射器连接到3l袋子的母鲁尔上，将hsa转移至3lplasmalyte袋中。混合均匀。3.8.用第二个注射器重复。3.9.充分混合3.10.关闭所有夹子。3.11.使用10ml注射器从3l袋子的无针端口取出5ml含有1％hsa的plasmalyte。3.12.盖上注射器，将其置于bsc中用于il-2稀释。3.13.关闭所有夹子。3.14.热封从泵套管上拆下母鲁尔管线。3.15.给lovo洗涤缓冲液贴上标签和日期。室温下24小时内用完。制备il-21.将5ml注射器中plasmalyte/1％hsa注入到贴有标签的50ml无菌锥形管中。2.向装有plasmalyte的试管中加入0.05mlil-2储备溶液。3.标签写上il-26×104。4.封盖标签，在2℃至8℃下储存。记录体积。制备细胞1.关闭10llabtainer袋上的所有夹子。通过鲁尔连接件将baxter扩展套件连接到10l袋。2.从37℃取出g-rex500m烧瓶。3.将g-rex500mcs的红色培养基取出管线无菌连接到100l生物处理袋上的扩展套件。4.将g-rex500mcs的透明细胞取出管线无菌连接到3l收集袋上，标记为“合并的细胞悬液”。5.打开红色管线和10l袋子。6.使用gatherex泵，减少第一个烧瓶的体积。注：如果检测到气泡，则泵可能过早停止。如果体积减少未完全，重新启动gatherex泵。7.关闭上清液袋和红色管线的夹子。8.旋转g-rex500m烧瓶，直至til完全重悬，同时避免飞溅或者起泡。确保所有细胞均已从膜上脱落。9.打开透明管线和3l细胞袋上的夹子。10.倾斜g-rex烧瓶，使细胞悬液集中在烧瓶中收集管所在的一侧。11.启动gatherrex收集细胞悬液。注：如果细胞收集管不在壁和底部膜的交界处，以45°角倾斜同时敲打烧瓶通常足以正确定位收集管。12.确保所有细胞已从烧瓶中取出。13.如果有细胞保留在烧瓶中，将100ml上清液加回到烧瓶中，涡旋并收集到细胞悬液袋中。14.关闭细胞收集袋管线上的夹子。松开gatherex上的夹子。15.热封g-rex500mcs的透明管线。16.热封g-rex500mcs的红色管线。17.对其他烧瓶重复步骤3至16。18.每两个烧瓶后，视需要更换10l上清液袋。19.可以使用多个gatherrex。20.处理g-rex500mcs的记录编号。21.热封细胞收集袋。记录收获的g-rex的数量。22.在新的3l收集袋上，用记号笔在离一个母鲁尔接头约2英寸处做上标记。23.热封，移除标记下方的母鲁尔接头。24.贴上标签“lovo源袋”。25.记录干重。26.关闭170μm血液过滤器的所有夹子。27.将过滤器的末端无菌连接到正好位于标记下方的lovo源袋上。28.将过滤器的源管线无菌连接到装有细胞悬液的袋子上。29.通过将细胞悬挂在静脉输液架上来升高细胞悬液，启动细胞转移的重力流。(注：不允许将源袋悬挂在过滤设备上。)30.打开所有必要的夹子，让til从细胞悬液袋中排出，通过过滤器进入lovo“源”袋。31.一旦将所有细胞转移到lovo“源”袋，关闭所有夹子，在标记上方热封，拆下过滤器。32.充分混合袋子，使用两个3ml注射器从注射器取样端口取出2个独立的2ml样品，用于细胞计数和活力。33.称重袋子，确定初始重量和最终重量之间的差值。34.记录数据以及在培养箱中的位置，包括干重。细胞计数。对各个样品进行单细胞计数，记录数据，将计数原始数据附加到批次记录中。记录cellometer计数程序。验证已输入到cellometer中的正确稀释度。确定有核细胞总数。确定用于lovo处理要保留＝1.5×1011个细胞所要取出的tnc数量。将取出的细胞放入适当尺寸的容器中进行处理。lovo收获事先准备好的带有baxter扩展套件的10llabtainer是后来连接到lovo套件上的替换滤液袋。打开lovo并遵循屏幕显示。检查秤(weightscale)和压力传感器访问“仪器操作配置文件”：1.触摸“信息”按钮。2.触摸“仪器设置”标签。3.触摸“仪器操作配置文件”按钮。4.显示“仪器操作配置文件”。检查秤1.确保任何秤上均未悬挂东西，检查各个秤的读数。2.如果任何秤的读数超出0+/-2g的范围，按照制造商的《秤的校准手册》(weighscalecalibrationmanual)中的说明进行秤的校准。3.如果所有秤均在容差范围内且没有悬挂重量，则继续在每个秤(#1-4)上悬挂1kg重量，查看读数。4.当悬挂了1kg质量时，如果任何秤的读数超出1000+/-10g的范围，按照制造商的《lovo操作者手册》(lovooperator'smanual)中的说明进行秤的校准。检查压力传感器1.在“仪器操作配置文件”屏幕上检查压力传感器的读数。2.n/a：如果压力传感器的读数超出0+/-10mmhg，则按照制造商的《lovo操作者手册》中的说明，在“维修模式”下储存新的大气压设置。a.触摸“仪器操作配置文件”屏幕上的检查按钮。b.触摸“仪器设置”选项卡上的检查按钮。3.如果已进行过秤校准或者已储存新的大气压设置，重复相关部分。要开始程序，从“方案选择屏幕”上的下拉菜单中选择“tilg-rex收获”方案，然后按“开始”。1.显示“程序设置”屏幕。2.触摸“溶液信息”按钮。3.显示“溶液1”屏幕。查看“溶液1”所需洗涤缓冲液类型。(应显示plasmalyte。)4.触摸“下一步”按钮，前进至“溶液2”屏幕。检查“溶液2”所需洗涤缓冲液的类型。(应显示为“无”，表示该方案已配置为仅使用一种类型的洗涤缓冲液，即plasmalyte)5.触摸“溶液2信息”屏幕上的检查按钮以返回到“程序设置”屏幕。6.触摸“程序信息”按钮。7.显示“程序信息”屏幕。8.触摸“用户id”输入字段。将显示键盘。输入操作者和验证者的缩写。触摸按钮以接受输入。9.触摸“来源id”输入字段。将显示键盘。输入产品批次#。触摸按钮以接受输入。10.触摸“程序id”输入字段。将显示键盘。输入“til收获”。触摸按钮以接受输入。11.如果要记录其他注释，触摸“程序注释”输入字段。显示键盘。输入任何注释。触摸按钮以接受输入。注：“程序注释”输入字段是可选的，可以保留空白。12.触摸“程序信息”屏幕上的检查按钮以返回“程序设置”屏幕。13.验证：“程序信息”按钮中显示“检查”。如果不显示“检查”，再次触摸“程序信息”按钮，确保“用户id”、“来源id”和“程序id”字段均有条目。14.触摸“参数配置”按钮。15.显示“常规步骤信息”屏幕。16.触摸“来源体积”(ml)输入字段。显示数字键盘。从表1输入计算的细胞悬液体积(ml)17.触摸按钮以接受输入。18.触摸“来源pcv(％)”输入字段。显示“til(活+死)”屏幕。19.触摸“细胞浓度”输入字段。显示数字键盘。在表14中以“×106/ml”为单位在来源产物中输入总细胞浓度/ml。该条目的范围可以为00.0到99.9。触摸按钮以接受输入，返回“常规步骤信息”屏幕。注：接受“细胞浓度”后，“常规步骤信息”屏幕上的“来源pcv(％)”输入字段将显示lovo根据操作员输入的“细胞浓度”条目计算出的pcv％。20.在“常规步骤”屏幕上，触摸“下一步”按钮，前进至“屏幕4”(共8个)，即“终产物体积(滞留物体积)”屏幕。注：“屏幕2”和“屏幕3”没有任何输入字段供操作员填写。21.显示“终产物体积(滞留物体积)”屏幕。22.使用表15中的有核细胞总数(tnc)值，确定下表中的终产物目标体积(表16)。在lovo程序设置过程中输入与该细胞范围相关的终产物体积(ml)。表15：确定终产物目标体积细胞范围终产物(滞留物)目标体积(ml)0<(活+死)细胞总数≤7.1e101507.1e10<(活+死)细胞总数≤1.1e112001.1e11<(活+死)细胞总数≤1.5e11250表16：产物目标体积有核细胞总数(tnc)×106终产物(滞留物)目标体积(ml)23.要达到表16中的指定体积，触摸“终产物体积(ml)”输入字段。显示数字键盘。输入所需终产物体积(以ml为单位)。触摸按钮以接受输入。24.触摸“终产物体积(滞留物体积)”屏幕，以返回到“程序设置”屏幕。注：“屏幕5”至“屏幕8”没有供操作员填写的任何输入字段。25.验证：“参数配置”按钮中显示“检查”。如果未显示“检查”，再次触摸“程序信息”按钮，并确保第1页上的“来源体积”和“来源pcv”中有条目。还要确保已选中“目标最小终产物量”复选框，或者“终产物体积(ml)”字段在第4页上有一个条目。26.触摸屏幕右上角的“评估”按钮。27.显示“评估概要”屏幕。确认“源”和“plasmalyte洗涤缓冲液”的足够和准确的值。28.装载一次性套件：通过选择帮助按钮“(？)”，按照屏幕指示进行套件装载。29.记下显示的“滤液”和“溶液1”(显示plasmalyte)的体积。30.记下显示的“滤液”和“溶液1”(显示plasmalyte)的体积。31.有关装载一次性套件的说明，触摸帮助按钮或者遵循操作员手册中的说明以获取详细说明。32.装入标准lovo一次性套件后，触摸“下一步”按钮。显示“容器信息和位置”屏幕。从#3秤中取出滤液袋。33.对于此方案，“滤液”容器是“新的(new)”和“偏离刻度(offscale)”。34.如果“滤液”容器已显示为“新的”和“偏离刻度”，则不进行任何更改。35.如果“过滤容器”类型显示为“原始”，触摸“原始”按钮以切换到“新的”。36.如果“滤液”位置显示为“刻度内(on-scale)”，触摸“刻度内”按钮以切换到“偏离刻度”。37.如果产生的“滤液”体积小于2500ml，则将“滤液容器位置”显示为“刻度内”。为了确保运行之间的一致性，将“滤液容器位置”更改为“偏离刻度”，容器类型为“新的”。38.触摸“刻度内”按钮以切换到“偏离刻度”。连接转运装置。使用无菌连接技术，将lovo一次性套件“滤液”容器替换为10l袋子。打开连接处。39.将“滤液”容器放在工作台上。不要将“滤液”袋子挂在#3秤上。在此过程中，#3秤为空。40.打开通向“滤液”容器的管线上的所有塑料夹子。注：如果在连接过程中从f夹上拆下了管子，更换夹子。41.触摸“过滤容器容量”输入字段。显示数字键盘。输入新的滤液总容量(10,000ml)。触摸“检查”按钮以接受输入。42.使用无菌连接技术将lovo一次性套件“滤液”容器替换为10l袋子。打开连接处。注：如果在连接过程中从f夹上拆下了管子，更换夹子。43.将新的“滤液”容器放在工作台上。不要将“滤液”袋子挂在#3秤上。程序过程中#3秤为空。44.打开通向“滤液”容器的管线上的所有塑料夹子。45.对于“滞留物”容器，屏幕显示“原始”和“刻度内”。46.对“滞留物”容器未做任何更改。47.对“滤液”容器进行所有更改并输入适当的信息后，触摸“下一步”按钮。48.“一次性套件干燥检查”覆盖(overlay)显示。检查套件是否正确装入，然后按“是”按钮。49.所有lovo机械夹子均自动关闭，并显示“检查一次性套件安装”屏幕。lovo经历了一系列加压步骤以检查套件。50.一次性套件检查成功通过后，将显示“连接溶液”屏幕。51.洗涤体积是3l。在屏幕上输入此值。52.使用无菌连接技术将3-lplasmalyte袋连接到穿过夹子1的管线。打开连接处。53.将plasmalyte袋挂在静脉输液架上。54.打开通向plasmalyte袋的管线上的所有塑料夹子。55.验证“溶液体积”条目为3000ml。这是先前输入的。56.触摸“下一步”按钮。“一次性套件灌注(disposablekitprime)”覆盖显示。验证是否已连接plasmalyte，并且通向plasmalyte的管线上的所有连接处和塑料夹子都已打开，然后触摸“是”按钮。注：由于在lovo程序中仅使用一种类型的洗涤缓冲液(plasmalyte)，因此没有溶液附着在穿过“夹子2”的管线上。在此过程中，该管子上的roberts夹保持关闭状态。57.“一次性套件灌注”启动，显示“灌注一次性套件”屏幕。肉眼观察到plasmalyte通过连接到plasmalyte袋的管子移动。如果没有流体在移动，按下屏幕上的“暂停”按钮，确定夹子或者连接处是否仍被关闭。解决问题后，按屏幕上的“继续”按钮以继续使用“一次性套件灌注”。58.一次性套件灌注成功完成后，将显示“连接源”屏幕。59.对于此方案，“源”容器是“新的”和“偏离刻度”。60.如果“源”容器已显示为“新的”和“偏离刻度”，则不进行任何更改。61.如果“源”位置显示为“刻度内”，触摸“刻度内”按钮以切换到“偏离刻度”。62.触摸“源容量”(ml)输入字段。显示数字键盘。输入容纳“源”产物的容器的容量。触摸检查按钮以接受输入。注：“源容量”条目用于确保“源”袋能够容纳“源灌注(sourceprime)”阶段加到袋中的其他溶液。63.使用无菌连接技术将源容器(sourcecontainer)连接到穿过夹子s的管线。打开连接处。视需要从夹子上拆下管线。64.确保将源管替换为s型夹。65.触摸“下一步”按钮。“源灌注”覆盖显示。验证“源”是否已连接至一次性套件，通向“源”的管线上的所有连接处和塑料夹子都已打开，然后触摸“是”按钮。66.启动“源灌注”，并显示“灌注源”屏幕。肉眼观察到plasmalyte正在穿过与“源”袋相连的管线。如果没有流体在移动，按下屏幕上的“暂停”按钮，确定夹子或者连接处是否仍被关闭。解决问题后，按屏幕上的“继续”按钮以恢复“源灌注”。67.当“源灌注”成功完成时，将显示“启动程序”屏幕。68.按下“开始”按钮。出现“预洗涤周期1”暂停屏幕，并带有“涂布ip，混合源”的说明。69.预涂ip袋。70.按下“开始”按钮之前，从#2秤取下ip袋(也可以从ip顶部端口管线导板上取下管线)，然后手动将其倒置，使在一次性套件灌注步骤中添加的洗涤缓冲液能够涂满袋子的所有内表面。71.将ip袋子重新挂在#2秤上(袋子上的标签朝左)。如果卸下了顶部端口管线，则更换顶部端口管线。72.混合“源”袋。73.按下“开始”按钮之前，将“源”袋从#1秤上移开，并翻转几次，以形成均匀的细胞悬液。74.将“源”袋重新挂在#1秤或者静脉输液架上。确保袋子没有摆动。75.按下“开始”按钮。76.lovo开始处理“源”袋中的液体，显示“洗涤周期1”屏幕。在lovo程序期间，系统会自动暂停以允许操作员处理不同袋子。在不同的暂停期间显示不同的屏幕。遵循每个屏幕的相应说明。“源冲洗暂停”。排空“源”袋后，lovo将洗涤缓冲液加入“源”袋中以冲洗袋子。将配置好的体积的洗涤缓冲液加入“源”袋中后，lovo自动暂停并显示“源冲洗暂停”屏幕。当显示“源冲洗暂停”屏幕时，操作员：1.从#1秤中取出“源”袋。1.多次翻转“源”袋，以使洗涤缓冲液接触到整个袋的内部。2.重新将“源”袋挂在#1秤上。确保“源”袋没有在#1秤上摆动。3.按下“恢复”按钮。lovo处理“源”袋的洗涤液，然后继续进行自动化程序。混合ip袋暂停。为了制备再次通过旋转器的细胞，用洗涤缓冲液稀释ip袋。将洗涤缓冲液加入ip袋中后，lovo自动暂停并显示“混合ip袋”暂停屏幕。当显示“混合ip袋”暂停屏幕时，操作员：1.从#2秤中取出ip袋。也可以从ip顶部端口管线导板卸下管线。2.多次倒转ip袋，彻底混合细胞悬液。3.将ip袋重新挂在#2秤上。如果已卸下，还要更换管线导板中的ip顶部端口管线。确保ip袋没有在#2秤上摆动。4.按下“恢复”按钮。lovo开始处理ip袋中的液体。“按摩ip拐角(massageipcorner)”暂停在lovo程序的最后洗涤周期中，将细胞从ip袋中抽出，通过旋转器，然后泵入滞留物(终产物)袋中。当ip袋为空时，将10ml洗涤缓冲液加入ip袋的底部以冲洗袋。添加洗涤液后，lovo自动暂停并显示“按摩ip拐角”暂停屏幕。当显示“按摩ip拐角”暂停屏幕时，操作员：1.请勿从#2秤中取出ip袋。2.在ip袋仍悬液在#2秤上的情况下，按摩袋子的拐角，使残留的细胞悬浮。3.确保ip袋没有在#2秤上摆动。4.按下“恢复”按钮。5.lovo开始从ip袋中抽出洗涤液。在lovo过程结束时，将显示“取出产物”屏幕。当显示此屏幕时，可以操作lovo套件上的所有袋子。注：直至屏幕显示“取出产物”，才可以触摸任何袋子。在非常靠近“滞留物”袋上的端口的管线位置放置止血钳(hemostat)，防止细胞悬液沉淀到管线中，在止血钳下方进行三重热封。断开中间的密封，取出“滞留物”袋，将其转移至bsc。按照“取出产物”屏幕上的说明进行操作。触摸“下一步”按钮。打开所有lovo机械夹子，显示“拆卸套件”屏幕。按照“拆卸套件”屏幕上的说明进行操作。完成后继续。触摸“下一步”按钮。关闭所有lovo机械夹子，并显示“结果概要”屏幕。将“结果概要”屏幕的数据记录在表17。关闭所有泵、过滤支架。表17：lovo结果概要表触摸“下一步”按钮。显示“方案选择”屏幕。lovo关机程序1.确保所有夹子都已关闭并且过滤器支架处于直立位置。2.触摸lovo前面的“停止”按钮。3.“停止按钮决定”覆盖显示。4.“关机确认”覆盖显示。5.触摸“是”按钮。显示“正在关机”屏幕。6.几秒钟后，显示“电源关闭”屏幕。当显示此屏幕时，使用仪器左后方的开关，关闭lovo。在表格中记录最终配制的产物的体积。由终产物表格计算所需的il-2量。确定冻存袋的数量和保留体积。在以下“目标体积和保留”表格上标记冷冻保存袋的数量和产品保留样品的体积。目标体积/袋计算：(最终配制体积-由于未获得100％回收率的体积调整＝10ml)/#袋。用1：1(体积：体积)的cs10(cryostor10，biolifesolutions)：il-2制备细胞。1.组装连接设备。1.1.将cs750冻存袋无菌连接到cc2cellconnect设备上，替换各个袋的一个远端公鲁尔接头。1.2.将夹子保持在关闭位置。1.3.给袋子1-4贴上标签。2.用il-2制备细胞，连接仪器。2.1.在bsc中，用具有鲁尔接头的4"血浆转运装置连接细胞产物袋。确保转运装置上的夹子已关闭。2.2.用适当尺寸的注射器，吸取根据终产物表格确定的il-2工作稀释液的体积。2.3.分配到lovo产物中。2.4.将lovo产物袋无菌连接到cc2单尖嘴管线，除去尖嘴。2.5.将细胞和仪器放在转运袋中，在2℃至8℃下放置≤15分钟。3.添加cs103.1.在bsc中，将三通旋塞阀连接到冷cs10袋上的公鲁尔接头上。3.2.将适当尺寸的注射器连接到旋塞阀的母鲁尔接头上。3.3.打开袋子的夹子，吸取“最终配制产物体积”表中确定的cs10量。3.4.取下注射器并盖上红色盖子。3.5.如果需要多个注射器，重复。3.6.从2℃至8℃冰箱中取出细胞/cc2仪器，然后放入bsc中。3.7.将包含cs10的第一个注射器连接到旋塞阀的中间鲁尔接头。旋开旋塞阀，使通往cs750袋的管线处于“关闭”位置。3.8.缓慢并轻轻混合，将cs10(1：1，体积：体积)添加到细胞中。3.9.对cs10的其他注射器进行重复。将配制好的细胞产物加入冻存袋中。1.用对于放置在各个冻存袋的细胞体积而言大小适当的注射器替换注射器。2.混合细胞产物。3.打开通向细胞产物袋的夹子，取出适当的体积。4.旋开旋塞阀，将细胞产物袋置于“关闭”位置，将注射器中的内容物分配到#1冻存袋中。用注射器中的空气清洁管线。记录终产物体积。1.使用不必要的端口和适当尺寸的注射器，吸出先前确定的保留量。2.放置保留在标有“保留”的50ml锥形管中。3.使用连接至线束的注射器，将袋中的所有空气抽出，将细胞抽到经过袋子约1英寸进入管线处。夹紧、热封。置于2℃至8℃。4.旋紧旋塞阀，使冻存袋处于“关闭”位置。5.在细胞产物袋中混合细胞，使用新注射器和旋塞阀上的新注射器，对剩余的cs750袋重复步骤3至8，获得保留细胞。6.一旦产物在crf中，应将保留细胞放置一旁进行处理。程序降温仪(crf)程序(也参见实施例9)1.打开crf(cryomed程序降温仪，型号7454)和关联的便携式计算机。2.使用帐户和密码登录到计算机。3.打开位于桌面上的“程序降温仪”图标。4.单击主屏幕上的“运行”按钮。5.单击“打开文件”，单击“打开”。6.输入运行文件名称后接日期，格式为“运行mmddyyyy”。7.输入数据标签作为日期，不带破折号“mmddyyy”。8.关闭crf的门。9.单击“开始运行”。10.在下拉菜单上选择com6。11.单击“确定”。等待约30秒。12.当“文件下载”弹出时，单击“确定”。单击“保存”。(有关控制速率冷冻曲线的详细信息，参见实施例9。)13.等待按下绿色按钮，直至样品进入crf。冰箱保持在4℃直至准备添加。14.将样品加到crf。15.等待直至crf恢复到4℃。达到温度后，单击绿色的“继续”按钮。这启动程序，进入程序的下一步。16.对冻存袋进行以下目视检查(注：不检查过满或者未满)：容器完整性、端口完整性、密封完整性、细胞团块的存在和颗粒的存在。17.在各个袋子上放置经批准的吊牌标签。18.验证终产物标签，包括：批次#、产物名称、生产日期、产物数量、其他添加剂、储存温度和有效期。19.将各个冻存袋(带有吊牌)放入一个超大的袋子中。20.热封。21.放在冷盒中。22.各袋重复一次。23.将贴有标签的冻存袋放入预处理的盒中，将其转移至crf。24.将盒均匀分布在crf的机架中。25.将碳带热电偶套在中间盒上，或将虚拟袋子放在中间位置26.关闭crf的门。27.箱体温度达到4℃+/-1.5℃后，按下pcinterface软件上的“运行”。28.记录产物转移至crf的时间和腔室温度。样品质量控制的处理。1.视需要将以下材料无菌转移至bsc，并根据下表贴上标签：2.对于以下移液器，使用新的移液器：qc和“保留”表格3.送至qc：1个细胞计数管、1个内毒素管、1个支原体管、1个革兰染色管、1个再刺激管和1个流体管送至qc用于立即检测。将其余的重复试管放置在程序降温仪。4.联系qc主管，告知所需的检测。5.有关检测和储存说明，参见表18。表18：检测和储存说明细胞计数。对各个样品进行单细胞计数，记录数据，将计数原始数据附加到批次记录中。记录cellometer计数程序。验证已输入cellometer中的正确稀释度。配制后保留细胞的冷冻保存：1.将冻存管放在crf中。2.冻存完成后将其移至储存位置，记录放置在cfr中的日期和时间。记录移至ln2的日期和时间。微生物学检测1.向微生物实验室预定用于沉降板的测试。2.记录登录号。3.进行有氧和无氧无菌试验。4.确保板和瓶运送到微生物实验室。细胞产物袋的后冷冻保存(post-cryopreservation)1.运行完成后，停止冷冻机。可通过单击“停止”按钮或者按冷冻机键盘上的“返回”键来停止运行。2.从盒中取出冻存袋3.将盒转移至气相ln2。4.记录储存位置。5.再次打开文本输入窗口时，输入任何其他注释。无论运行停止方法如何，都会显示此窗口。6.打印文件报告，将其附加到标有运行批次#的批次记录中。7.终止“加热模式”，使用“退出”按钮关闭“运行”屏幕。实施例9：冷冻保存方法本实施例描述了使用cryomed程序降温仪，型号7454(thermoscientific)的til冷冻保存方法，该til由上述实施例8中所述的简化封闭程序制备。除实施例9中所述设备外，还使用以下设备：铝制盒支架(与cs750冻存袋兼容)、用于750ml袋的冷冻储存盒、低压(22psi)液氮罐、冰箱、热电偶传感器(用于包装袋的色带类型)和cryostorecs750冻存袋(origenscientific)。冷冻过程提供从成核到-20℃的0.5℃/分钟速率以及冷却到-80℃最终温度的1℃/分钟速率。程序参数如下：步骤1：在4℃下等待；步骤2：1.0℃/分钟(样品温度)至-4℃；步骤3：20.0℃/分钟(腔室温度)至-45℃；步骤4：10.0℃/分钟(腔室温度)至-10.0℃；步骤5：0.5℃/分钟(腔室温度)至-20℃；步骤6：1.0℃/分钟(样品温度)至-80℃。该实施例的过程与实施例1至8的过程的结合图示于图11中。实施例10：过程2atil的表征本实施例描述了用上述简化封闭程序制备的til的特性。总之，与表19所示的现有til生产方法相比，简化封闭程序(过程2a，在实施例1至9中进行了描述)具有优势。pre-rep的优势包括：各个烧瓶中肿瘤碎片增加、培养时间缩短、步骤数减少和/或可适用于封闭系统。pre-rep向rep转变的优势包括：从pre-rep到rep的过程缩短、步骤数减少、免除表型选择和/或可适用于封闭系统。rep的优点包括：步骤数减少、rep持续时间缩短、封闭系统地在烧瓶之间进行til的转移和/或封闭系统地进行培养基交换。收获的优势包括：步骤数减少、自动细胞洗涤、封闭系统以及洗涤过程中产物损失减少。最终制剂和/或最终产物的优势可以包括：运输灵活。表19：示例性过程1c与过程2a的实施方式的比较使用源自表20中描述的9个肿瘤的til进行了总共9个实验。此处显示的所有数据均来自过程1c和过程2a的一个实施方式的解冻的冷冻til产物。表20：肿瘤供体、处理日期和处理位置的描述在此实施例中，使用本文所述过程2a的过程来生产用于表征的til。简而言之，对于rep，在第11天，准备一个装有5lcm2，并补充3000iu/mlrhil-2、30ng/ml抗cd3(克隆okt3)和5×109经辐照的同种异体饲养pbmc细胞的g-rex-500m烧瓶。对减小体积后从pre-repg-rex-100m烧瓶收获的til进行计数，并以5×106至200×106的密度将细胞接种到g-rex-500m烧瓶中。然后将烧瓶放在潮湿的37℃、5％co2组织培养箱中5天。在第16天，减少g-rex-500m烧瓶的体积，计数til并确定它们的活力。此时，将til扩增至多个g-rex-500m烧瓶(最多六个烧瓶)，各个烧瓶的接种密度为1×109个til/烧瓶。然后将所有烧瓶再置于潮湿的37℃、5％co2组织培养箱中6天。在第22天(收获日)，将各个烧瓶的体积减少90％，将细胞合并在一起，通过170μm血液过滤器过滤，然后收集到3loriginev3000袋或者等同物中，准备使用lovo进行自动洗涤。使用lovo自动细胞处理系统洗涤til，该系统用由含有1％hsa的plasmalyte-a组成的洗涤缓冲液替换99.99％的细胞培养基。lovo使用旋转过滤膜技术运行，可回收92％的til，同时实际上消除了残留的组织培养成分，包括血清、生长因子和细胞因子，以及其他碎片和颗粒。洗涤完成后，进行细胞计数，确定til的扩增及其在收获时的活力。以1：1(体积：体积)的比率将cs10加入洗涤后的til中，以获得过程2a的最终制剂。将最终配制的产物等分到冻存袋中，密封，放入预冷的铝制盒中。然后根据本文(包括实施例9)所述方法，使用cryomed程序降温仪(thermofisherscientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)冷冻装有til的冻存袋。在图12和图13中比较了这9次的细胞计数和活力百分比。使用合适的市售试剂，使用流式细胞术(cantoii流式细胞仪，becton，dickinson和co.，franklinlakes，新泽西州，美国)分析以下结果中显示的细胞表面标志物。目标标志物的结果显示在图14至图23中。已使用多种方法来测量基因组dna和细胞学制剂中端粒的长度。端粒限制性片段(trf)分析是测量端粒长度的黄金标准(delange等，1990年)。但是，trf的主要局限性是需要大量的dna(1.5μg)。在这里，应用了两种广泛使用的端粒长度测量技术，即荧光原位杂交(fish)和定量pcr。使用dako试剂盒(对于流式细胞术，k532711-8ruo代码k5327端粒pna试剂盒/fitc，pnafish试剂盒/fitc.flow，20个检测)进行flow-fish，并按照制造商的说明测量端粒重复的平均长度。简言之，在4℃下用cd3apc对细胞表面染色20分钟，然后用gamalexa546染色20分钟。然后将抗原-抗体复合物与2mmbs3(fisherscientific)化学交联剂交联。在各个检测中，pna端粒探针在具有长端粒的标准t细胞群jurkat1301t白血病细胞系(1301细胞)中的结合用作内部参考标准。抗体孵育后对单个til进行计数，并以1：1的细胞比率与1301细胞(atcc)混合。将5×105个til与5×105个1301细胞混合。在有和没有fitc偶联的端粒pna探针(panagene)fitc-00-ccc-taa-ccc-taa-ccc-taa(其与端粒重复序列互补，终浓度为60nm)的情况下，一式两份地在杂交溶液(70％甲酰胺，1％bsa，20mmtrisph7.0)进行原位杂交。加入端粒pna探针后，将细胞在振荡水浴中于81℃孵育10分钟。然后将细胞在室温下置于黑暗中过夜。第二天早晨，通过用预热至40℃的pbs洗涤2次，去除过量的端粒探针。洗涤后，以75ng/ml的终浓度添加dapi(invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚)。用dapi进行的dna染色用于门控g0/g1群中的细胞。使用我们的流式细胞仪(bdcantoii，山景城，加利福尼亚)进行样品分析。根据以下公式，将检测样品的端粒荧光表示为1301细胞的荧光(f1)百分比：相对端粒长度＝[(平均fitcfl测试细胞w/探针-平均fitcfl测试细胞w/o探针)×1301细胞的dna指数×100]/[(平均fitcfl1301细胞w/探针-平均fitcfl1301细胞w/o探针)×测试细胞的dna指数。实时定量pcr还用于测量相对端粒长度(nucleicacidsres.2002年5月15日；30(10)：e47.，20，leukemia，2013，27，897-906)。简而言之，使用96孔形式的bioradpcr热循环仪(hercules，ca)确定端粒重复拷贝数与单基因拷贝数(t/s)的比率。将10ng的基因组dna用于端粒或者血红蛋白(hgb)pcr反应，使用的引物如下：tel-lb引物(cggtttgtttgggtttgggtttgggtttgggtttgggtt)、tel-2b引物(ggcttgccttacccttacccttacccttacccttaccct)、hgbl引物(gcttctgacacaactgtgttcactagc)和hgb2引物(caccaacttcatccacacgttcacc)。通过端粒和血红蛋白反应对所有样品进行分析，一式三份地在同一平板上进行分析。除检测样品外，各个96孔板均使用从1301细胞株分离的基因组dna绘制了0.08ng至250ng的五点标准曲线。通过从中值端粒ct值中减去中值血红蛋白阈值循环(ct)值来计算每个样品的t/s比(-dct)。通过从每个未知样品的t/s比中减去10.0ng标准曲线点的t/s比以确定相对t/s比(-ddct)。flow-fish结果显示在图24和图25中，并且过程1c和过程2a之间未观察到显著差异，这表明由过程2a产生的til的令人惊讶的性质是不能仅从til的年龄就可以预测的。总之，过程2a产生了具有“年轻”表型的有效til产物，该“年轻”表型由高水平的共刺激分子、低水平的耗尽标志物和重新活化后分泌细胞因子的能力所定义。简化的22天扩增平台可为急需治疗的患者快速生成临床规模剂量的til。冷冻保存的药品具有重要物流效率，可快速生产并灵活分配。此次扩增方法克服了无法广泛应用til治疗的传统障碍。实施例11：il-2、il-15和il-21细胞因子混合物(cocktail)的使用本实施例描述了与实施例1至10的til方法结合的il-2、il-15和il-21细胞因子(充当另外的t细胞生长因子)的使用。使用实施例1至10的方法，在一只实验臂中，在il-2存在下，从结直肠癌、黑色素瘤、宫颈癌、三阴性乳腺、肺和肾肿瘤中生长til，以及在另一臂中，在开始培养时，用il-2、il-15和il-21代替il-2。pre-rep完成后，评估培养物的扩增、表型、功能(cd107a+和ifn-γ)和tcrνβ库。il-15和il-21在本文其他地方以及gruijl等的文章中都有描述，il-21以高细胞毒性潜力促进cd27+cd28+肿瘤浸润淋巴细胞的扩增和附带促进调节性t细胞的低扩增，santegoets,s.j.,jtranslmed.,2013,11:37(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc3626797/)。结果显示，相对于仅使用il-2的情况，在多种组织学类型中观察到在il-2、il-15和il-21处理的条件下cd4+和cd8+细胞的til扩增均增强(>20％)。相对于仅il-2的培养物，从il-2、il-15和il-21处理的培养物获得的til向主导的cd8+群(具有偏向的tcrνβ谱系)倾斜。与仅用il-2处理的til相比，在用il-2、il-15和il-21处理的til中ifn-γ和cd107a升高。实施例12：黑色素瘤的ii期多中心三队列研究该ii期多中心三队列研究旨在评估根据过程1c(如本文所述)生产的til治疗在转移性黑色素瘤患者中的安全性和有效性。第一队列和第二队列将分别招募30名患者，第三队列是至多10名患者的第二次til输注的再治疗队列。前两个队列正在评估两个不同的生产过程：过程1c和过程2a的一个实施方式(分别描述于实施例1至10)。第一队列的患者接受新鲜的非冷冻保存的til，而第二队列组的患者接受通过实施例1至10中所述方法制造的产物(得到冷冻保存的产物)。研究设计显示在图26中。该研究是ii期多中心三队列研究，旨在评估自体til治疗转移性黑色素瘤患者亚群的安全性和有效性。关键纳入标准包括：可测量的转移性黑色素瘤和≥1个可切除用于产生til的病灶；至少一项先前的全身治疗；年龄>18岁；以及ecog表现状态为0-1。治疗队列包括未冷冻保存的til产物(使用过程1c制备)、冷冻保存的til产物(使用过程2a的一个实施方式制备)以及用til产物对无反应或者在初始反应后进展的患者进行重新治疗。主要终点是安全性，次要终点是疗效，其被定义为客观缓解率(orr，objectiveresponserate)、完全缓解率(crr，completeremissionrate)、无进展生存期(pfs，progressionfreesurvival)、缓解持续时间(dor，durationofresponse)和总体生存期(os，overallsurvival)。实施例13：鉴定单个批次的经伽马射线辐照的外周单核细胞此实施例描述了用于鉴定单个批次的经γ-辐照的外周单核细胞(pbmc，也称为mnc)的新型简化方法，所述经γ-辐照的外周单核细胞在本文所述的示例性方法中用作同种异体饲养细胞。每个经辐照的mnc饲养批次由一个单独供体制备。在纯化的抗cd3(克隆okt3)抗体和白细胞介素-2(il-2)存在下，单独筛选每个批次或供体在rep中扩增til的能力。此外，在不添加til的情况下，测试各饲养细胞批次，以验证接收的γ辐照剂量足以使它们复制机能不全。定义/缩写bsc：生物安全柜cd3：分化簇3；t淋巴细胞的表面标志蛋白cf：离心cm2：用于til的完全培养基#cmo：合同加工外包(contractmanufacturingorganization)co2：二氧化碳etoh：乙醇gmp：生产质量管理规范il-2：白细胞介素2iu：国际单位ln2：液氮mini-rep：小型快速扩增方案(mini-rapidexpansionprotocol)ml：毫升mnc：单核细胞na：不适用okt3：macsgmpcd3纯(克隆okt3)抗体ppe：个人防护装备pre-rep：快速扩增方案之前qs：适量；填充至该量rep：快速扩增方案til：肿瘤浸润淋巴细胞t25：25cm2组织培养瓶μg：微克μl：微升步骤背景7.1.1对于til的rep，需要经γ-辐照的生长停滞的mnc饲养细胞。饲养细胞mnc上的膜受体与抗cd3(克隆okt3)抗体结合并在rep烧瓶中与til交联，刺激til扩增。通过取自个体供体的全血白细胞除去法(leukapheresis)，制备饲养批次。在gmp条件下，将白细胞除去法的产物在ficoll-hypaque上离心、洗涤、辐照并冷冻保存。7.1.2重要的是接受til治疗的患者不要注入活饲养细胞，因为这可能导致移植物抗宿主病(gvhd)。因此，通过用γ-辐照饲养细胞使细胞生长停滞，这导致双链dna断裂和再培养时mnc细胞的细胞活力丧失。评估标准和实验设置按两个标准评价饲养批次：1)它们在共培养中扩增til的能力>100倍和2)它们复制机能不全。7.2.2使用在直立t25组织培养瓶中生长的两种主要的pre-reptil品系，以mini-rep形式测试饲养批次。7.2.3针对两种不同的til品系测试饲养批次，每种til品系在rep中响应活化而增殖的能力都是独特的。7.2.4作为对照，许多经辐照的mnc饲养细胞与试验批次一起进行，这些经辐照的mnc饲养细胞已被证明符合7.2.1的标准。7.2.5为确保在单个实验中测试的所有批次都能进行相同的测试，可以使用相同的pre-reptil品系的足够储备来测试所有条件和所有饲养批次。7.2.6对于测试的每批饲养细胞，共有6个t25烧瓶：7.2.6.1pre-reptil品系#1(2个烧瓶)7.2.6.2pre-reptil品系#2(2个烧瓶)7.2.6.3饲养细胞对照组(2个烧瓶)注：用包含til品系#1和#2的烧瓶评估了饲养细胞批次扩增til的能力。用饲养细胞对照烧瓶评估了饲养细胞批次的复制机能不全。实验方案7.3.1第2/3天，解冻til品系7.3.1.1制备cm2培养基7.3.1.2在37℃水浴中加热cm2。7.3.1.3制备40ml补充有3000iu/mlil-2的cm2。保温直至使用。7.3.1.4将不含il-2的20ml预热的cm2放入两个50ml锥形管的每一个中，所述锥形管标记有所用til品系的名称。7.3.1.5从ln2储存器中取出两种指定的pre-reptil品系并将小管转移至组织培养室。7.3.1.6记录til品系标识。7.3.1.7将解冻的小管置于37℃水浴中的密封拉链储存袋中，直至留下少量冰。7.3.1.8用70％乙醇喷洒或擦拭解冻的小管并将小管转移至bsc。7.3.1.9使用无菌转移移液管，将小管中的内容物立即转移至制备且标记的50ml锥形管内的20mlcm2中。7.3.1.10使用qs至40ml的不含il-2的cm2洗涤细胞。7.3.1.11以400×cf离心5分钟。7.3.1.12吸取上清液并重悬于5ml温热的补充有3000iu/mlil-2的cm2中。7.3.1.13一式两份取出小等分试样(20μl)，使用自动细胞计数器进行细胞计数。记录计数。7.3.1.14计数时，将装有til细胞的50ml锥形管放入湿润的、37℃、5％co2培养箱中，盖帽松开以便进行气体交换。7.3.1.15测定细胞浓度并在补充有3000iu/mlil-2的cm2中将til稀释至1×106个细胞/ml。7.3.1.16在湿润的37℃培养箱中，在24孔组织培养板中视需要在多个孔中培养(2ml/孔)，直至mini-rep的第0天。7.3.1.17在不同的24孔组织培养板中培养不同的til品系，以避免混淆和潜在的交叉污染。7.3.2第0天，启动mini-rep7.3.2.1为待测试的饲养批次数准备足够的cm2培养基(例如，为了一次测试4个饲养批次，准备800ml的cm2培养基)。7.3.2.2将7.3.2.1中制备的一部分cm2等分并补充3000iu/mlil-2以用于培养细胞(例如，为了一次测试4个饲养批次，准备500ml含有3000iu/mlil-2的cm2培养基)。7.3.2.3如下所述，使用不含il-2的cm2的剩余部分洗涤细胞。7.3.2.4分别进行每个til品系，以防止交叉污染，将具有til培养物的24孔板从培养箱中取出并转移至bsc。7.3.2.5使用无菌移液管或100-1000μl移液器和吸头，从til的每个孔中取出约1ml培养基进行使用，并置于24孔组织培养板的未使用的孔中。这用于洗涤孔。7.3.2.6使用新的无菌移液管或100-1000μl移液器和吸头，在孔中混合剩余培养基和til，以重悬细胞，然后将细胞悬液转移至标有til名称的50ml锥形管中，记录体积。7.3.2.7用保留的培养基洗涤孔并将该体积转移至相同的50ml锥形管中。7.3.2.8以400×cf旋转细胞以收集细胞沉淀。7.3.2.9吸取培养基上清液，将细胞沉淀重悬于2-5ml含有3000iu/mlil-2的cm2培养基中；使用的体积基于获得的孔的数量和沉淀的大小，体积应足够确保浓度>1.3×106个细胞/ml。7.3.2.10用血清移液管彻底混合细胞悬液，记录体积。7.3.2.11取出200μl，使用自动细胞计数器进行细胞计数。7.3.2.12计数时，将含有til细胞的50ml锥形管置于湿润的、5％co2、37℃培养箱中，盖帽松开以允许气体交换。7.3.2.13记录计数。7.3.2.14从培养箱中取出含有til细胞的50ml锥形管，将细胞以1.3×106细胞/ml的浓度重悬于补充有3000iu/mlil-2的温热cm2中。将帽松动的50ml锥形管放回培养箱中。7.3.2.15视需要，保留原24孔板以重新培养任何残留的til。7.3.2.16对于第二til品系，重复步骤7.3.2.4-7.3.2.15。7.3.2.17在将til接种到t25烧瓶中进行实验即刻之前，按照下文的步骤7.3.2.35，将til以1：10稀释至终浓度为1.3×105个细胞/ml。制备macsgmpcd3纯(okt3)工作溶液7.3.2.18从4℃冰箱中取出okt3(1mg/ml)的储备溶液并置于bsc中。7.3.2.19在mini-rep的培养基中使用30ng/mlokt3的终浓度。7.3.2.20实验的每个t25烧瓶中的20ml需要600ngokt3；对于每个20ml，这相当于60μl的10μg/ml溶液，或者对于每个饲养批次测试的所有6个烧瓶，相当于360μl。7.3.2.21对于每个测试的饲养批次，制备400μl1：100稀释的1mg/mlokt3，工作浓度为10μg/ml(例如，一次测试4个饲养批次，制成1600μl1：100稀释的1mg/mlokt3：16μl1mg/mlokt3+1.584ml含3000iu/mlil-2的cm2培养基)准备t25烧瓶7.3.2.22在各个烧瓶上标记测试的til品系名称、烧瓶重复数、饲养批次、日期和分析人员的姓名缩写。7.3.2.23在制备饲养细胞之前，用cm2培养基填充烧瓶。7.3.2.24在等待添加其余组分时，将烧瓶放入37℃湿润的5％co2培养箱中，以保持培养基温暖。7.3.2.25一旦制备了饲养细胞，将组分添加到各个烧瓶的cm2中。制备macsgmpcd3纯(okt3)工作溶液。表21：溶液制备饲养细胞7.3.2.26对于本方案，每批测试需要至少78×106个饲养细胞。通过sdbb冷冻的每个1ml小管在冷冻时具有100×106个活细胞。假设从ln2储存器解冻后恢复50％，建议每批解冻至少两个1ml小管饲养细胞，得到估计100×106个活细胞用于每个rep。或者，如果在1.8ml小管中提供，则仅需一个小管就可以提供足够的饲养细胞。7.3.2.27在解冻饲养细胞之前，对于每个待测试的饲养批次，预加热约50ml不含il-2的cm2。7.3.2.28从ln2储存器中取出指定的饲养批次小管，放入拉链储存袋中并置于冰上。将小管转移至组织培养室。7.3.2.29将密封拉链储存袋中的小管浸入37℃水浴中解冻。7.3.2.30从拉链袋中取出小管，用70％etoh喷洒或擦拭，将小管移至bsc。7.3.2.31使用转移移液管，将饲养小管的内容物立即转移至50ml锥形管中的30ml温热cm2中。用少量cm2洗涤小管以除去小管中的任何残留细胞。7.3.2.3在400×cf下离心5分钟。7.3.2.33吸走上清液并重悬于4ml温热的加有3000iu/mlil-2的cm2中。7.3.2.34取出200μl，使用自动细胞计数器进行细胞计数。记录计数。7.3.2.34以1.3×107个细胞/ml将细胞重悬于温热的加有3000iu/mlil-2的cm2。7.3.2.34将til细胞从1.3×106个细胞/ml稀释至1.3×105个细胞/ml。独立处理每个til品系以防止交叉污染。共培养设置7.3.2.36将til细胞从1.3×106个细胞/ml稀释至1.3×105个细胞/ml。独立处理每个til品系以防止交叉污染。7.3.2.36.1将4.5mlcm2培养基加入15ml锥形管中。7.3.2.36.2从培养箱中取出til细胞，用10ml血清移液管重悬til细胞。7.3.2.36.3从1.3×106个细胞/ml的til悬液中取出0.5ml细胞，并加至15ml锥形管中的4.5ml培养基中。将til储存瓶放回培养箱。7.3.2.36.4混合均匀。7.3.2.36.5对第二til品系，重复步骤7.3.2.36.1-7.3.2.36.4。7.3.2.36.6如果一次测试多个饲养批次，在涂布til之前将每个饲养批次的til稀释至较低浓度。7.3.2.37将单个饲养批次的装有预热培养基的烧瓶从培养箱转移至bsc。7.3.2.38通过用1ml移液管尖端上下吹吸几次来混合饲养细胞，将1ml(1.3×107个细胞)转移至各个烧瓶中用于该饲养批次。7.3.2.39向各个烧瓶中加入60μlokt3工作储备溶液(10μg/ml)。7.3.2.40将两个对照烧瓶放回培养箱。7.3.2.41将每个til批次的1ml(1.3×105)转移至相应标记的t25烧瓶中。7.3.2.42将烧瓶放回培养箱中并直立孵育。第5天之前不要扰动。7.3.2.43所有测试的饲养批次均重复7.3.2.36-7.3.2.42。第5天，更换培养基7.3.3.1制备具有3000iu/mlil-2的cm2。各个烧瓶需要10ml。7.3.3.2为防止交叉污染，一次处理一个饲养批次的烧瓶。从培养箱中取出烧瓶并转移至bsc，并注意不要扰动烧瓶底部的细胞层。7.3.3.3重复所有烧瓶，包括对照烧瓶。7.3.3.4用10ml移液管，将10ml温热的具有3000iu/mlil-2的cm2加到各个烧瓶中。7.3.3.5将烧瓶放回培养箱中并直立孵育至第7天。对所有测试的饲养批次重复7.3.3.1-7.3.3.6。第7天，收获7.3.4.1为防止交叉污染，一次处理一个饲养批次的烧瓶。7.3.4.2从培养箱中取出烧瓶并转移至bsc，并注意不要扰动烧瓶底部的细胞层。7.3.4.3不扰动生长在烧瓶底部的细胞地从每个试验瓶中取出10ml培养基，从每个对照烧瓶中取出15ml培养基。7.3.4.4使用10ml血清移液管，将细胞重悬于剩余培养基中并充分混合以破碎任何细胞团块。7.3.4.5记录各个烧瓶的体积。7.3.4.6通过移液吹吸彻底混匀细胞悬液后，取出200μl进行细胞计数。7.3.4.7使用适当的标准操作程序与自动细胞计数器设备对til计数。7.3.4.8记录第7天的计数。7.3.4.9对所有测试的饲养批次重复7.3.4.1-7.3.4.8。7.3.4.10根据表21(下文)中列出的标准，评价饲养细胞对照烧瓶的复制机能不全，并评价含有til的烧瓶从第0天开始的倍数扩增。第7天，继续培养饲养细胞对照烧瓶至第14天7.3.5.1在对第7天的饲养细胞对照烧瓶计数完成后，向每个对照烧瓶中加入15ml含有3000iu/mlil-2的新鲜cm2培养基。7.3.5.2将对照烧瓶放回培养箱中并直立培养至第14天。第14天，饲养细胞对照烧瓶的继续的(extended)不增殖7.3.6.1为防止交叉污染，一次处理一个饲养细胞批次的烧瓶。7.3.6.2从培养箱中取出烧瓶并转移至bsc中，注意不要扰动烧瓶底部的细胞层。7.3.6.3在不扰动烧瓶底部生长的细胞的情况下，从每个对照烧瓶中取出约17ml培养基。7.3.6.4使用5ml血清移液管，将细胞重悬于剩余的培养基中并充分混合以破碎任何细胞团块。7.3.6.5记录各个烧瓶的体积。7.3.6.6通过移液吹吸彻底混合细胞悬液后，取出200μl进行细胞计数。7.3.6.7使用适当的标准操作程序与自动细胞计数器设备对til计数。7.3.6.8记录计数。7.3.6.9对所有测试的饲养批次重复7.3.4.1-7.3.4.8。结果和接受标准结果10.1.1γ辐照的剂量足够使饲养细胞复制机能不全。预计所有批次都符合评价标准，并且还证明与第0天相比，rep培养第7天剩余的饲养细胞的存活总数减少。10.1.2预计所有饲养批次都符合rep培养第7天til生长100倍扩增的评价标准。10.1.3预计饲养细胞对照烧瓶的第14天计数继续第7天所见的非增殖趋势。接受标准10.2.1对于测试的每批次饲养细胞，每个重复的til品系均满足以下接受标准。10.2.2接受为2倍，如下所示(概述于下表)：表22：接受标准测试接受标准辐照mnc/复制机能不全在第7天和第14天未观察到生长til扩增每个til至少扩增100倍(最少1.3×107个活细胞)10.2.2.1评估在30ng/mlokt3抗体和3000iu/mlil-2的存在下培养时，辐照剂量是否足够使mnc饲养细胞复制机能不全。10.2.2.1.1通过rep的第7天和第14天的自动细胞计数确定的活细胞总数(tvc)，来评估复制功能不全。10.2.2.1.2接受标准是“无生长”，意味着从rep的第0天投入培养的初始活细胞数开始，在第7天和第14天的活细胞总数没有增加。10.2.2.2评估饲养细胞支持til扩增的能力。10.2.2.2.1根据从rep第0天开始培养至rep第7天活细胞的倍数扩增，来测量til生长。10.2.2.2.2在第7天，通过自动细胞计数评估，til培养物达到最小100倍的扩增(即，大于在rep第0天投入培养的til活细胞总数的100倍)。10.2.2.3当一个批次不符合上述两个标准时，该批次将根据下文第10.3节中列出的应急计划进行重新测试。10.2.2.4对失败的批次进行重新测试后，任何不符合原评估和应急测试中两个接受标准的mnc饲养批次将被排除在外。10.2.2.5任何符合接受标准但被判断为相对于与相同pre-reptil品系并行测试的其他先前饲养批次扩增til的能力方面表现不佳的mnc饲养批次被酌情排除。不符合接受标准的mnc饲养批次的应急测试10.3.1如果mnc饲养批次不符合上文第10.2节中概述的任一接受标准，将采取以下步骤重新测试该批次，以排除简单的实验错误的原因。10.3.2如果该批次剩余了两个以上的卫星测试小管，那么该批次可以重新测试。如果该批次剩余一个或没有剩余卫星测试小管，则根据上文第10.2节中列出的接受标准，该批次失败。10.3.3两名经过培训的人员，包括评价该有问题的批次的原始人员，二人同时对该批次进行测试。10.3.4重复第7.2至7.3节，重新评估该有问题的批次。10.3.5每个人测试该有问题的批次以及对照批次(如上文第7.2.4节所定义的)。10.3.6为了合格，该有问题的批次和对照批次必须对于进行应急测试的两个人员都满足10.2节的接受标准。10.3.7符合这些标准后，该批次然后如上文第10.2节所述被用于cmo。实施例14：鉴定单个批次的经γ射线辐照的外周血单核细胞此实施例描述了用于鉴定单个批次的经γ-辐照的外周血单核细胞(pbmc)的新型简化方法，所述经γ-辐照的外周单核细胞在本文所述的示例性方法中用作同种异体饲养细胞。此实施例提供了评价经辐照的pbmc细胞批次用于临床生产til批次的方案。每个经辐照的pbmc批次均由单个供体制备。在超过100个鉴定方案中，据显示，在所有情况下，来自sdbb(圣地亚哥血库)的经辐照的pbmc批次在rep的第7天扩增的til>100倍。该改进的鉴定方案旨在适用于来自sdbb的经辐照的供体pbmc批次，其然后进一步进行测试以验证所接收的γ辐照剂量足够使其复制机能不全。一旦证明它们在14天的过程中保持复制机能不全，则认为供体pbmc批次是“合格的”以用于生产til临床批次。关键术语和定义μg：微克μl：微升aim-v：市售细胞培养基生物安全柜bsc：分化簇cd：til的完全培养基#2cm2：补充有3000iu/mlil-2的cm2cm2il2：合同加工外包co2：二氧化碳etoh：乙醇gmp：生产质量管理规范gy：灰色il：白细胞介素iu：国际单位ln2：液氮mi：毫升na：不适用okt3：抗cd3单克隆抗体名称p20：2-20μl移液器p200：20-200μl移液器pbmc：外周血单核细胞p1000：100-1000μl移液器ppe：个人防护装备rep：快速扩增方案sdbb：圣地亚哥血库til：肿瘤浸润淋巴细胞t25：25cm2组织培养瓶×g：“乘以重力”——相对离心力的量度样品包括经辐照的供体pbmc(sdbb)。程序背景7.1.1对于til的当前标准rep，需要经γ-辐照的生长停滞的pbmc。pbmc上的膜受体与抗cd3(克隆okt3)抗体结合并与培养物中的til交联，刺激til扩增。用个体供体的全血白细胞除去法制备pbmc批次。在gmp条件下，将全血白细胞除去法的产物在ficoll-hypaque上离心、洗涤、辐照并冷冻保存。重要的是接受til治疗的患者不能注射活的pbmc，因为这可能导致移植物抗宿主病(gvhd)。因此，通过施用细胞γ-辐照使供体pbmc生长停滞，导致双链dna断裂和再培养时pbmc的细胞活力丧失。评估标准7.2.1经辐照的pbmc批次的评价标准是：它们复制机能不全。实验装置7.3.1饲养批次以mini-rep形式进行测试，就好像它们与til共培养一样，使用直立的t25组织培养瓶。7.3.1.1对照批次：已被证明符合7.2.1标准的一批经辐照的pbmc作为对照与试验批次一起进行试验。7.3.2对于每批测试的辐照供体pbmc，测试重复的烧瓶。实验方案本方案中的所有组织培养工作均在bsc中使用无菌技术完成。第0天7.4.1为每批待测试的供体pbmc制备约90ml的cm2培养基。将cm2在37℃水浴中保持温热。7.4.2解冻6×106iu/mlil-2的等分试样。7.4.3将cm2培养基放回bsc，用70％etoh擦拭，然后放入罩中。对于每批测试的pbmc，将约60ml的cm2移至单独的无菌瓶中。将il-2从解冻的6×106iu/ml储备溶液加到该培养基，终浓度为3000iu/ml。将该瓶标记为“cm2/il2”(或类似)以将其与未补充的cm2区分开。7.4.4为每批待测试的pbmc标记两个t25烧瓶。标签最少包括：7.4.4.1批次7.4.4.2烧瓶号(1或2)7.4.4.3培养开始日期(第0天)制备okt37.4.5从4℃冰箱中取出抗cd3(okt3)的储备溶液并置于bsc中。7.4.6在mini-rep的培养基中使用终浓度为30ng/ml的okt3。7.4.7用1mg/ml储备溶液制备10μg/ml抗cd3(okt3)工作溶液。放入冰箱直至需要。7.4.7.1对于每个测试的pbmc批次，制备150μl1：100稀释的抗cd3(okt3)储备溶液。例如，为了一次测试4个pbmc批次，通过将6μl的1mg/ml储备溶液加入到594μl补充有3000iu/mlil-2的cm2中，制备600μl10μg/ml抗cd3(okt3)。准备烧瓶7.4.8将每瓶19mlcm2/il-2加入到标记的t25烧瓶中，制备细胞时将烧瓶置于37℃、湿润的、5％co2培养箱中。制备经辐照的pbmc7.4.9单独处理每个供体pbmc批次，以避免批次可能的交叉污染。7.4.10从ln2储存器中取出要测试的pbmc批次的小管。在解冻前将它们置于-80℃或保持在干冰上。7.4.11对于待解冻的每个批次，将30mlcm2(未补充il-2)放入50ml锥形管中。用待解冻的pbmc的不同批次编号标记每个管。将管盖紧，使用前将其置于37℃水浴中。视需要，将50ml锥形管放回bsc，用70％etoh擦拭，然后放入罩中。7.4.12从冷藏库中取出样品瓶pbmc，置于37℃水浴中的浮管架中解冻。解冻直至小管中残留少量冰。7.4.13用70％etoh喷洒或擦拭解冻的小管并转移至bsc。7.4.14使用无菌转移移液管，将小管中的内容物立即转移至50ml锥形管中的30mlcm2中。从管中取出约1ml培养基冲洗小管；将洗涤液放回50ml锥形管中。盖紧并轻轻旋转以洗涤细胞。7.4.15在室温下以400×g离心5分钟。7.4.16吸取上清液，用1000μl移液管尖端将细胞沉淀重悬于1ml温热的cm2/il-2中。或者，在添加培养基之前，通过沿着空试管架拖动加盖的管使细胞沉淀重悬。重悬细胞沉淀后，用cm2/il-2培养基将体积调至4ml。记录体积。7.4.17取出一小份等分试样(例如100μl)，使用自动细胞计数器进行细胞计数。7.4.17.1根据具体的自动细胞计数器sop，一式两份进行计数。最有可能需要在进行细胞计数之前对pbmc进行稀释。建议的起始稀释度为1：10，但这根据所用细胞计数器的类型而有所不同。7.4.17.2记录计数。7.4.18根据步骤7.4.15.2中的工作表，使用cm2/il-2培养基将pbmc的浓度调节至1.3×107个细胞/ml。通过温和地旋转或使用血清移液管上下轻轻吹吸混合均匀。设置培养烧瓶7.4.19将两个标记的t25烧瓶从组织培养箱放回bsc。7.4.20将10μg/ml抗cd3/okt3的小管放回bsc。7.4.21向各个烧瓶中加入1ml的1.3×107个pbmc细胞悬液。7.4.22向各个烧瓶中加入60μl的10μg/ml抗cd3/okt3。7.4.23将带盖的烧瓶放回组织培养箱培养14天，不要扰动。7.4.24将抗cd3/okt3小管放回冰箱中，直至下一批需要。7.4.25对每批待评估的pbmc重复步骤7.4.9-7.4.24。第14天，测量pbmc的无菌7.4.26独立处理每批产物，小心地将重复的t25烧瓶放回bsc。7.4.27对于各个烧瓶，使用新的10ml血清移液管，从各个烧瓶中取出约17ml，然后小心地拉起剩余的培养基以测量烧瓶中剩余的体积。记录体积。7.4.28使用相同的血清移液管上下吹吸以混合样品。7.4.29从各个烧瓶中取出200μl样品进行计数。7.4.30使用自动细胞计数器计数细胞。7.4.31对每批被评估的pbmc重复步骤7.4.26-7.4.31。结果和接受标准结果10.1.1预期γ辐照剂量足够使饲养细胞复制机能不全。预期所有批次均符合评价标准，并证明了与第0天相比，rep培养第14天剩余的饲养细胞的存活总数减少。接受标准10.2.1每个经辐照的供体pbmc批次均符合以下接受标准：10.2.2“无生长”--意味着第14天的活细胞总数小于rep第0天培养的初始活细胞数。10.2.3如果一批不符合上述标准，则根据10.4节中概述的应急测试程序对该批次进行重新测试。10.2.4对失败的批次进行重新测试后，任何原评估和应急测试中未达到接受标准的mnc饲养批次被排除。不符合接受标准的pbmc批次的应急测试10.4.1如果经辐照的供体pbmc批次不符合上述接受标准，则采取以下步骤重新测试该批次，以排除简单的实验者错误作为其失败的原因。10.4.2如果该批次剩余两个以上的卫星小管，那么该批次将被重新测试。如果该批次中剩余一个或没有剩余卫星小管，则根据上文第10.2节的接受标准，该批次失败。10.4.3只要有可能，两名经过培训的人员(最好包括评估该批次的原始人员)独立地对两个独立的小管进行测试。这是应急测试的首选方法。除了单独的pbmc小管外，两个人员均可以使用相同的试剂。10.4.3.1如果没有两名人员，则一人对失败批次的两个pbmc小管进行测试，独立地对每个小管进行测试。10.4.4重复第7.4节“实验方案”，重新评估该有问题的批次。10.4.5除了该有问题的批次外，每个进行应急测试的人员还测试对照批次。10.4.5.1如果两名人员进行应急测试，则两名人员均独立测试对照批次。10.4.5.2如果只有一人可以进行应急测试，则对照批次不必一式两份。10.4.5.3为了合格，经过应急测试的pbmc批次的对照批次和有问题的批次的两个重复都应达到10.2节的接受标准。10.4.5.4符合此标准后，将该批次按照第10.2节的规定释放，用于cmo。实施例15：cellometerk2imagecytometer自动细胞计数器本实施例描述了cellometerk2imagecytometer自动细胞计数器的操作程序。1.定义μl：微升aopi：吖啶橙丙锭碘bsc：生物安全柜dpbs：dulbecco的磷酸盐缓冲盐水ml：毫升mnc：单核血细胞na：不适用pbmc：外周血单核细胞ppe：个人防护装备pre-rep：培养物的快速扩增方案之前的初始til培养rep：快速扩增方案til：肿瘤浸润淋巴细胞7.程序7.1制备细胞悬液7.1.1制备台盼蓝台盼蓝终浓度为0.1％。制造商建议制备0.2％的储备溶液。7.1.1.1当在cellometerk2上使用台盼蓝时，将储备溶液(0.4％)用pbs稀释至0.2％。7.1.1.2用0.2-0.4微米过滤器过滤台盼蓝，并以小体积等分到标记的加盖管中。7.1.1.3将细胞悬液与0.2％台盼蓝以1：1混合。7.1.2制备aopi7.1.2.1当在cellometerk2上使用aopi时，获得aopi溶液。7.1.2.2用aopi溶液以1：1对细胞样品染色。注：当计数高浓度培养物时，在用台盼蓝或aopi进行最终1：1稀释之前，在细胞培养基中稀释细胞样品。使用制造商建议的计数范围确定使用的最佳稀释度。7.2cellometerk2设置7.2.1开启cellometerk2设备。7.2.2在关联的计算机显示器上选择cellometerimagecytometer图标。7.2.3在软件的主屏上，选择下拉框中列出的其中一个assay(检测)。7.2.3.1当选择适当的assay(检测)时，celltype(细胞类型)和imagemode(图像模式)会自行填充。7.2.3.2在“sample(样品)”部分下，选择setuser/sampleid(设置用户/样品id)以打开另一个屏幕，输入样品的操作员信息。7.2.3.2.1输入“userid(用户id)”。7.2.3.2.2输入“sampleid(样品id)”。样品id来自进入的样品信息。7.2.3.3设置稀释参数。7.2.3.3.1当除了1：1混合物外没有进行其他稀释时，稀释因子为2。7.2.3.3.2当在最终的1：1混合物之前进行稀释时，稀释因子是先前稀释的2倍。7.2.3.3.3根据屏幕的稀释部分中使用的混合物，更新稀释因子。选择铅笔图标以显示对话框屏幕。7.2.3.3.4验证了flimage(fl图像)和f2image(f2图像)部分彼此相同。7.2.3.3.5设置完成后选择“save(保存)”按钮。7.3细胞计数7.3.1除去cellometer计数室载玻片(sd100)两侧的塑料背衬，将其置于干净的无绒擦拭物上。7.3.2制备细胞悬液后，取出一小部分样品并转移至多孔细胞培养板的孔或管中。7.3.3当稀释样品时，使用细胞培养基进行稀释。7.3.4将20μl细胞悬液加入多孔细胞培养板的孔或管中。7.3.5将20μl0.2％台盼蓝或aopi溶液加入到20μl细胞悬液中，并充分混合样品。7.3.6测量20μl的1：1溶液并将其转移至计数室的一侧。注：避免触摸载玻片的清晰区域。7.3.7视需要，在载玻片的另一侧重复样品。7.3.8.将腔室插入cellometer前面的槽中。7.3.8对于aopi细胞计数，在主屏幕上选择“previewfl(预览f1)”以预览绿色荧光图像(活细胞)图像。对于台盼蓝计数，选择“previewbrightfield(预览明场)”。7.3.9聚焦轮用于使图像达到最佳聚焦。细胞具有明亮的中心和清晰的边缘。7.3.10选择“count(计数)”开始计数过程。7.3.11结果显示在计算机屏幕上的计数结果弹出框中，显示计数过程的结果。实施例16：il-2储备溶液(cellgenix)的制备本实施例描述了将纯化冻干的重组人白细胞介素2溶解于适用于进一步组织培养方案的储备样品中的过程，包括本申请和实施例中描述的所有那些，包括涉及使用rhil-2的那些。3.定义/缩写μl：微升bsc：生物安全柜bsl2：生物安全等级2d-pbs：dulbecco的磷酸盐缓冲盐水g：容量说明(gauge)gmp：生产质量管理规范hac：乙酸hsa：人血清白蛋白ml：毫升na：不适用ppe：个人防护装备rhil-2；il-2：重组人白细胞介素-2coa：分析证书6.程序6.1制备0.2％乙酸溶液(hac)。6.1.1将29ml无菌水加至50ml锥形管中。6.1.2将1ml1n乙酸加至50ml锥形管中。6.1.3通过倒置管使其混合2-3次。6.1.4使用steriflip过滤器通过过滤来灭菌hac溶液。6.1.5将溶液加盖、标注日期并标记“无菌0.2％乙酸溶液”。6.1.6溶液2个月后过期。在室温下储存。6.2制备pbs中的1％hsa。6.2.1在150ml无菌过滤装置中，向96mlpbs中加入4ml25％hsa储备溶液。6.2.2过滤溶液。6.2.3加盖、标注日期并标记溶液为“pbs中1％hsa”。6.2.4溶液2个月后过期。4℃储存。6.3记录制备的每瓶rhil-2。6.4制备rhil-2储备溶液(6×106iu/ml终浓度)6.4.1每批rh1l-2不同，并且要求在制造商的分析证书(coa)中找到信息，例如：6.4.1.1每瓶rhil-2的质量(mg)6.4.1.2rhil-2的比活(iu/mg)6.4.1.3推荐的0.2％hac重溶(reconstitution)体积(ml)6.4.2使用下文的等式计算rhil-2批次所需的1％hsa的体积：6.4.2.1例如，根据cellgenix的rhil-2批次10200121coa，1mg小管的比活为25×106lu/mg。它建议在2ml0.2％hac中重溶rhil-2。6.4.3用酒精擦拭il-2小管的橡胶塞。6.4.4使用连接在3ml注射器上的16g针，将推荐体积的0.2％hac注入小管中。当撤回针时，注意不要移动塞子。6.4.5倒置小管3次并旋转直至所有粉末溶解。6.4.6小心地取下塞子，并放在旁边的酒精擦拭物上。6.4.7向小管中添加计算体积的1％hsa。6.4.8用橡皮塞盖住小管。6.5rhil-2溶液的储存6.5.1对于短期储存(<72小时)，将小管储存在4℃。6.5.2对于长期储存(>72小时)，将小管等分成较小的体积并储存在-20℃的冷冻瓶中直至准备使用。避免反复冻结/解冻。制备日期后6个月过期。6.5.3rh-il-2标签包括供应商和目录号、批次#、有效期、操作员姓名、浓度和等分试样的体积。实施例17：制备用于pre-rep和rep过程的培养基此实施例描述了制备用于方案的组织培养基的方法，所述方案涉及来自各种肿瘤类型的肿瘤浸润淋巴细胞(til)的培养，肿瘤类型包括但不限于转移性黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌(hnscc)、卵巢癌、三阴性乳腺癌和肺腺癌。该培养基可用于制备本申请和实施例中描述的任何til。3.定义μg：微克μm：微米μm：微摩尔无血清组织培养基(thermofisherscientific)bsc：生物安全柜cm1：完全培养基#1cm2：完全培养基#2cm3：完全培养基#3cm4：完全培养基#4iu或者u：国际单位ml：毫升mm：毫摩尔na：不适用ppe：个人防护用品pre-rep：预-快速扩增过程rep：快速扩增过程rhil-2、il-2：重组人白细胞介素-2rpmi1640：roswellparkmemorialinstitute培养基，配方1640sop：标准操作程序til：肿瘤浸润淋巴细胞7.程序7.1所有程序均在bsc(ii类，a2类)中使用无菌技术完成。7.1.1使用前，在罩子表面喷洒70％乙醇。7.1.2所有物品和试剂在放入组织培养罩前均喷洒70％乙醇。7.2等分200mml-谷氨酰胺7.2.1提供的l-谷氨酰胺的体积大于制备血清所需的体积(例如，100ml或500ml体积)。7.2.2在37℃水浴中解冻l-谷氨酰胺的瓶。7.2.3解冻后混合l-谷氨酰胺，因为l-谷氨酰胺解冻后会沉淀。确保在等分试样之前所有沉淀物都已回到溶液。7.2.4将5-10ml等分的l-谷氨酰胺置于无菌的15ml锥形管中。7.2.5在管上标记浓度、供应商、批次#、等分日期和有效期。7.2.6将管储存在-20℃并视需要拿出以进行培养基制备。7.3cm1的制备7.3.1从冷藏库中取出以下试剂，在37℃水浴中加热：7.3.1.1rpmi16407.3.1.2人ab血清7.3.1.3200mml-谷氨酰胺7.3.2将bme从4℃储存器中取出并置于组织培养罩中。7.3.3将庆大霉素储备溶液从室温储存放入组织培养罩中。7.3.4根据下表11，将每种成分以适合过滤的体积加入0.2μm过滤器单元的顶部，制备cm1培养基。表23：cm1的制备成分终浓度终体积500ml终体积ilrpmi1640na450ml900m1人ab血清，热灭活10％50ml100ml200mml-谷氨酰胺2mm5ml10m155mmbme55μm0.5ml1ml50mg/ml硫酸庆大霉素50μg/ml0.5ml1ml7.3.5标记cm1培养基瓶的名称、制备者的首字母、过滤/制备日期、两周的有效期，储存在4℃直至组织培养所需。视需要将培养基等分到小体积瓶中。7.3.6将任何剩余的rpmi1640、人ab血清或l-谷氨酰胺储存在4℃直至下一次制备培养基。7.3.7将bme储备瓶放回4℃储存。7.3.8将庆大霉素储备瓶放回适当的rt储存位置。7.3.9由于培养基的缓冲能力有限，制备后不超过两周内或者当酚红ph值指示剂显示出极端ph变化(亮红色到粉红色)时，丢弃cm1。7.3.10在使用当天，将所需量的cm1在37℃水浴中加热，并加入6000iu/m1il-2。7.3.11另外补充-视需要7.3.11.1cm1补充有7.3.11.1.1通过用2mmg1utamaxtm替代2mm谷氨酰胺(终浓度，参见表2)制备cm1。完成后，如上述步骤7.3.5，将培养基瓶标记添加“2mmg1utamax”以防止与cm1的标准制剂混淆。7.3.11.2用额外抗生素/抗真菌剂补充cm17.3.11.2.1一些cm1制剂需要另外的抗生素或抗真菌剂以防止由某些肿瘤类型生长的pre-reptil的污染。7.3.11.2.2添加抗生素/抗真菌剂至如下表12中所示的终浓度。7.3.11.2.3完成后，如上述步骤7.3.1，将培养基瓶标记添加的另外的抗生素/抗真菌剂的名称，以防止与cm1的标准制剂混淆。表24：cm1的另外的补充(视需要)7.4cm2的制备7.4.1从冰箱中取出制备的cm1或按照上述部分7.3制备新鲜的cm1。7.4.2从冰箱中取出7.4.3将制备的cm1与等体积的在无菌培养基瓶中混合以制备所需量的cm2。7.4.4使用当天，将3000iu/mlil-2加入cm2培养基中。7.4.5使用当天，制备足够量的具有3000iu/mlil-2的cm2。7.4.6标记cm2培养基瓶的名称、制备者的首字母、过滤/制备的日期、两周的有效期，并储存在4℃直至组织培养所需。视需要将培养基等分到小体积瓶中。7.4.7将任何没有il-2的cm2送回冰箱，将其在冰箱中储存至多两周，或直至酚红ph值指示剂显示ph值发生极端变化(亮红色到粉红色)。7.5cm3的制备7.5.1在需要使用的当天制备好cm3。7.5.2cm3与培养基相同，使用当天补充3000iu/mlil-2。7.5.3通过将il-2储备溶液直接添加到aim-v的瓶子或袋子中，制备足够满足实验需要的cm3量。轻轻摇晃混合均匀。加至aim-v后立即将瓶子标记“3000iu/mlil-2”。当有过量cm3时，将其在瓶中储存在4℃，标记培养基名称、制备者的首字母、培养基的制备日期及其有效期(制备后7天)。7.5.4在4℃下储存7天后，丢弃补充有il-2的培养基。7.6cm4的制备7.6.1cm4与cm3相同，另外补充2mmglutamaxtm(终浓度)。7.6.1.1对于每1lcm3，加入10ml的200mmglutamaxtm。7.6.2通过将il-2储备溶液和glutamaxtm储备溶液直接添加到aim-v的瓶子或袋子中，制备足够满足实验需要的cm4量。轻轻摇晃混合均匀。7.6.3加入aim-v后立即将瓶子标记“3000il/mlil-2和glutamax”。7.6.4当有过量cm4时，将其在瓶中储存在4℃，标记培养基名称、“glutamax”、制备者的首字母、培养基的制备日期及其有效期(制备后7天)。7.6.5在4℃下储存7天后，丢弃补充有il-2的培养基。实施例18：post-reptil的表面抗原染色1.目的本实施例描述了通过流式细胞术对post-reptil进行细胞表面染色的程序。该程序可以应用于本申请和实施例中描述的任何til。关键术语和定义α：alphaβ：betaμl：微升apc：别藻蓝蛋白(allophycocyanin)ax647：alexfluor647bd：bectondickinson公司bsa：牛血清白蛋白bsc：生物安全柜bv421：brilliantviolet421cd：分化簇cst：血细胞计数器设置和跟踪cy：花青素(cyanine)dpbs：dulbecco的磷酸盐缓冲盐水facs：荧光活化细胞分选仪bsa：胎牛血清fitc：异硫氰酸荧光素fmo：荧光减一(fluorescenceminusone)g：克h7：cy7的类似物ml：毫升pe：藻红蛋白percp-cy5.5：芹黄素叶绿素蛋白ppe：个人防护装备rep：快速扩增方案sit：样品输注管tcr：t细胞受体w/v：重量/体积流式细胞术抗体和染色表25：活/死aqua染色thermofisher目录号#l349667.程序7.1试剂准备7.1.1facs洗涤缓冲液7.1.1.1向dpbs中添加2％(w/v)热灭活的fbs(添加10mlfbs至490ml1xdpbs)。7.1.1.2添加0.1％(w/v)nan3(76.9μl加到500ml瓶)7.1.1.3溶液储存在40℃。30天后丢弃。7.1.2aqua染料7.1.2.1向活性染料(reactivedye)小管中加入50μldmso。7.1.2.2充分混合，目测确认所有染料均已溶解。7.1.2.3将未用于该程序的染料等分，在20℃冷冻直至下次使用。不进行第二次冻结/解冻。7.1.3抗体混合物制备。7.1.3.1混合物在聚丙烯管(例如微量离心管)中制成。7.1.3.2混合物最多可保存6个月。表26：差异(differentiation)面板1(df1)表27：差异面板2(df2)靶标形式克隆供应商目录号滴度cd45ra*pe-cy7hi100bdbiosciences5606751ccd3percp/cy5.5sp34-2bdbiosciences5528522cccr7*pe150503bdbiosciences5607655ccd8fitchit8biolegend3009062ccd4apc/cy7okt4biolegend3174182ccd38*apchb-7biolegend3566061hhla-drpbl243biolegend3076332facs缓冲液35表28：t细胞活化面板l(tactl)靶标形式克隆供应商目录号滴度cd137*pe/cy74b4-1biolegend3098182cd3percp/cy5.5sp34-2bdbiosciences5528522lag3*pe3ds223hebioscience12-2239-425cd8fitchit8biolegend3009062cd4apccy7okt4biolegend3174182pd1*apceh12.2h7biolegend3299082tim-3*bv421f38-2e2biolegend3450082facs缓冲液33表29：t细胞活化面板2(tact2)靶标形式克隆供应商目录号滴度cd69*pe-cy7fn50bdbiosciences5577453cd3percp/cy5.5sp34-2bdbiosciences5528522tigit*pembsa43ebioscience12-9500-423cd8fitchit8biolegend3009062cd4apccy7okt4biolegend3174182klrg1*ax647sa231a2biolegend3677041cd154*bv421trap1bdbiosciences5638863facs缓冲液347.2流式细胞术测定要求7.2.1流式细胞仪校准7.2.1.1按照制造商的说明，在检测当天使用cst微珠对流式细胞仪进行校准。7.2.1.2操作员确保流式细胞仪已通过校准，并且性能和基线检查均有效。7.2.2补偿/fmo对照7.2.2.1使用bd补偿微珠和arctm胺反应补偿微珠套件制备单色补偿样品。7.2.2.2fmo对照，用以下单抗体缀合物、cd27、cd28和cd57减的抗体混合物对含有细胞的样品进行染色。7.2.3mfi标准化7.2.3.1每天用微珠对照和目标电压值检测细胞仪电压。7.3样品染色7.3.1给facs管贴上标签：样品id-df1、样品id-df2、样品id-t1、样品id-t2。7.3.2给一组fmo对照贴上标签：cd27-apc-h7、cd28-pe、cd57-percpcy5.5、cd45ra-pecy7、ccr7-pe、cd38-apc、cd137-pe7、lag3-pe、pd1apc、tim3-bv421、cd69-pe7、tigit-pe、klrg1-ax647和cd154-bv421。7.3.3向各个试管中添加0.5至2×106个细胞。7.3.4向各个试管中添加qs至3ml的1×pbs。7.3.5以400×g、高加速度和高制动速度旋转试管5分钟。7.3.6离心样品时，准备标记死细胞的aqua染料。7.3.7从冷冻器中取出aqua等分试样，在pbs中稀释1/200。保持黑暗。将2ul染料添加到198uldpbs中。7.3.8倾析或者吸出步骤7.3.5中的上清液。7.3.9将25ul上述aqua溶液添加到样品和fmo对照中。7.3.10在黑暗中室温(rt)孵育15分钟。7.3.11注：如果最初将细胞储存在不含蛋白质的培养基中，则应添加封闭步骤，例如5ultrustain室温放置10分钟。7.3.12向适当的试管中加入50ul抗体混合物。7.3.13摇动试管架进行搅拌。7.3.14黑暗中室温孵育15分钟。7.3.15记录开始和结束时间。添加3mlfacs洗涤缓冲液。7.3.16以400×g、高加速度和高制动旋转试管5分钟。7.3.17离心旋转完成后，倾析或者吸出上清液。7.3.18通过沿空架子滑动试管来重悬细胞。7.3.19向各个试管中加入100ul的1％多聚甲醛。7.3.20在40℃下黑暗储存，直至准备在流式细胞仪上收集为止。注：样品最多可保存72小时。7.4l/daqua补偿控制。7.4.1将facs管标记为l/daqua补偿对照。7.4.2在试管中加入一滴arc珠。7.4.3将3μll/daqua直接添加到微珠中。7.4.4在黑暗中室温孵育试管10至30分钟。7.4.5在工作表上记录孵育开始和结束时间。7.4.6孵育后，向各个试管中加入3mlfacs洗涤液。7.4.7以400×g、高加速度和高制动旋转试管5分钟。7.4.8倒出或者吸出上清液。7.4.9用500μl的1％pfa溶液重悬试管。加入1滴负珠。置于40℃的黑暗中直至收集。7.5补偿对照染色。7.5.1如post-reptil表型工作表所示，给facs管贴上标签。7.5.2如post-reptil表型工作表所示，添加抗体。7.5.3孵育后，向各个试管中加入3mlfacs缓冲液。7.5.4以500g、高加速度和高制动旋转试管2分钟。倒出或者吸出上清液。7.5.5用500μl的1％pfa的pbs重悬管，在黑暗中于2-80℃储存。7.6获得数据7.6.1打开facsdiva软件并登录。7.6.2在血细胞计数器不匹配对话框中，单击“使用cst设置”。7.6.3通过单击“实验”选项卡并选择“扩增表象”模板，创建一个新实验。7.6.4双击“目标值”实验并调整电压以达到由流式核心操作员(flowcoreoperator)确定的目标值。7.6.5复制仪器设置并将其粘贴到新实验中。7.6.6为各个个体创建一个样品并适当命名。7.6.7根据样品管上的标签为样品创建名称。7.6.8将试管放入sit之前，先用手指轻轻涡旋或者轻弹。7.6.9在“采集”板中的“记录”下采集数据。7.6.10以每秒不到7,500个事件的速度运行样品。7.6.11收集50,000至100,000个活的事件，不包括碎片。实施例19：过程2a验证过程的开发完成本实施例中的实验，以分析从来源于患者的黑色素瘤和单个乳腺癌中制备til的过程2a，包括在pre-rep程序中来自肿瘤的til的生长，然后进行改进rep。特别强调了冷冻til产物的建立以及冷冻til产物与当前新鲜til产物方法(过程1c)的性能比较。该报告将证明，无论相同的til产物是新鲜的还是冷冻的，在评估新鲜和解冻的关键品质特性(细胞数量、活力％、cd3+t细胞％，以及磁珠刺激的γ干扰素(ifn-y)产生)以及重新刺激扩增的表型程序(rerep)时，观察到相似的特征。为支持该结论而提供的数据包括增殖、活力、表型、ifn-γ释放、效价强度、端粒长度和代谢活性。结果表征了过程2a(缩短的pre-rep/rep过程，接着进行til的冷冻保存)，并且将2a过程与更长的1c过程进行了比较，如此处所述。肿瘤供体的描述、处理日期和处理位置可在下表1中找到(*指示rep使用冷冻的pre-reptil品系启动)：表30：肿瘤供体的描述、处理日期和处理位置3.背景信息3.1ln-144是用于治疗转移性黑色素瘤患者的免疫治疗产品。该产品由在手术切除肿瘤后从单个患者获得并离体扩增(通过粉碎肿瘤碎片的细胞培养(pre-rep)，然后在高剂量的il-2、抗cd3和共刺激apc存在的情况下进行til快速扩增)的自体肿瘤浸润t淋巴细胞(til)组成。在非清髓性淋巴细胞耗竭性预处理之后，患者每8小时接受一次til输注和随后的阿地白介素(il-2)静脉输注，最多6剂。涉及在肿瘤微环境(tne)中损伤相关分子模式分子(damp)环境的til扩增的替代方法的研究也证明了可有效用于治疗(donia2014年；sommerville，2012年)。已用于商业化生产til的过程1c涉及的生产计划可能需要约45-55天才能生产出可输注的til产品(其在24小时内被递送至免疫耗竭的患者)。接受者患者的免疫耗竭必须与当前til产物的收获时间精确同步。新鲜产物的收获延迟或者递送延迟可对等待输注的免疫耗竭患者产生负面影响。由于减少了pre-rep和rep程序的时间、缩短了生产周期并且减少了材料，从而使过程2a在过程1c上得到了改进。另外，过程2a增加了产品运输时间的灵活性。过程1c和过程2a在pre-rep、rep和收获过程(参见表2)方面的差异包括：3.1.1pre-rep程序中使用了肿瘤碎片容量增加的更大的烧瓶。3.1.2使用封闭系统或者适合将来适应封闭系统的步骤。3.1.3pre-rep和rep程序中天数减少。3.1.4直接进行rep的方法，免去了在选择特定pre-reptil群进行rep之前对pre-rep群进行表型分析的需要。3.1.5与预先设定数量的经辐照的同种异体pbmcapc和抗cd3(克隆okt3)一起进行的共培养适于til的充分扩增。3.1.6用于收获的自动细胞洗涤系统。3.1.7在运输前，冷冻保存基于cs10的最终制剂。表31：过程2a对过程1c的影响4.缩写μl：微克μl：微升μm：微米apc：抗原呈递细胞cd：分化簇cm：中枢记忆cm1、cm2：培养基1、培养基2co2：二氧化碳cs10：cs10冷冻保存培养基(biolifesolutions)ct：pcr循环阈值damp：损伤相关分子模式分子dct：参考ct值与测试ct值之间的差异ddct：dct与10ng标准ct值之间的差异ecar：细胞外酸化率(糖酵解法)em：效应记忆er+/pr+：雌激素受体+/孕激素受体+gmp：生产质量管理规范hbss：hanks平衡盐溶液hsa：人血清白蛋白ifn-γ：干扰素γil：白介素iu：国际单位ln2：液氮ml：毫升mm：毫米nd：未确定ng：纳克℃：摄氏度ocr：耗氧率(氧化磷酸化的量度)okt3：抗cd3单克隆抗体的克隆名称pbmc：外周血单核细胞pd：工艺开发rep：快速扩增方案rh：重组人sop：标准操作程序t/s：端粒重复拷贝数与单基因拷贝数的比率til：肿瘤浸润淋巴细胞vdj：t细胞受体的可变区、d基因片段和j基因片段vα、vβ：主要肿瘤浸润淋巴细胞中的成熟t细胞受体可变区片段μl：微克μl：微升μm：微米apc：抗原呈递细胞cd：分化簇cm：中枢记忆cm1、cm2：培养基1、培养基2co2：二氧化碳cs10：cs10冷冻保存培养基(biolifesolutions)ct：pcr循环阈值damp：损伤相关分子模式分子dct：参考ct值与测试ct值之间的差异ddct：dct与10ng标准ct值之间的差异ecar：细胞外酸化率(糖酵解法)em：效应记忆er+/pr+：雌激素受体+/孕激素受体+gmp：生产质量管理规范hbss：hanks平衡盐溶液hsa：人血清白蛋白ifn-γ：干扰素γil：白介素iu：国际单位ln2：液氮ml：毫升mm：毫米nd：未确定ng：纳克℃：摄氏度ocr：耗氧率(氧化磷酸化的量度)okt3：抗cd3单克隆抗体的克隆名称pbmc：外周血单核细胞pd：工艺开发rep：快速扩增方案rh：重组人sop：标准操作程序t/s：端粒重复拷贝数与单基因拷贝数的比率til：肿瘤浸润淋巴细胞vdj：t细胞受体的可变区、d基因片段和j基因片段vα、vβ：主要肿瘤浸润淋巴细胞中的成熟t细胞受体可变区片段5.实验设计5.1过程2a5.1.1pre-rep：收到后，将肿瘤转移至生物安全柜(ii类，a2型)中。使用无菌技术，将肿瘤从运输容器中取出，在含有50μg/ml庆大霉素的hbss中洗涤。技术人员将肿瘤粉碎成40个3×3×3mm的碎片，然后将其转移至装有补充有6000iu/mlrhil-2的cm1培养基的预热g-rex-100m烧瓶中。将烧瓶置于37℃、5％co2湿润的组织培养箱中11天。如果肿瘤产生超过40个碎片，则可能会建立超过一个的g-rex-100m。然后收集细胞，准备用于rep。5.1.2rep：在第11天，准备一个装有5lcm2的g-rex-500m烧瓶，该cm2补充有3000iu/mlrhil-2、30ng/ml抗cd3(克隆okt3)和5×109经辐照的同种异体饲养细胞pbmc细胞。使体积减小后，对从pre-repg-rex-100m烧瓶中获得的til进行计数，并以5×106至200×106个细胞的密度接种到g-rex-500m烧瓶中。然后将烧瓶置于37℃、5％co2的湿润组织培养箱中5天。在第16天，减少g-rex-500m烧瓶的体积，计数til并确定其活力。此时，将til扩增到多个g-rex-500m烧瓶(最多六个烧瓶)，各个烧瓶的接种密度为1×109til/烧瓶。然后将所有烧瓶置于37℃、5％co2的湿润组织培养箱中另外6天。在第22天(收获之日)，将各个烧瓶的体积减少90％，将细胞合并在一起，通过170μm的血液过滤器过滤，然后收集到3loriginev3000袋或者等同物中，准备使用lovo进行自动洗涤。5.1.3收获和最终制剂：使用lovo自动化细胞处理系统洗涤til，该系统用由补充1％hsa的9％plasmalyte-a组成的洗涤缓冲液替换99.99％的细胞培养基。lovo使用旋转过滤膜技术进行操作，可回收超过92％的til同时实际上消除了残留的组织培养成分，包括血清、生长因子和细胞因子，以及其他碎片和颗粒。洗涤完成后，进行细胞计数以确定til扩增及其收获后的活力。以1：1(体积：体积)比率将cs10加到洗涤后的til，以得到过程2a的最终制剂。将最终配制的产物等分到冻存袋中，密封并放入预冷的铝制盒中。然后，根据soplab-018rev000“程序降温仪的操作”，使用cryomed程序降温仪(thermofisherscientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆)冷冻装有til的冻存袋。5.2til样品：收集了四种条件的til群用于特征比较。5.2.1新鲜收获的til(直接来自含1％hsa洗涤缓冲液的plasmalyte-a)，解冻的til(直接来自解冻的终产物袋)。5.2.2新鲜的扩增表型rereptil(新鲜收获的til，其用il-2、pbmc饲养细胞和抗cd3克隆okt3培养7天至14天)。5.2.3解冻的扩增表型til(解冻的til，其用il-2、pbmc饲养细胞和抗cd3克隆okt3培养7天至14天)。5.3检测概述(参见图2)5.3.1pre-rep检测包括整个pre-rep期间的il-2质量评估和细胞培养物代谢物分析，例如葡萄糖、乳酸、l-谷氨酰胺和氨。5.3.1.1il-2定量：从pre-rep培养中定期取出培养基，通过elisa检测il-2量化。参考r&dsystemshumanil-2quantikineelisa试剂盒制造商的说明。5.3.1.2细胞培养物代谢物分析：从pre-rep培养物中定期取出培养基，检测以下代谢物：葡萄糖、乳酸、l-谷氨酰胺和氨。参考《rochecedex生物分析仪用户手册》的说明。5.3.2rep检测包括扩展的检测，例如细胞计数、活力％、细胞表面分子的流式细胞术分析、效价强度(ifn-γ产生)、生物发光重定向裂解检测、颗粒酶b产生、细胞代谢和端粒长度测量。5.3.2.1细胞计数和活力：根据soplab-003rev000cellometerk2imagecytometer自动细胞计数器，使用cellometerk2自动细胞计数器(nexcelombioscience，lawrence，ma)对til样品进行计数，确定活力。5.3.2.2细胞表面生物标志物的流式细胞术分析：使用postreptil的wrklab-041rev000表面抗原染色中所概述的程序，等分til样品，进行细胞表面标志物的流式细胞术分析。5.3.2.3效价测定(ifn-γ产生)：通过确定用cd3、cd28和cd137/4-1bb抗体刺激的til培养基中细胞因子ifn-γ的水平，来进行另一种测定：检测细胞毒性潜力。使用wrklab-016rev000刺激til以检测ifn-γ释放，来确定这些刺激的til培养基中的ifn-γ水平。5.3.2.4生物发光重定向裂解检测：根据til的wrklab-040生物发光重定向裂解测定(效价测定)中概述的sop，使用til与生物发光细胞系p815(克隆g6)的共培养检测评估til裂解靶细胞的细胞毒性潜力。5.3.2.5颗粒酶b产生：颗粒酶b是til杀死靶细胞能力的另一项指标。按照制造商的说明，使用人粒酶bduosetelisa试剂盒(r&dsystems，明尼阿波利斯，明尼苏达州)，也对按5.2.5.3再刺激的培养基上清液中的颗粒酶b水平进行评估。5.3.2.6细胞(呼吸)代谢：用线粒体呼吸和糖酵解的抑制剂处理细胞，以测定til的代谢状况，包括以下检测：基础氧化磷酸化(通过ocr测量)、备用呼吸能力、基础糖酵解活性(通过ecar测量)和糖酵解储备。使用wrklab-029seahorse线粒体/糖酵解综合压力测试试验中概述的程序进行代谢谱分析。。5.3.2.7端粒长度检测：已经使用多种方法来测量基因组dna和细胞制剂中端粒的长度。端粒限制性片段(trf)分析是测量端粒长度的黄金标准(delange等，1990年)。但是，trf的主要局限性是需要大量dna(1.5ag)。两种广泛使用的端粒长度测量技术，即荧光原位杂交(fish；agilenttechnologies，santaclara，ca)和定量pcr。5.3.3为以下测试抽取了另外的样品，以后可以视需要进行分析：5.3.3.1深入(in-depth)细胞因子分析5.3.3.2tcr测序6.达到的结果使用源自第2.3节中所述肿瘤的til、第5.1节中的实验设计和收获条件进行了总共9个实验。对使用过程2a获得的til进行了第5.3.2节概述的测试，目的是了解其扩增能力、活力、表型、细胞毒性潜力和代谢状况。对新鲜收获的til产物和解冻的冷冻til产物进行了所有测量(过程2a)。6.1细胞计数和活力6.1.1在pre-rep结束时、在rep的第5天或者第6天(扩增日)、在rep结束时、在lovo洗涤之前、在lovo洗涤之后，都进行了细胞计数。然后将细胞计数用于确定rep期间til的扩增以及用lovo洗涤后til的回收率。解冻后，再次计数细胞以确定解冻后的回收率(基于冷冻的til的浓度)和解冻后的活力，然后再进行其他分析检测。表32总结了9个过程2a运行的所有这些结果。表32：来自过程2a运行的细胞计数、活力％和til扩增6.1.2过程2asop将rep的til起始数量定义为5200×106til。用于启动过程2arep的9个til样品的范围为4.1×106(m1065t)-1.8×108(m1064t)，平均起始til数量为6.58×107。值得注意的是，在rep收获时，涂有最少til的rep扩增程度最大(所有9个rep的扩增范围：130-1900倍；平均扩增840倍)。在这9个过程2arep结束时获得的til的平均数量为4.49×1010(范围为7.8×109-6.7×1010)。6.1.3有关过程1c的比较统计信息，参见“chemistry,manufacturing,andcontrols(cmc)sectionofinvestigationalnewdrug(ind)applicationforln144/ln-145”。6.1.4过程1c使用人工处理和离心来洗涤til产物。这是耗时的，但是更重要的是，在收获和最终制剂之间可能导致多达25％的产物损失。自动细胞洗涤lovo系统提供了减少细胞损失的方法，并且引入了封闭的系统洗涤，从而降低了洗涤步骤中产物污染的风险。在方案的lovo洗涤步骤后回收产物，显示进入洗涤步骤的til产物平均回收率为93.8±10.4％。此统计信息包括m1062t的til产物，其lovo回收率为68％，在此期间，操作员在lovo操作中的错误导致需要离心样品，然后重新启动lovo程序(参见第7节，偏差和差异)。这代表了对rep收获日进行的过程1c洗涤步骤的高度有利改进。6.1.5解冻后til的回收率也是冷冻til产物的主要问题。通过测量解冻后从袋中回收的细胞数与冷冻保存之前放入各个冻存袋中的细胞数相比，确定产物的回收率。解冻的回收率范围为78-103％，平均回收率为88.2±8.6％。6.1.6尽管在解冻之前或者之后样品的活力存在显著差异，但是平均而言，解冻后活力损失仅为2％。冷冻保存的til的活力为84.3±4.7％，解冻后相同的til的活力为82.1±4.4％(p＝0.0742，配对学生“t”检验，非参数)。新鲜的临床til过程1c产物的出货标准要求至少70％的活力。尽管解冻后活力有少量损失，过程2a的所有9次运行都符合冻存产物解冻后的出货标准。表4和图3显示了进入冷冻保存的til的活力(新鲜+cs10)和解冻后til的活力。表33：新鲜产物和解冻产物的活力比较6.2til的re-rep扩增。除了检查新鲜产物在rep中的扩增能力外，还评估了新鲜til产物和解冻til产物在用新鲜经辐照的同种异体pbmc饲养细胞apc和新鲜抗cd3再刺激后的扩增能力。7天后，分析这些再刺激的til产物在初始培养条件下扩增的能力。图4和表5显示了培养7天后re-reptil细胞的平均扩增。使用配对学生t检验的数据分析表明，无论是用新鲜的til还是解冻的til产物开始rep，til在re-rep中的扩增能力都无显著差异(p＝0.81)。表34：re-rep培养中新鲜til和解冻til扩增的比较6.3细胞培养代谢物。lion2a的主要前提之一是更少的技术时间和过程转移将导致节省成本并限制变化性。可能的不利后果是不良代谢物增加和营养来源减少。如图5所示，电解质(钠和钾)、营养素(谷氨酰胺和葡萄糖)和代谢物(乳酸和氨)的血液正常值提供了评估pre-rep第11天的结果时要考虑的范围。如图6所示，依次评估了三个til(m1061t，m1062t和m1064t)。在此种情况下，钾和钠保持在正常水平，葡萄糖>1.0g/l，谷氨酰胺>0.3mmol/l，远高于正常血液的较低值。正如预期的，乳酸上升至高达0.8g/l，约为正常血液的5倍，并且如在快速扩增的细胞中所预期的，氨水平上升至高达3mmol/l，也大幅高于血液中的正常水平。6.4il-2定量。6.4.1除了补充葡萄糖、谷氨酰胺和充足的氧合作用外，pre-rep中til增殖的主要驱动因素是提供高水平的rhil-2。在将其添加到含血清的培养基中之后，il-2水平的测量值为2-3.5×103iu/ml，在培养的11天中仅降至约1.0×103iu/ml。这远高于维持t细胞增殖所必需的30-100iu/ml。目前正在lionbiotechnologies，tampa的单独实验(qp-17-010：来自cellgenix，akron和prometheus的il-2鉴定)中，使用不同来源的il-2(prometheus，akron，cellgenix)评估il-2浓度。6.5ifn-γ产生。6.5.1如第5.3.5.3节所述，用磁性抗cd3、cd28和4-1bb免疫磁珠刺激til24小时后，收集培养上清液，使用elisa试剂盒分析ifn-γ。所有再刺激的til比未刺激的til产生更多的ifn-γ对应物，表明til的刺激导致其活化。图8显示了测试的四种不同til组合物(新鲜til、解冻til、新鲜的re-reptil和解冻的re-reptil)经再刺激后将ifn-γ释放到周围培养基中的能力。表6和7显示了9个过程2a运行中ifn-γ分泌的平均值。新鲜的til产物与解冻的、冷冻保存的til再刺激后的ifn-γ分泌没有区别。表6显示，新鲜产物平均产生4143±2285pgifn-γ/106til，而解冻产物平均产生3910±1487pgifn-γ/106til(使用配对学生t检验，p＝0.55)。如果对总til产物进行归一化(表7)，平均而言，经刺激的新鲜til产生86±61克ifn-γ，而经刺激的解冻til产生68±40克ifn-γ(p＝0.13)。这些发现表明，新鲜til产物和解冻til产物均产生ifn-γ，并且在用抗cd3/抗cd28/抗4-1bb刺激后，新鲜或者解冻的相同til产生ifn-γ的能力没有差异。表35：新鲜til和解冻til中的ifn-γ分泌(表示为pg/106细胞/24小时)表36：新鲜til和解冻til中的ifn-γ分泌。所有值均在1012(表示为克/106个细胞/24小时)6.6颗粒酶b产生6.6.1如5.2.5.3中所述，用磁性抗cd3、cd28和4-ibb免疫磁珠刺激til24小时，在24小时后收集来自培养物的上清液，通过elisa分析颗粒酶b水平。所有再刺激的til产生的颗粒酶b均比未刺激的对应物多，这表明til的刺激导致其活化。图9显示了在用细胞因子混合物再刺激后，新鲜的til、新鲜的re-reptil和解冻的re-reptil释放颗粒酶b到周围培养基中的能力。所有产物均显示出9190pg/106个活细胞至262000pg/106个活细胞的颗粒酶b产生(表8)。表6显示，新鲜产物平均产生60644+42959，而新鲜和解冻的re-rep分别产生93600+67558和103878+84515。新鲜re-rep和解冻的re-rep之间的比较表明，从任何一种条件获得的til的能力没有差异(p＝0.7)。由于未检测解冻产物中的颗粒酶b，因此未使用新鲜的til产物进行统计分析。表37：新鲜til、新鲜rereptil和解冻rereptil中的颗粒酶b分泌(表示为pg/106个细胞/24小时)6.7细胞表面生物标志物的流式细胞术分析til的表型分析：lion已标准化了4个抗体面板，以广泛表征t细胞的功能。这些面板用于评估新鲜til、解冻til、新鲜的re-reptil和解冻的re-reptil的免疫表型。本节中用于图形表示的所有数据也以附录10中的表格格式(表14-24)提供。6.8生物发光重定向裂解检测6.8.1如第5.3.2.4节所述，为了确定过程2atil杀死其靶肿瘤细胞的潜在能力，我们开发了一种效力测定方法，涉及将til与生物发光替代靶细胞系p815共培养。在存在抗cd3刺激的情况下，将不同的til组合物与p815共培养4小时，可以测量til细胞的细胞毒性潜能，表示为lu50，裂解单位可以定义为杀死50％的靶细胞所需的til数量。然后将该量度表示为lu50/106til。下文的图32显示了新鲜产物和两种re-reptil条件(新鲜re-rep和解冻re-rep)中til的细胞毒性潜力。6.8.2将新鲜的re-rep与解冻的re-rep进行比较，结果表明，两个til群杀死靶细胞的能力之间无显著差异(p＝0.3126)。该数据支持以下结论：就til产物的细胞毒性潜力而言，新鲜产物与解冻产物之间没有差异。新鲜的之间没有进行比较，因为细胞毒性潜力不是在解冻til后立即测量的。表9显示杀死50％的p815靶细胞系所需的til的裂解单位。表38：til针对p815靶细胞系产生的裂解单位新鲜新鲜rerep解冻rerepm1061t21.742.3342m1062t5.917.020.9m1063t14.216112.5m1064122.28.74.4m1065142.6411128_8ep11001t1.84.3147m1056t25.016.618.2m10513t76.913.816.6m1023t30.825.630.4平均±sd26.8±22.520.6±13.331.1±37.66.9til的细胞代谢特征6.9.1遵循第5.3.2.6节中概述的方案，为评估post-reptil的代谢健康状况，我们利用了agilenttechnologies(santaclara，ca)的seahorse代谢分析仪(xfp和xfe96)。简言之，通过用针对氧化磷酸化或者糖酵解某些方面的抑制剂处理细胞，使细胞处于压力状态，从而能够测定细胞的src和糖酵解储备。另外，可以测定氧化磷酸化(基础ocr)和糖酵解(基础ecar)的基础水平。最后，由于氧化磷酸化抑制剂和糖酵解抑制剂在同一试验中结合使用，因此可以识别出src的潜在隐藏储备，只有当用糖酵解的竞争性抑制剂2-脱氧葡萄糖(2-dg)(标记为src2dg)处理细胞(导致src增大)时，src的潜在隐藏储备才明显，否则将保持隐藏状态。此种额外呼吸能力已被标记为“隐性(covert)”src。表9显示了新鲜收获的til、新鲜的re-reptil和解冻的re-reptil的代谢特征，这些代谢特征来自对细胞进行的代谢压力测试。6.9.2图55a-f以图形形式显示了来自表38的数据。新鲜收获的rep产物与新鲜的re-rep产物和解冻的re-rep产物显示出一些统计差异。这并不意外，因为在rep之后或者解冻后，re-rep产物已用新鲜的pbmcapc和新鲜的抗cd3抗体再刺激。但是，在所有情况下，当新鲜和解冻的产物都通过re-rep程序再刺激时，两者之间无显著差异(参见表9的p值)。这表明冷冻保存过程不会不利地影响til产物。最值得注意的是，对于氧化磷酸化，re-rep产物的src高于与其匹配的新鲜收获的rep产物。对于糖酵解，与新鲜rep产物相比，re-reptil的糖酵解基础水平在统计学上显著更高，并且糖酵解储备水平在统计上则较低。值得注意的是，这可能表明re-reptil比新鲜收获的til活化程度更高，因为据报道活化的健康til具有高水平的糖酵解活性(buck等，jem212：1345-1360；2015年)。表39：过程2atil的代谢特征6.9.3使用re-rep程序将新鲜产物和冷冻产物进行直接比较，使我们能够确定，在相同的刺激条件下，新鲜和冷冻的til产物均会产生统计学上区别不明显的代谢特征。新鲜的re-rep和解冻的re-reptil的基础呼吸水平(图60a，36.7±10.6和44.8±12.9pmol/分钟；p＝0.11)相似且(显性)src(图60b，41.6±27.2和62.7±30.8；p＝0.12)相似。用2-dg(葡萄糖的竞争性抑制剂)处理这些re-rep细胞后，葡萄糖的竞争性抑制剂会抑制糖酵解，我们发现新鲜和解冻的re-reptil均显示出额外的“隐藏”备用呼吸能力(src2dg；隐性src)，这种隐性src在新鲜收获的til样品中大部分较低或者不存在(图60c)；在新鲜收获的til中，只有一个样品具有高水平的src2dg(图60c)，相反，测试的七个样品中只有一个在re-rep后显示缺乏隐性src。新鲜的re-rep的隐性src(图60d)平均为20.7±20.1，而解冻的re-rep的隐性src(图60d)范围为27.8±16.1；p＝0.52)。6.9.4扩增表型(re-rep)til的最显著的代谢读数是扩增表型(re-rep)样品中始终较高的基础糖酵解水平。re-rep样品中的基础糖酵解(图60e)始终很高，新鲜的re-rep的平均值为118.7±44.2mph/分钟，解冻后的re-rep的平均值为132.0±43.2mph/mm。这些样品在统计上彼此间没有差异(p＝0.38)。然而，如上所述，新鲜收获的样品不具有如此高的基础糖酵解水平。与新鲜的re-reptil相比，此差异是实质性的，但并不显著(p＝0.10)；但是，与解冻的re-rep样品相比，差异是显著的(p0.01)。这些re-rep细胞显然非常依赖于糖酵解来满足其能量需求，因为在seahorse代谢测试中受到压力时它们几乎没有糖酵解储备(图60f)：新鲜的re-reptil平均为12.9±14.9mph/分钟；解冻的re-reptil为3.35±23.8mph/分钟。这些re-rep互相之间没有差异(p＝0.47)，但在统计学上均不同于新鲜收获的til样品中发现的糖酵解储备，后者平均为40.8±17.6mph/分钟(与新鲜的re-reptil和解冻的re-reptil相比，p值分别为0.003和0.01)。应该进行进一步的研究，以确定这些新鲜收获物和re-reptil样品之间在糖酵解方面差异的原因。6.10端粒长度测量6.10.1用flowfish和qpcr测量post-reptil端粒的长度。6.10.1.1使用dako/agilentpathologysolutions(用于流式细胞术的端粒pna试剂盒/fitc)试剂盒进行flow-fish，并按照制造商的说明测量端粒重复序列的平均长度。在每个测定中，将1301t细胞白血病细胞系(sigma-aldrich，st.louis，mo)用作内参标准。计数单个til，并以1：1的细胞比率与1301细胞混合。将2×106个til与2×106个1301细胞混合。在存在和不存在与端粒重复序列互补的fitc偶联端粒pna探针(fitc-00-ccctaa-ccc-taa-)(终浓度为60nm)的情况下，一式两份在杂交溶液(70％甲酰胺，1％bsa，20mmtris，ph7.0)中进行原位杂交。加入端粒pna探针后，将细胞在加热块中于82℃孵育10分钟。然后将细胞在室温下置于黑暗中过夜。第二天早晨，通过在40℃的加热块上用洗涤液洗涤2次，每次10分钟，去除过量的端粒探针。洗涤后，以75ng/ml的终浓度添加dapi(invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚)。用dapi进行的dna染色用于门控g0/g1群中的细胞。使用yeti流式细胞仪(propel-labs，fortcollins，co)进行样品分析。按照以下公式，将检测样品的端粒荧光表示为1301细胞的荧光(f1)的百分比：相对端粒长度＝[(平均fitcfl测试细胞w/探针-平均fitcfl测试细胞w/o探针)×1301细胞的dna指数×100]/[(探针平均fitcfl1301细胞w/探针-平均fitcfl1301细胞w/o探针)×测试细胞的dna指数]。6.10.1.2qpcr：实时qpcr用于测量相对端粒长度。简而言之，使用96孔形式的bio-radpcr热循环仪(bio-radlaboratories，hercules，ca)确定端粒重复拷贝数与单基因拷贝数(t/s)的比率。将10ng的基因组dna用于端粒(tel)或者血红蛋白(hgb)pcr反应，使用的引物如下：tel-lb引物(cggtttgtttgggtttgggtttgggtttgggtttgggtt)、tel-2b引物(ggcttgccttacccttacccttacccttacccttaccct)、hgbl引物(gcttctgacacaactgtgttcactagc)和hgb2引物(caccaacttcatccacgttcacc)。通过端粒和血红蛋白反应对所有样品进行分析，并且一式三份地在同一平板上进行分析。除检测样品外，每个96孔板均使用从1301细胞分离的基因组dna绘制了0.08ng至250ng的五点标准曲线。通过从中值端粒ct值中减去中值血红蛋白阈值循环(ct)值来计算每个样品的t/s比(-dct)。通过从每个未知样品的t/s比中减去10ng标准曲线点的t/s比来确定相对t/s比(-ddct)。6.10.1.3端粒长度结果与讨论：端粒是线性染色体末端的帽(重复核苷酸序列)，其在促进染色体完全复制中起关键作用。端粒测量是研究诸如退行性疾病、癌症和衰老等疾病的一种新兴工具。nih的先前研究(jimmunol.2005,nov15；175(10):7046-52；clincancerres.2011,jul1；17(13):4550–4557)已经表明，更长的til端粒长度与临床反应有关。相反，radvanyi的研究小组发现，应答者和非应答者之间的til端粒长度无显著差异(clincancerres；18(24)；6758–70)。迄今为止，没有证据证明端粒的长度与体外t细胞培养的长度有关。与通过过程1c过程培养的til(25-36天培养)相比，通过过程2a培养的post-reptil(22天培养)有可能具有更长的端粒长度。7.差异和偏差7.1过程偏差7.1.1m1061t：在第6天将rep细胞分到4个g-rex500m烧瓶。7.1.2m1062t：在第6天将rep细胞分到4个g-rex500m烧瓶。由于lovo过滤系统的操作员失误，操作期间发生紧急停止，需要从一次性套件中手动收集til。第二次lovo运行期间成功过滤了til。7.1.3m1063t：无偏差；m1064t：无偏差。7.1.4m1065t：pre-rep细胞在第11天的细胞计数(<5×106个细胞)低于规格书，但继续进入rep。在rep第6天，对细胞进行计数，然后放回g-rex500m中，并加入4.5l新鲜培养基。由于细胞数不足(rep第6天<1×109个细胞)，在这一天没有扩增til。7.1.5ep11001t：无偏差。7.1.6m1056t：pre-rep细胞在lion的g-rex100烧瓶中培养长达21天。在pre-rep第11天滤出肿瘤碎片，收获时将til冷冻在100％cs10中，每1.5ml小管中30×106个细胞。将冷冻的til在补充了6000iu/mlrhil-2的cm1中的moffittpd处解冻，并静置3天，然后开始rep的第0天。在rep第6天，将til扩增到4个烧瓶中，在rep第11天开始收获。7.1.7m1058t：pre-rep细胞在lion的g-rex100烧瓶中培养长达21天。在pre-rep第11天滤出肿瘤碎片，收获时将til冷冻在100％cs10中，每1.5ml小管中30×106个细胞。将冷冻的til在补充了6000iu/mlrhil-2的cm1中的moffittpd处解冻，并静置3天，然后开始rep的第0天。在rep第6天，将细胞分到4个烧瓶，在rep第11天开始收获。7.1.8m1023t：pre-rep细胞在lion的g-rex10烧瓶中培养长达21天。在pre-rep第11天滤出肿瘤碎片，收获时将til冷冻在100％cs10中，每1.5ml小管中30×106个细胞。将冷冻的til在补充了6000iu/mlrhil-2的cm1中的moffittpd处解冻，在开始rep的第0天之前静置3天。在rep第6天，将细胞扩增到4个烧瓶中，然后在rep第11天收获。7.2检测偏差7.2.1未进行深入的细胞因子分析和tcr测序。8.结论和建议8.1开发更稳健(robust)的过程。lion面临的挑战是将具有较长处理时间的早期lion过程1c转换为潜在的可商业化的lion过程2a，该过程利用改进缩短了处理时间并获得冷冻保存的til产物的最终制剂。为此，进行了九次“工艺开发”运行，以确认新方法和旧方法具有相当的细胞产量以及相当的til效价强度和表型。特别值得注意的是，整个过程的复杂性显著降低，从而使pre-rep和rep过程的总长度减少了50％，且与我们合同制造商目前采用的历史悠久的lion过程1c相比，til的产量仍可观(7.8×109-67×109个细胞)。最近2017年6月对asco演示文稿进行了更新(平均值：41.04×109个细胞，范围为1.2-96×109个细胞)。此外，lion成功开发了一种冷冻保存的til产物，该产物在解冻后的回收率达到78-103％，til的活力>70％，与当前的过程1c的出货标准一致(参见表2)。8.2扩增表型分析的作用(re-rep)。响应有丝分裂刺激而增殖的能力(如本报告所述的实验性re-rep)是til的关键品质特性。此处提供的实验表明，与7/9匹配的新鲜til产物相比，8/9解冻的til产物在一周内可扩增>100倍，支持了解冻的til产物与新鲜til产物的可比性(表2)。til的另外两个关键品质特性是它们在细胞因子(cd3/cd28/4-1bb)刺激后释放ifn-γ和/或颗粒酶b的能力。新鲜产物和解冻产物的细胞因子刺激导致7/9的新鲜产物和所有解冻产物中的ifn-γ释放超过2ng/106个细胞/24小时(图35)(参见本报告的6.2节)。在所有9个过程运行中均观察到颗粒酶b的释放(图36)。cd4和cd8水平(图39和图40)显示了新鲜til产物和解冻til产物之间的显著内部一致性。此外，对til杀死替代肿瘤靶细胞系(p815，图59)的能力的分析显示，新鲜til和解冻til具有相似的细胞毒性潜力。8.3til的代谢压力测试显示出稳健的生物能学。对在re-rep中刺激的新鲜til产物和解冻til产物的代谢特征的分析表明，新鲜til和解冻til对代谢压力测试的反应相似，并且在代谢特征的一个面板中没有实质性差异(表39)。因此，根据本报告中提出的一致性、效价强度、细胞数和活力这4个品质特性，可以认为冷冻保存的过程2atil产物与新鲜的过程1c产物相当。在本报告概述的每项检测中，比较匹配的新鲜细胞和解冻细胞的检测均具有相当的可比性。8.4接受标准：til产物针对各个患者进行个性化治疗的固有异质性反映：(1)他们独特的主要组织相容性复合物限制性分子(人类生物学中最多态的基因产物)；(2)在肿瘤微环境中出现的个体肿瘤独特的进化轨迹，具有基因组不稳定和独特的个体司机突变(drivermutation)和乘客突变(passengermutation)；(3)等位基因变异所赋予的异质性、n区多样性区和vα区和vβ区(限定了用于识别新表位的t细胞受体)中的vdj重排，共有肿瘤-睾丸抗原和病毒编码产物。因此，评估由于方法变化而导致的另外变化是一项艰巨的任务，需要评估尽可能多的参数，以确保自身具有本征异质材料的“可比性”。这通过仔细地检查如下表40所示的几项可接受性标准来实现。表40：可行性和可比性的接受标准基于表11中列出的可行性标准，将评估til是否满足要求。各个实验和各个til品系均满足所有单独的标准(n＝9)。学生t检验用于统计分析。由于活力测试不会是高斯分布，因此使用非参数学生t检验来计算活力％的p值。参见下表41。表41：满足可行性接受标准基于表40中列出的接受标准，评估新鲜和冷冻的re-reptil是否满足要求。(由于re-rep的持续时间为7天，因此未报告活力，并且无法从til中区分出残留的经辐照pbmc)。括号中的数字表示未达到的标准。根据使用cd3+表达测量的纯度标准，6/9的新鲜re-reptil产物符合严格的>90％标准(m1061、m1065和ep11001不符合)，并且8/9解冻的产物即使在进行re-rep后也通过了接受标准。ep11001t新鲜re-rep中cd3+til的数量低可能是由于t细胞受体的极端下调。对于m1023t解冻re-reptil，尚未确定cd3+til的纯度测量。对于此til组合物，使用tcrap染色估算纯度，并用星号(*)表示。使用学生t检验进行统计分析。参见下表42。表42：满足可行性的接受标准文献goffsl,dudleyme,citrinde,somervillerp,wunderlichjr,danforthdn,zlottda,yangjc,sherryrm,kammulaus,klebanoffca,hughesms,restifonp,langhanmm,sheltonte,lul,kwongml,ilyass,klemennd,payabyabec,mortonke,toomeyma,steinbergsm,whitede,rosenbergsa.randomized,prospectiveevaluationcomparingintensityoflymphodepletionbeforeadoptivetransferoftumor-infiltratinglymphocytesforpatientswithmetastaticmelanoma.jclinoncol.2016jul10；34(20):2389-97.doi:10.1200/jco.2016.66.7220.epub2016may23.pubmedpmid:27217459；pubmedcentralpmcid:pmc4981979.hinrichscs,rosenbergsa.exploitingthecurativepotentialofadoptivet-celltherapyforcancer.immunolrev.2014jan；257(1):56-71.doi:10.1111/imr.12132.review.pubmedpmid:24329789；pubmedcentralpmcid:pmc3920180.jinj,sabatinom,somerviller,wilsonjr,dudleyme,stroncekdf,rosenbergsa.simplifiedmethodofthegrowthofhumantumorinfiltratinglymphocytesingas-permeableflaskstonumbersneededforpatienttreatment.jimmunother.2012apr；35(3):283-92.d10.1097/cji.0b013e31824e801f.pubmedpmid:22421946；pubmedcentralpmcid:pmc3315105.somervillerp,devillierl,parkhurstmr,rosenbergsa,dudleyme.clinicalscalerapidexpansionoflymphocytesforadoptivecelltransfertherapyinthebioreactor.jtranslmed.2012apr4；10:69.doniam,larsensm,meto,svaneim.simplifiedprotocolforclinical-gradetumor-infiltratinglymphocytemanufacturingwithuseofthewavebioreactor.cytotherapy.2014aug；16(8):1117-20.doi:10.1016/j.jcyt.2014.02.004；pubmedpmid:24831841.henningal,levittde,vingrenjl,mcfarlinbk.measurementoft-celltelomerelengthusingamplified-signalfishstainingandflowcytometry.currprotoccytom.2017jan5；79:7.47.1-7.47.10.doi:10.1002/cpcy.11.pubmedpmid28055115kelesidist,schmidi.assessmentoftelomerelength,phenotype,anddnacontent.currprotoccytom.2017jan5；79:7.26.1-7.26.23.doi:10.1002/cpcy.12.pubmedpmid:28055113.gardnerm,bannd,wileyl,cooperr,hardyr,nitschd,martin-ruizc,shielsp,sayeraa,barbierim,bekaerts,bischoffc,brooks-wilsona,chenw,cooperc,christensenk,demeyert,dearyi,derg,diezrouxa,fitzpatricka,hajata,halaschek-wienerj,harriss,huntsc,jaggerc,jeonhs,kaplanr,kimuram,lansdorpp,lic,maedat,manginom,nawrotts,nilssonp,nordfjallk,paolissog,renf,riabowolk,robertsont,roosg,staessenja,spectort,tangn,unrynb,vanderharstp,wooj,xingc,yadegarfarme,parkjy,youngn,kuhd,vonzglinickit,ben-shlomoy；halcyonstudyteam..genderandtelomerelength:systematicreviewandmeta-analysis.expgerontol.2014mar；51:15-27.doi:10.1016/j.exger.2013.12.004.epub2013dec21.review.pubmedpmid:24365661；pubmedcentralpmcid:pmc4523138.carbonarim,tedescot,fiorillim.correlationbetweenterminalrestrictionfragmentsandflow-fishmeasuresinsamplesoverwiderangetelomerelengths.cellprolif.2014feb；47(1):20-7.doi:10.1111/cpr.12086.pubmedpmid:24450811.rufern,dragowskaw,thornburyg,roosneke,lansdorppm.telomerelengthdynamicsinhumanlymphocytesubpopulationsmeasuredbyflowcytometry.natbiotechnol.1998aug；16(8):743-7.pubmedpmid:9702772.liy,lius,hernandezj,vencel,hwup,radvanyil.mart-1-specificmelanomatumor-infiltratinglymphocytesmaintainingcd28expressionhaveimprovedsurvivalandexpansioncapabilityfollowingantigenicrestimulationinvitro.jimmunol.2010jan1；184(1):452-65.doi:10.4049/jimmunol.0901101.epub2009nov30.pubmedpmid:19949105.rosenbergsa,dudleyme.adoptivecelltherapyforthetreatmentofpatientswithmetastaticmelanoma.curropinimmunol.2009apr；21(2):233-40.doi:10.1016/j.coi.2009.03.002.epub2009mar21.review.pubmedpmid:19304471；pubmedcentralpmcid:pmc3459355.shenx,zhouj,hathcockks,robbinsp,powelldjjr,rosenbergsa,hodesrj.persistenceoftumorinfiltratinglymphocytesinadoptiveimmunotherapycorrelateswithtelomerelength.jimmunother.2007jan；30(1):123-9.pubmedpmid:17198091；pubmedcentralpmcid:pmc2151201.zhouj,shenx,huangj,hodesrj,rosenbergsa,robbinspf.telomerelengthoftransferredlymphocytescorrelateswithinvivopersistenceandtumorregressioninmelanomapatientsreceivingcelltransfertherapy.jimmunol.2005nov15；175(10):7046-52.pubmedpmid:16272366；pubmedcentralpmcid:pmc1351312.maciejowskij,delanget.telomeresincancer:tumoursuppressionandgenomeinstability.natrevmolcellbiol.2017mar；18(3):175-186.doi:10.1038/nrm.2016.171.epub2017jan18.review.pubmedpmid:28096526.erdelf,kratzk,willcoxs,griffithjd,greeneec,delanget.telomererecognitionandassemblymechanismofmammalianshelterin.cellrep.2017jan3；18(1):41-53.doi:10.1016/j.celrep.2016.12.005.pubmedpmid:28052260；pubmedcentralpmcid:pmc5225662.cardenasme,bianchia,delanget.axenopuseggfactorwithdna-bindingpropertiescharacteristicofterminus-specifictelomericproteins.genesdev.1993may；7(5):883-94.pubmedpmid:7684008.delanget.activationoftelomeraseinahumantumor.procnatlacadsciusa.1994apr12；91(8):2882-5.review.pubmedpmid:8159672；pubmedcentralpmcid:pmc43476.delanget,shiuel,myersrm,coxdr,naylorsl,killeryam,varmushe.structureandvariabilityofhumanchromosomeends.molcellbiol.1990feb；10(2):518-27.pubmedpmid:2300052；pubmedcentralpmcid:pmc360828.9.其他表格表43-图39：cd4+细胞肿瘤idm1061m1062m1063m1064m1065ep11001m1056m1058m1023新鲜4.853410.541.764.964.74.1512.38.38解冻5.683311.349.561.762.63.4617.97.6新鲜rerep8.123.519.239/31.916.36.4612.916.7解冻rerep113315.349.339.326.79.5117.219.1表44-图40：cd8+细胞表45-图41：cd4+cd154+细胞和图105：cd8+cd154+细胞表46-图43：cd4+cd69+细胞和图17：cd8+cd69+细胞表47-图45：cd4+cd137+细胞和图19cd8+cd137+细胞表48-图47：cd4+cm细胞和图21cd8+cm细胞表49-图49：cd4+em细胞和图23cd8+em细胞表50-图51：cd4+cd28+细胞和图25cd8+cd28+细胞表51-图53：cd4+pd-1+细胞和图27cd8+pd-1+细胞表52-图55：cd4+lag3+细胞和图29cd8+lag3+细胞表53-图57：cd4+tim-3+细胞和图31cd8+tim-3+细胞表54-图61：qpcr和flow-fish确定端粒长度重复肿瘤idm1061m1062m1063m1064m1065ep11001m1056m1058m1023qpcr0.1118780.1358420.1496850.1792440.1517740.1377380.1349040.1241370.086569flow-fish9.33023612150418.7822317.1746278.96155361129189.0106157.9445345.766692实施例20：给转移性黑色素瘤患者施用的新型冷冻保存肿瘤浸润淋巴细胞(ln-144)在多中心ii期临床试验中证明了给转移性黑色素瘤患者施用的新型冷冻保存的肿瘤浸润淋巴细胞(ln-144)的疗效和耐受性。介绍：已在数百名转移性黑色素瘤患者中研究了采用非冷冻保存的肿瘤浸润淋巴细胞(til)的过继性细胞治疗(act)的安全性和有效性。此项多中心临床试验以作为非冷冻保存和冷冻保存的输注产品的集中生产的til(ln-144)为开始。我们在队列1中使用了非冷冻保存的ln-144的新的生产方法，而在队列2中使用了缩短了3周时间的、冷冻保存的ln-144。队列2生产提供了显著缩短的过程，再加上冷冻保存的til产物，其可以灵活地安排患者日程和剂量。更短的生产过程减少了患者接收其til产物的等待时间，并且冷冻保存为物流和运送到临床部位增加了便利。方法：c-144-01是一项评估接受ln-144的转移性黑色素瘤患者的前瞻性多中心研究。在使用cy/flu预处理方案进行非清髓性淋巴耗竭之后，患者将接受ln-144的单次输注，然后施用最多6剂的il-2(600,000iu/kg)。评估患者的客观缓解率作为主要终点，长达24个月。结果：我们表征了冷冻保存的ln-144，给第2队列患者(队列2)(n＝10)施用该冷冻保存的ln-144后，进行与队列1相同的pre-til和post-til输注治疗方案。队列2的患者接受了严格的预处理，增加了先前品系的数量，所有患者均接受了抗ctla-4和抗pd-1治疗，并且肿瘤负荷更大(队列2、1的平均sod：15.3、10.9cm)。队列2、1的先前全身治疗的中位数分别为4、3。安全数据的初步分析表明，冷冻保存的ln-144具有相当的耐受性。对于此晚期患者群，接受未冷冻保存的ln-144的队列1患者的安全性仍然是可接受的。在两个队列中，按频率观察到的最常见的不良事件(teae)是：恶心、贫血、发热性中性粒细胞减少、嗜中性粒细胞减少、血小板减少。对疗效数据的早期审查表明，在队列2中治疗的患者中观察到了til治疗的抗肿瘤活性，包括pr。结论：这代表了使用集中生产的til在多中心环境中进行的第一项临床试验，评估了具有显著更短过程(约3周)的冷冻保存的自体产品的新方法。初步结果表明，对于多次先前治疗(包括检查点抑制剂)均失败的转移性黑色素瘤患者来说，冷冻保存的ln-144是一种安全且可耐受的治疗选择。冷冻保存的ln-144为患者和护理人员提供了更大的灵活性，并为具有这种高医疗需求的患者提供了更及时的治疗。nct02360579。实施例21：2a过程中使用的无血清培养基的评估本实施例提供了数据，该数据显示了评估用无血清培养基替代目前在2a过程中使用的标准cm1、cm2和cm4培养基的效力。此项研究测试了在三个阶段中用商购的无血清培养基(sfm)和无血清替代培养基作为替代品的效力。第1阶段：比较使用标准品与使用ctsoptimizer或primetcdm或xvivo-20无血清培养基(有或者没有血清替代品或者血小板裂解液)时til扩增的效力(n＝3)。第2阶段：使用g-rex5m，在小型2a过程中检测候选无血清培养基条件(n＝3)。背景信息尽管目前在prerep和postrep培养中使用的当前培养基组合已被证明有效，但是aim-v可能会发生rep失败。如果鉴定出有效的无血清替代品，通过将使用的培养基类型数量从3种减少到1种，将使过程更直接，更容易在cmo中进行。此外，sfm通过排除人类血清的使用而降低了偶然性疾病的机会。本实施例提供的数据支持了在2a过程中使用无血清培养基。缩写μl：微升cm1、cm2、cm4：完全培养基1、完全培养基2、完全培养基4ctsoptimizersfm：细胞治疗系统optimizer无血清培养基g：克hr：小时ifu：使用说明il-2：白介素2细胞因子min：分钟ml：毫升℃：摄氏度pre-rep：pre-快速扩增方案rep：快速扩增方案rt：室温sr：血清替代物til：肿瘤浸润淋巴细胞实验设计如lab-008中所述，启动pre-rep和rep。图150显示了这三个实验阶段的概述。如图150所示，该项目旨在分两步检测无血清培养基和补充物。第1步：选择无血清培养基供应商。在g-rex24孔板中设置pre-rep和postrep以模拟2a过程。通过在每个条件下一式三份或者一式四份地培养g-rex24孔板的各碎片/孔来启动pre-rep。通过在第11天培养4×105til/孔的g-rex24孔来开始rep，在第16天分开，在第22天收获。ctsoptimizer、x-vivo20和primet-cdm被用作pre-rep和rep中潜在的无血清培养基替代品。将cts免疫sr血清替代品(lifetechnologies)或者血小板裂解液血清(sdbb)以3％的比率加入sfm中。计划每种情况均在pre-rep和post-rep中检测至少3个肿瘤以模拟2a过程。第2步：根据方案(tp-17-007)，在小型2a过程中对鉴定出的候选物进行进一步检测。简而言之，通过在每种条件下一式三份培养2个碎片/g-rex5m烧瓶来启动pre-rep。在第11天使用2×106/g-rex5m烧瓶开始rep，在第16天分开，在第22天收获。注：一些肿瘤在一个实验中被处理和设置用于测量多个参数。讨论将无血清培养基与2a过程中使用的标准品进行比较时，观察到同等的或者统计学上更好的细胞生长结果。与在2a过程中使用的标准培养基中生长的til相比，从无血清培养基中生长的til观察到相似的表型、ifn-γ产生和代谢物分析。结果检测无血清培养基对pre-rep和postrep扩增的效力。ctsoptimizer+sr(血清替代物)显示出增强的pre-reptil扩增和相当的reptil扩增。在标准条件下测试添加或者不添加3％cts的ctsoptimizer、x-vivo20和primet-cdm免疫ctssr。在m1079和l4026中，与标准条件(cm1、cm2、cm4)相比，ctsoptimizer+csr条件显示pre-reptil扩增显著增强(p<0.05)(图62a)。相反，没有csr的ctsoptimizer不能促进pre-reptil扩增(附录1、2、3)。测试的3个肿瘤中的2个用ctsoptimizer+csr在postrep中显示了相当的til扩增(图2b)。x-vivo20和primet-cdm条件在prerep和postrep都发生了大量改变，而ctsoptimizer在4个重复之间相对一致。另外，当与标准品相比时，添加sfm的血小板裂解物没有使pre-rep和post-reptil扩增增强(图62a)。这一发现表明，血清替代物对于提供与我们的标准品相当的生长来说是必须的，ctsoptimizer+csr可以作为候选物。在g-rex5m的迷你规模下测试候选条件(参见图64)。postreptil的表型分析。请参见下图66和表56。表56：使用ctsoptimizer的cd8偏移干扰素-γ可比性干扰素-γelisa(quantikine)。通过r&d系统使用quantikineelisa试剂盒检测ifn-γ的产生。与我们的标准条件相比，cts+sr产生了相当数量的ifn-γ。参见图67。实施例22：t细胞生长因子混合物il-2/il-15/il-21增强肿瘤浸润t细胞的扩增和效应子功能含有自体肿瘤浸润淋巴细胞(til)的过继性t细胞治疗已证明对转移性黑色素瘤和宫颈癌患者具有临床疗效。在一些研究中，更好的临床结果与注入的细胞总数和/或cd8+t细胞的百分比呈正相关。当前大多数生产方案仅利用il-2促进til生长。已经报道了使用含有il-15和il-21的方案增强的淋巴细胞扩增。此项研究描述了在临床上最近实施的第2代il-2til方案中添加il-15和il-21的积极作用。材料和方法产生til的过程包括预快速扩增方案(pre-rep)；其中，将1-3mm3大小的肿瘤碎片置于含有il-2的培养基中。pre-rep期间，til从肿瘤碎片中移出并响应il-2刺激而扩增。为了进一步刺激til的生长，通过称为快速扩增方案(rep)的二级培养期扩增til，其包含经辐照的pbmc饲养细胞、il-2和抗cd3。在此项研究中，开发了用于扩增til的缩短的pre-rep和rep扩增方案，同时保持最终til产物的表型和功能属性。该缩短的til产生方案用于评估单独的il-2与组合的il2/il-15/il-21的影响。比较了这两种培养方案的til产生(由大肠癌、黑色素瘤、宫颈癌、三阴性乳腺癌、肺癌和肾癌生长)。pre-rep完成后，评估培养的til的扩增、表型、功能(cd107a+和ifnγ)和tcrνβ谱系。使用标准的il-2(600iu/ml)方案，或者除用il-2外还使用il-15(180iu/ml)与il-21(iu/ml)，来启动pre-rep培养。在pre-rep完成时评估细胞的扩增。如果总体生长至少提高了20％，则将培养物分类为与il-2相比扩增增加。本文介绍了黑色素瘤和肺的表型及功能研究。参见下表57。表57：多种适应症中用il-2/il-15/il-21在pre-rep期间的扩增增强这些数据表明，与单独的il-2相比，用il-2/il15/il-21培养til时，til产物的产量增加，此外在肺中有表型和功能上的差异。三重混合物对til扩增的作用是适应症特异性的，并且使大多数低产率肿瘤(lowyieldtumor)受益。通过对nsclctil产物进行处理，cd8+/cd4+t细胞的比率增加。通过评估黑色素瘤和nsclc中cd107a表达水平，向il-2添加il-15和il-21显示出t细胞活性增强。此处提供的数据表明，使用更短更稳健的方法(例如本申请和其他实施例中所述的2a过程)进行的til扩增可适用il-2/il-15/il-21细胞因子混合物，从而提供了进一步促进til扩增的手段，特别是在特定适应症中。正在进行的实验正在进一步评估il-2/il-15/il-21对til功能的影响。其他实验将评估rep(第一次扩增)过程中三重混合物的效果。这些观察结果与大规模生产til所需的til培养方案的优化和标准化特别相关，并且具有主流抗癌治疗所需的广泛适用性和可用性。实施例23：用简化方法生产的冷冻保存的til背景本实施例提供了与用于ln-144的冷冻保存的肿瘤浸润淋巴细胞(til)产品有关的数据，该til产品用适用于高通量商业生产的简化方法生成，表现出良好的过继性细胞转移(act)的品质特性。生产临床til产物的现有方法涉及开放的操作员干预，然后延长孵育时间以产生治疗产品。第1代过程需要约6周的时间，可以生产出新鲜的产品。为了将til治疗带给所有可能受益于其潜力的患者，开发了一种简化的22天培养方法(第2代)，该方法适用于集中制造，并且可以将冷冻保存的药品运送到遥远的临床地点。第2代代表了一种灵活、坚固、封闭和半自动化的细胞生产过程，适用于商业规模的高通量生产。通过此种方法产生的药品具有与第1代过程产生的药品相当的品质特性。研究目标：对第1代(过程1c实施方式)和第2代(过程2a实施方式)产生的药品进行了分析，以确定以下品质特性的可比性：剂量和倍数扩增。t细胞纯度和t细胞亚群的比率。共刺激分子在t细胞亚群上的表型表达。端粒重复序列的平均相对长度。响应tcr活化而分泌细胞因子的能力。t细胞受体多样性。til治疗过程概述：提取：从抑制性肿瘤微环境中取出患者的til(通过病灶的手术切除)扩增：在给患者输注til之前，til在加有il-2的培养中呈指数增长，产生109-1011个til。制备：患者接受nma-ld(非清髓性淋巴细胞耗竭，环磷酰胺：60mg/kg，iv×2剂量，以及氟达拉滨：25mg/m2×5剂量)以消除潜在的抑制性肿瘤微环境，并最大程度地提高til治疗的植入和效价强度。输注：给患者输注扩增的til(ln-144)和短时间的大剂量il-2(600,000iu/kg，最多6剂)，以促进til的活化、增殖和抗肿瘤细胞溶解活性。表58：第2代生产的方法改进概述分析方法和仪器：剂量和活力：对最终配制的产品进行取样并分析有核细胞总数、活细胞总数，并使用nc-200自动细胞计数器通过吖啶橙/dapi复染确定活力。流式细胞术：对配制的药物产品进行取样并通过facs测定鉴定一致性。t细胞百分比确定为活细胞的cd45、cd3双阳性。解冻各个过程的卫星(satellite)或者哨兵(sentinel)小管，并分析其扩增的表型标志物，包括cd3、cd4、cd8、cd27和cd28。端粒重复序列的平均相对长度：使用flow-fish技术测量端粒重复序列的平均长度。如用于流式细胞术方案的端粒pna试剂盒/fitc中所述，完成该检测。简而言之，合并2×l06til细胞与2×l061301白血病细胞。dna在82℃下变性10分钟，pna-fitc探针在黑暗中室温杂交过夜。碘化丙锭用于鉴定g0/1期的细胞。免疫检测：在与mab包被的磁珠(lifetechnologies，抗cd3、抗cd28和抗cd137)共培养后，测量药物在重新活化时分泌细胞因子的能力。24小时后，冷冻收获培养上清液，解冻，根据制造商的说明，使用quantikineifnγelisa试剂盒(r&d系统)通过elisa进行分析。t细胞受体多样性：分离最终配制产物中的rna，并使用vdj特异性引物进行多重pcr。半定量扩增til产物中表达的cdr3序列，以确定独特til克隆的频率和普遍性。在illuminamiseq台式测序仪上进行测序。将值表示为指数以得到代表产物中t细胞受体相对多样性的分数。结果与结论：结果提供于图75至图81。第2代过程生产的til产物的品质特性与第1代相当。第2代产生相似数量的高纯度til产物，该高纯度的til产物由与第1代相似比例的t细胞亚群组成，它们表达的共刺激分子水平与第1代相当。第2代til显示出增加的tcr受体多样性，这些受体参与后会引发细胞因子的稳健分泌。冷冻保存的药品具有关键的物流效率，可灵活分配。与以前的过程不同，第2代简化的22天扩增平台提供了可扩展且在物流上可行的til生产平台，该平台可为急需治疗的患者快速生成临床规模的剂量。第2代til生产方案解决了迄今为止阻碍til治疗更广泛应用的许多障碍。实施例24：评估同种异体饲养细胞：til比率的范围(100：1至25：1)此项研究检测了相对于对照(过程1c目前使用同种异体饲养细胞：til为100：1)比率为25：1和50：1的til的增殖。美国国家癌症研究所外科分会发表的研究表明，开始rep时，g-rex100烧瓶中til的最佳活化阈值为25×106个同种异体饲养细胞/cm(1)。这已通过数学建模得到验证，并使用相同模型进行预测：通过优化每单位面积的细胞：细胞接触的饲养细胞层，同种异体饲养细胞相对于til的比率可以降低至25：1，且对til活化和扩增的影响最小。此项研究确定了rep开始时每单位面积的饲养细胞的最佳密度，并验证了减少和规范化每个临床批次所使用的饲养细胞数量所需的rep开始时同种异体饲养细胞比率的有效范围。该研究还证实了用与固定数量饲养细胞共培养的少于200×106til的rep的启动。a.t细胞的体积(直径10μm):v＝(4/3)πr3＝523.6μm3。b.高度40μm(4个细胞)的g-rex100(m)柱:v＝(4/3)πr3＝4×1012μm3c.填充柱b所需细胞数量：4×1012μm3/523.6μm3＝7.6×108μm3*0.64＝4.86×108d.可在4d空间中最佳地活化的细胞数量：4.86×108/24＝20.25×106e.根据g-rex500推断出的饲养细胞和til数量：100×106til和2.5×109饲养细胞。等式1.单核细胞数量的估算需要在底面为100cm2的圆柱中提供二十面体几何形状以活化til。计算得出约5×108的t细胞阈值活化的实验结果，该结果与nci实验数据非常相似。(1)(c)乘数(0.64)是由jaeger和nagel在1992年(2)计算的等效球体的随机堆积密度。(d)除数24是可在4维空间“牛顿数”中接触相似物体的等效球的数量。(4)参考文献：(1)jin,jianjian,et.al.,simplifiedmethodofthegrowthofhumantumorinfiltratinglymphocytes(til)ingas-permeable烧瓶tonumbersneededforpatienttreatment.j.immunother.2012apr；35(3):283–292.(2)jaegerhm,nagelsr.physicsofthegranularstate.science.1992mar20；255(5051):1523-31.(3)o.r.musin(2003)."theproblemofthetwenty-fivespheres".russ.math.surv.58(4):794–795.实施例25：til产品关键品质特性的研究背景含有自体肿瘤浸润淋巴细胞(til)的过继性t细胞治疗已证明对转移性黑色素瘤和其他肿瘤患者具有临床疗效1-3。临床研究的大多数报告都包括对输注的til产物的探索性分析，目的是确定可能与产品疗效和/或安全性相关的品质特性，例如无菌、一致性、纯度和效价强度。4,5此处我们介绍了对til产物的三个关键产品参数的评估，这些参数可能会为将来的til商业生产中使用的质量控制平台做出贡献。til治疗过程概述1.从患者身上切除肿瘤并将其运送到gmp生产设备。2.到达后，破碎肿瘤，将其置于具有il-2的烧瓶中，进行快速快速扩增方案(rep)。3.在经辐照的pbmc、抗cd3抗体(30ng/ml)和il-2(3000iu/ml)的存在下，re-reptil在rep方案中进一步繁殖。4.对til产物的关键品质特性进行评估，包括：(1)一致性，(2)纯度和(3)效价强度。5.在输注扩增的til(ln-144)之前，患者接受由环磷酰胺和氟达拉滨组成的非清髓性淋巴细胞耗竭。输注til后，患者接受短期(最多6剂)高剂量il-2(600,000iu/kg)，以支持转入的til的生长和移植。研究目标目标：全面表征til产物的一致性、纯度和效价强度，从而(a)指导关键品质特性的定义，以及(b)支持建立正式的出货标准，以在til产物的商业生产中实施。策略：开发以下分析方法以支持til产物表征。特别地，进行以下方法：通过流式细胞术进行表型分析以进行一致性和纯度评估，通过残留肿瘤细胞检测法进行纯度测量，通过干扰素-γ释放法进行效价强度评估。材料与方法一致性与纯度表型表征：til产物用抗cd45、抗cd3、抗cd8、抗cd4、抗cd45ra、抗ccr7、抗cd62l、抗cd19、抗cd16和抗cd56抗体染色，并且通过流式细胞术进行分析以定量t细胞和非t细胞亚群。纯度残留肿瘤检测：til产物用抗mcsp(与黑色素瘤相关的硫酸软骨素蛋白多糖)和抗cd45抗体以及可固定活/死细胞的aqua染料染色，然后通过流式细胞术分析以检测黑色素瘤细胞。加标的对照用于评估肿瘤检测的准确性并建立数据分析的门控标准。效价强度ifnγ释放检测法：用抗cd3/cd28/cd137包被的微珠再刺激til产物18至24小时，然后收集上清液以使用elisa检测法评估ifnγ分泌。结果一致性：大部分黑色素瘤til产物(＞99％)由cd45+cd3+细胞组成。图86a-86c使用10色流式细胞术测定提供til产物的表型表征。(a)t细胞和非t细胞亚群的百分比分别由cd45+cd3+和cd45-(非淋巴细胞)/cd45+cd3-(非t细胞淋巴细胞)定义。总体而言，测试的til产物中>99％由t细胞(cd45+cd3+)组成。显示的是til产物的平均值(n＝10)。(b)两个t细胞亚群的百分比，包括cd45+cd3+cd8+(蓝色空心圆圈)和cd45+cd3+cd4+(粉红色空心圆圈)。使用学生未配对t检验，未观察到两个亚组百分比的统计学差异(p＝0.68)。(c)表征了4个不同亚群的非t细胞群，包括：1)非淋巴细胞(cd45)、2)nk细胞(cd45+cd3-cd16+/56+)、3)b细胞(cd45+cd19+)和4)非nk/b细胞(cd45+cd3cd16cd56cd19-)。一致性：大多数黑色素瘤til产物表现出效应或者记忆t细胞表型，与t细胞的细胞毒性作用有关。图87a和87b显示了cd45+cd3+cd4+和cd45+cd3+cd8+细胞群中t细胞亚群的表征。使用cd45ra和ccr7定义了幼稚、中枢记忆(tcm)、效应记忆(tef)和效应记忆ra+(emra)t细胞亚群。图87a和87b显示了来自10种最终til产物的代表性t细胞亚群(a)cd4+和(b)cd8+细胞群的。在til终产物的cd4+和cd8+亚群中，效应记忆t细胞亚群(蓝色空心圆圈)是主要群(＞93％)。不到7％的til产物细胞是中枢记忆亚群(粉红色空心圆圈)。在til产物中几乎未检测到emra(灰色空心圆圈)和幼稚(黑色空心圆圈)亚群(<0.02％)。p值表示使用学生的未配对t检验的em和cm之间的差异。纯度：mcsp代表用于纯度检测的合适的黑色素瘤肿瘤标志物。图88a和88b显示了在黑色素瘤肿瘤细胞中mcsp和epcam表达的检测。根据本文所述方法产生的黑色素瘤肿瘤细胞系(wm35、526和888)、患者来源的黑色素瘤细胞系(1028、1032和1041)以及结直肠腺瘤癌细胞系(ht29作为阴性对照)通过对mcsp(黑色素瘤相关的硫酸软骨素蛋白多糖)和epcam(上皮细胞粘附分子)标志物进行染色来表征。(a)平均90％黑色素瘤肿瘤细胞表达mcsp。(b)与阳性对照ht29(epcam+肿瘤细胞系)相比，黑色素瘤肿瘤细胞系中未检测到epcam表达。纯度：开发基于流式细胞术的检测试剂盒，用于检测til产物中的残留肿瘤细胞。图89a和89b显示了确定肿瘤检测准确性的加标对照的检测。通过将已知量的肿瘤细胞加入pbmc悬液中(n＝10)进行检测。将mcsp+526黑色素瘤肿瘤细胞以1：10、1：100和1：1000的比率稀释，然后与pbmc混合并用抗mcsp和抗cd45抗体以及活/死染料染色，通过流式细胞术进行分析。(a)分别以1∶10、1∶100和1∶1000的稀释度检测到约3000、300和30个细胞。(b)在每种条件下采集的细胞的平均值(av)和标准偏差(sd)用于定义参考上下限。纯度：对残留肿瘤检测测定的鉴定使用加标对照。图90a和90b显示了加标对照的上下限的重复性研究。一式三份地进行三个独立实验，以确定加标实验的重复性。(a)检测到的mcsp+肿瘤细胞的数量始终在参考上限和下限范围内。(b)线性回归图表明mcsp+细胞与加标稀释度(r2＝0.99)之间的相关性，黑色实线显示最佳拟合。绿色和灰色虚线分别代表标准曲线和样品(exp#1至3)中95％的预测极限。纯度：黑色素瘤肿瘤细胞污染物低于最终til产物中检测的极限。图91a和91b显示了til产物中残留黑色素瘤肿瘤的检测。使用开发的检测方法评估til产物的残留肿瘤污染(n＝15)。可检测到的mcsp+事件的中位数和百分比分别为2和0.0002％。效价强度：til的ifnγ分泌(始终>1000pg/ml)证明了til产物的效应子功能。图92显示了t细胞活化后til产物的效价强度评估。一式两份通过elisa评估用抗cd3/cd28/cd137再刺激的til产物的ifnγ分泌(n＝5)。使用wilcoxon符号秩检验，til产物的ifnγ分泌显著大于未刺激对照(p＝0.02)，并且始终>1000pg/ml。认为ifnγ分泌>200pg/ml是有效的，p值<0.05被认为具有统计学意义。结论评估了til产物的一致性、纯度和效价强度的关键产物参数。根据本文所述方法制造的til产物由大于99％的cd45+cd3+t细胞组成。大多数cd4+和cd8+til亚型表现出与t细胞细胞毒性功能相关的效应记忆表型。基于流式细胞术的检测方法可成功检测出最终的til产物中的黑色素瘤细胞。应用此检测法，最终til产物中的污染性黑色素瘤肿瘤细胞显示低于检测法检测极限。抗cd3/cd28/cd137再次刺激后，最终til产物的ifnγ分泌可作为商业化til的效价测定。这些数据提供了质量控制平台的基础，该平台将支持til产物商业生产的关键品质特性的进一步发展。实施例26：采用适合高通量商业化生产的简化方法生成的冷冻保存的til产品表现出过继性细胞转移的良好品质特性背景产生用于过继性细胞转移(act)的肿瘤浸润淋巴细胞(til)的经典方法涉及多个离体培养步骤，以产生新鲜的(未冷冻保存)输注产品。第1代(gen1)方法在约6周内产生了一定剂量的新鲜til。开发了将离体培养持续时间缩短至22天的第2代(gen2)til生产方法(图93)。gen2方法适用于集中制造和生产出冷冻保存的til输注产品，为计划、后勤和运送到临床地点带来了便利。通过gen2方法生产的ln-144的冷冻保存til输注产品具有与通过gen1方法生产的til的非冷冻保存til输注产品相当的品质特性。gen2til生产方法代表了一种灵活、稳健、封闭和半自动化的细胞生产方法，适用于商业规模的高产量til生产。研究目标对通过gen1和gen2生产过程产生的til输注产品进行评估，根据以下品质特性确定可比性：(1)细胞计数(剂量)、活力、rep期的生长速率；(2)t细胞纯度和t细胞亚群上共刺激分子的表型表达；(3)端粒重复序列的平均相对长度；(4)响应cd3、cd28，cd137参与而分泌ifnγ的能力；以及(5)存在于最终输注产品中的t细胞受体的多样性(图94)。分析方法与仪器细胞计数和活力：对最终配制的输注产品进行取样，分析有核细胞总数、活细胞总数，并使用nc-200自动细胞计数器通过吖啶橙/dapi复染来确定活力。在nexcellomcellometerk2细胞活力计数器上使用吖啶橙/碘化丙啶双荧光染色法对方法开发批次进行分析。表型标志物：对配制的输注产品进行取样，通过免疫荧光染色鉴定一致性。t细胞百分比确定为cd45+、cd3+(双阳性)活细胞群。解冻各个过程的冷冻卫星或者哨兵小管，并分析其扩增的表型标记，包括cd3、cd4、cd8、cd27和cd28。在bdfacscantoii上获得新鲜的输注产品，在bio-radze5细胞分析仪上获得已解冻的输注产品上的扩增表型标志物。端粒重复序列的平均相对长度：使用flow-fish技术测量端粒重复序列的平均长度。如用于流式细胞术方案的端粒pna试剂盒/fitc中所述，完成该检测。简而言之，合并2.0×106til细胞与2.0×106人细胞系(1301)白血病t细胞。将dna在82℃下变性10分钟，将pna-fitc探针在黑暗中室温杂交过夜。碘化丙锭用于鉴定g0/1期的细胞。免疫功能：与抗体包被的磁珠共培养后，检测输注产物在重新活化后分泌ifnγ的能力(lifetechnologies，抗cd3、抗cd28和抗cd137)。24小时后，根据制造商的说明，使用quantikineifnγelisa试剂盒(r&d系统)，收获、冷冻、解冻培养上清液，通过elisa进行检测。t细胞受体多样性：分离输注产品中的rna，并使用vdj特异性引物进行多重pcr。将til产物中表达的cdr3序列进行半定量扩增并进行深度测序，以确定独特的til克隆的频率和流行程度。在illummamiseq台式测序仪上进行测序。将值表示为指数以得到代表产物中t细胞受体相对多样性的分数。结果在第22天，合并体积减少的细胞产物，取样，确定在洗涤和配制之前的培养性能。图95a-95c显示了活细胞总数、生长速率和活力。(a)如前所述，在nc-200自动细胞计数器上分析样品。总活细胞密度由4个独立样品的重复计数的总平均值确定。gen2过程产生的til产物的剂量与gen1相似(gen1平均数＝4.10×1010±2.8×1010，gen2平均数＝4.12×1010±2.5×1010)。(b)计算的rep阶段的生长速率为。(c)如前所述，使用cellometerk2从9个方法开发批次中评估了细胞活力。在配制产物的单个冻融循环后，未观察到细胞活力的显著降低。解冻和取样后的活力平均降低了2.19％。图96a-96c显示，gen2产物是高纯度的t细胞培养物，以与gen1相当的水平表达共刺激分子。(图96a)通过流式细胞术，检测新鲜配制的药物产品的一致性以进行出货。gen1和gen2过程可产生cd45+、cd3+(双阳性)表型所定义的高纯度t细胞培养物。(图96b和96c)如前所述，将配制的药物产品的冷冻保存的卫星小管解冻并通过流式细胞术分析扩增表型。gen1和gen2产物在t细胞亚群上表达了相似水平的共刺激分子cd27和cd28。可能需要共刺激分子(例如cd27和cd28)来提供t细胞受体参与后效应细胞增殖所必需的次级和三级信号传导。使用曼-惠特尼检验计算p值。图97显示gen2产物趋向于更长的相对端粒。长度。如前所述，使用flow-fish技术测量端粒重复序列的平均长度。rtl值表明，对照细胞系(1301白血病细胞系)中，gen1的每个染色体/基因组的平均端粒荧光为7.5％±2.1％，gen2的为每个染色体/基因组的端粒荧光的8.4％±1.8％)。数据表明，第2代产物平均具有与第1代产物相当的端粒长度。端粒长度是离体细胞培养长度的替代量度。图98显示，gen2药物产品响应于cd3、cd28和cd137的结合而分泌ifnγ。如前所述，将冷冻保存的药物产品解冻并与抗体包被的微珠一起孵育。数据表示为5小时105个活细胞在24小时内产生的ifnγ的量。相对于gen1药物产品，gen2药物显示出在重新活化后产生ifnγ的能力增强。在hla的情况下，tcr结合同源抗原后，待重新活化并分泌细胞因子的药物的能力是体内功能的替代指标。图99a和99b显示gen2药物产品具有增加的独特t细胞受体多样性。t细胞受体多样性如下评估。分析来自gen1和gen2输注产物的10×106til的rna，以确定每种产物中存在的独特cdr3序列的总数和频率。(图99a)相对于每种产物中的频率对独特的cdr3序列进行指数变化，以产生代表产物中t细胞受体总体多样性的得分。(图99b)每种输注产物中存在的独特cdr3序列的平均总数。来自两个过程的til产物由具有不同抗原特异性和亲和力的t细胞多克隆群组成。总t细胞谱系的宽度可以指示肿瘤细胞上存在的可作用表位的数量。结论gen2制造方法生产的til输注产品(ln-144)具有与gen1相似的品质特性。gen2产生了相似剂量的高纯度til。t细胞亚群的比率相似，并且以相对于gen1相当的水平表达共刺激分子。gen2til趋向于更长的相对端粒长度，与离体培养时间缩短相对应。gen2til表现出增加的tcr受体多样性，当参与时，tcr受体开始强烈分泌ifn-γ，这是细胞溶解效应子功能的一种量度。因此，第2代简化的22天封闭扩增流程(具有冷冻保存的输注产品)提供了可扩展的且在逻辑上可行的til生产平台，该平台能够为急需新治疗选择的癌症患者快速产生临床规模的剂量。参考文献1dudley,m.e.etal.adoptivecelltransfertherapyfollowingnon-myeloablativebutlymphodepletingchemotherapyforthetreatmentofpatientswithrefractorymetastaticmelanoma.jclinoncol23,2346-2357,doi:10.1200/jco.2005.00.240(2005).2chandran,s.s.etal.treatmentofmetastaticuvealmelanomawithadoptivetransferoftumour-infiltratinglymphocytes:asingle-centre,two-stage,single-arm,phase2study.lancetoncol,doi:10.1016/s1470-2045(17)30251-6(2017).3stevanovic,s.etal.completeregressionofmetastaticcervicalcanceraftertreatmentwithhumanpapillomavirus-targetedtumor-infiltratingt细胞.jclinoncol33,doi:10.1200/jco.2014.58.9093(2015).4fdareviewers和sponsors:content和reviewofchemistry,manufacturing,和control(cmc)informationforhumangenetherapyinvestigational“新的”drugapplications(inds),21cfr610.3(r),2008.5richardsjo,treismanj,garlien,hansonjp,oaksmk.flowcytometryassessmentofresidualmelanoma细胞intumor-infiltratinglymphocytecultures.cytometrya2012；81:374-81.实施例27：在本文所述新的方法中，t细胞生长因子混合物il-2/il-15/il-21促进肿瘤浸润t细胞的扩增和效应子功能背景含有自体til的过继性t细胞治疗已证明对转移性黑色素瘤和宫颈癌患者具有临床疗效。在一些研究中，更好的临床结果与注入的细胞总数和/或cd8+t细胞的百分比呈正相关。当前大多数生产方案仅利用il-2促进til生长。已报道了使用含有il-15和il-21的方案增强的淋巴细胞扩增。此项研究描述了向过程2a和第2代til生产过程的实施方式中添加il-15和il-21的积极作用和协同作用。使用本文所述的新方法生成til从患者身上切除肿瘤，将其转移至用于研究目的的gmp生产设备或者实验室。到达后，破碎肿瘤，将其置于具有il-2的烧瓶中，进行预快速扩增方案(pre-rep)11天。对于三重混合物研究，在pre-rep开始时添加il-2、il-15和il-21(il-2/il-15/il-21)。对于快速扩增方案(rep)，til与饲养细胞和抗cd3抗体培养另外的11天(图100)。材料和方法产生til的过程包括预快速扩增方案(pre-rep)，其中，将1-3mm3大小的肿瘤碎片置于含有il-2的培养基中。在pre-rep，til从肿瘤碎片中移出并响应il-2刺激而扩增。为了进一步刺激til的生长，til通过称为快速扩增方案(rep)的二级培养期进行扩增，该方案包含经辐照的pbmc饲养细胞、il-2和抗cd3抗体。开发了扩增til的缩短的pre-rep和rep扩增方案，同时保持最终til产物的表型和功能属性。此种缩短的til产生方案用于评估添加到pre-rep步骤中的单独的il-2与组合的il2/il-15/il-21的影响。比较了这两种培养方案的til产生(由大肠癌、黑色素瘤、宫颈癌、三阴性乳腺癌、肺癌和肾癌生长)。pre-rep完成后，评估培养的til的扩增、表型、功能(cd107a+和ifnγ)和tcrνβ谱系。研究显示，在多种肿瘤组织学类型中，使用il-2/il-15/il-21进行pre-rep时扩增增强。使用标准的il-2(6000iu/ml)方案，或者除用il-2外还使用il-15(180iu/ml)与il-21(1iu/ml)，来启动pre-rep培养(图101)。在pre-rep完成时评估细胞的扩增。如果总体生长至少提高了20％，则将培养物分类为与il-2相比扩增增加。黑色素瘤和肺表型及功能研究将在以下段落中进一步讨论(图101中的加粗文本)。在肺癌中，il-2/il-15/il-21增加了cd8+细胞的百分比，但在黑色素瘤中未增加。在图102a和102b中，在pre-rep后，使用流式细胞术对来自(a)黑色素瘤(n＝4)和(b)肺(n＝7)的til的cd4+和cd8+细胞进行表型评估。p值代表使用学生未配对t检验的il-2和il-12/il-15/il-21条件之间的差异。在用il-2/il-15/il-21处理的培养物中，cd8+细胞中cd27的表达略有增强。在图103a和103b中，在pre-rep后，使用流式细胞术对来自(a)黑色素瘤(n＝4)和(b)肺(n＝7)的til的cd4+和cd8+细胞中的cd27+和cd28+进行表型评估。与单独的il-2相比，cd27+是一种与年轻表型相关的细胞标志物，与过继性t细胞治疗的预后相关，其表达在cd8+til中略有增强。添加il-15/il-21不会改变t细胞亚群。在图104a和104b中，在pre-rep后，使用流式细胞术对来自(a)黑色素瘤(n＝4)和(b)肺(n＝8)的til的cd8+和cd4+(数据未显示)细胞中的效应/记忆亚群(cd45ra和ccr7)进行表型评估。tem＝效应记忆(cd45ra-，ccr7-)，tcm＝中枢记忆(cd45ra-，ccr7+)，tscm＝干细胞记忆(cd45ra+，ccr7+)，temra＝效应t细胞(cd45ra+ccr7-)。il-2/il-15/il-21使til的功能能力有所提高。在图105a和105b中，通过流式细胞术评估来自(a)黑色素瘤(n＝4)和(b)肺(n＝5)的til的cd4+和cd8+细胞在响应pma刺激4小时后的cd107a+表达。(c)用可溶性抗cd3抗体刺激源自黑色素瘤和肺的pre-reptil24小时，通过elisa评估上清液的ifnγ。响应于肺肿瘤而非黑色素瘤中的il-2/il-15/il-21，tcrνβ谱系的相对频率发生改变。在图106a和106b中，使用beckmancoulter试剂盒进行流式细胞术，评估来自(a)黑色素瘤和(b)肺肿瘤的til中的tcrνβ谱系(24种特异性)。概要此项工作证明了与第2代过程中单独的il-2(>20％)相比，il-2/il-15/il-21混合物能够增加til数量，而不影响表型和功能特性。三重混合物对til扩增的影响取决于组织学类型。随着il-2/il-15/il-21的添加，肺肿瘤中cd8+/cd4+t细胞比率增加。il-15和il-21的添加增强了源自肺肿瘤的til中cd107a的表达和ifnγ的产生。il-2/il-15/il-21的添加改变了肺中的tcrνβ谱系。gen2til扩增过程用于包含il-2/il-15/il-21细胞因子混合物，从而提供了进一步促进til在特定肿瘤组织学类型(例如肺肿瘤和大肠肿瘤)中扩增的手段。这些观察结果与大规模生产til所需的til培养方案的优化和标准化特别相关，并且具有主流抗癌治疗所需的广泛适用性和可用性。实施例28：在多中心ii期临床试验中，施用于转移性黑色素瘤患者的新型冷冻保存的肿瘤浸润淋巴细胞(ln-144)具有疗效和耐受性背景已经在数百名转移性黑色素瘤患者中研究了利用肿瘤浸润淋巴细胞(til)进行的过继性细胞治疗(act)的安全性和有效性，并证明了有意义且持久的客观反应率(orr)。1在正在进行的ii期试验中，对采用集中式gmp生产til(非冷冻保存的第1代(gen1)和冷冻保存的第2代(gen2)til生产方法)的c-144-01进行了评估。gen1的生产时间为约5至6周(在c-144-01研究的队列1中进行施用)，而gen2的生产时间为22天(过程2a，在c-144-01研究的队列2中进行施用)。因为til治疗产生了反应，输注gen1ln-144制造产物的队列1患者的初步数据在治疗post-pd-1转移性黑色素瘤患者方面令人鼓舞。gen2的益处包括：(a)减少患者和医生等待给患者输注til的时间；(b)冷冻保存可以灵活地安排、分配和交付；(c)降低制造成本。此处显示了队列2的初步数据。图107显示了gen2冷冻保存的ln-144生产过程(过程2a)的一个实施方式。研究设计：转移性黑色素瘤的c-144-01ii期试验ii期多中心三队列研究用于评估自体肿瘤浸润淋巴细胞(ln-144)治疗转移性黑色素瘤患者的疗效和安全性。关键纳入标准：(1)可测量的转移性黑色素瘤和>1个可切除的til病灶；(2)在至少一项先前的全身治疗上取得进展；(3)年龄>18岁；(4)ecogps0-1。治疗队列：(1)非冷冻保存的ln-144产物；(2)冷冻保存的ln-144产物；(3)对ln-144再治疗无反应或者在初次反应后进展的患者。图108显示了研究设计。终点：(1)主要：疗效被定义为orr；(2)次要：安全和疗效。方法队列2安全组：为了生产til，13名患者经历了切除，并接受了研究治疗的任何成分。队列2疗效组：9名患者接受了nma-ld预处理、ln-144输注和至少一剂il-2，并至少进行了一项疗效评估。数据截止时，有4名患者没有疗效评估。在数据截止日期之前，已显示所有可用数据的生物标志物数据。结果图109提供了说明队列1(asco2017)与队列2的比较患者特征的表格。队列2具有：4种中位的先前治疗(priortherapy)；所有患者均已接受过抗pd-1和抗ctla-4治疗；以及具有更高的肿瘤负担，这是因为目标病灶的直径总和(sod)和基线的平均ldh更高。图110提供了显示治疗突发不良事件(>30％)的表格。对于队列2(冷冻保存的ln-144)，输注产物和til治疗特征为(1)输注的til细胞平均数：37×109和(2)il-2剂量的中位数为4.5。图111显示了输注产品和til治疗对1号至8号患者的疗效。图112显示了具有病情稳定(sd)或者较好反应的可评估反应的患者的临床状况。由于患者尚未达到第二次疗效评估，因此尚未确认患者6的部分反应(pr)。一名患者(9号患者)在第一次评估之前已去世(仍在疗效组中考虑)。在疗效组的9名患者中，一名患者(患者9)由于第一次肿瘤评估前的黑色素瘤相关死亡而无法评估(ne)(图112中未显示)。在用gen2治疗的患者中观察到反应。疾病控制率(dcr)为78％。响应时间与队列1相似。泳道图未包括一名进行性疾病(pd)作为最佳反应的患者(患者3)。图113显示了直径总和的百分比变化。患者9在第42天之前因黑色素瘤相关死亡未进行ln-144后疾病评估。第14天：相对于基线筛选的直径总和的变化百分比(第14天)。第14天至第126天：相对于基准的sod变化百分比。第14天＝基线。第0天＝ln-144输注。经til处理后，观察到hmgb1升高(图114)。使用hmgb1elisa试剂盒(tecanus，inc)测量血浆hmgb1水平。显示的数据代表队列1和队列2在ln-144输注之前(第7天)和之后(第4天和第14天)hmgb1水平的倍数变化(p值使用两尾配对t检验，基于对数转换后的数据)。括号中显示每个时间点的样品大小(粗体和斜体)和平均值(斜体)。hmgb1由活化的免疫细胞分泌，并由受损的肿瘤细胞释放。因此，用ln-144治疗后观察到的hmgb1水平升高，显示了免疫介导的抗肿瘤活性机制。使用luminex测定法检测血浆ip-10水平。图115中显示的数据代表队列1和队列2在输注ln-144之前(第7天)和之后(第4天和第14天)的ip-10水平的倍数变化(p值使用两尾配对t检验，基于对数转换后的数据)。括号中显示每个时间点的样品大小(粗体和斜体)和平均值(斜体)。正在检测输注ln-144后的ip-10增加，以了解与til持续性的可能相关性。图116至图121报告了队列2的更新数据(n＝17位患者)。与队列1和gen1方法的实施方式(显示dcr为64％，总反应率(orr)为29％(n＝14))相比，队列2和gen2方法的实施方式显示dcr为80％，orr为40％(n＝10)。结论现有数据的初步结果表明，gen1和gen2ln-144til产物具有相当的安全性。施用gen2过程(过程2a，如本文所述)生产的til，使得晚期疾病转移性黑色素瘤患者中所见的临床反应出乎意料地增加，这些患者均已在抗pd-1和抗ctla-4先前治疗上取得了进展。队列2的dcr为78％。初步的生物标志物数据支持了为til治疗提议的溶细胞作用机制。本文所述gen2生产方法的实施方式需要22天。该过程大大缩短了患者等待接收其til的时间，为患者提供了施用时机的灵活性，并降低了制造成本，同时提供了优于现有方法的其他优势，可实现商业化和卫生监管机构注册。使用gen2生产方法实施方式的转移性黑色素瘤的初步临床数据还表明，如通过dcr、orr和其他临床反应所测得的，til的临床疗效出乎意料地改善，与使用gen1方法生产的til相比，其反应时间和安全性概况相似。gen2til产物的出乎意料的疗效改善还通过ifn-γ产量增加了5倍以上来体现(图98)，这与总体疗效改善(图122)、多克隆性显著改善(图99a和图99b)和平均ip-10和mcp-1产量更高(图123至图126)有关。出人意料的是，尽管gen2的过程要短得多，但til产物的许多其他关键特性与使用更传统的制造方法所观察到的相似，包括相对端粒长度(图97)以及cd27和cd28表达(图96b和图96c)。参考文献1goff,etal.randomized,prospectiveevaluationcomparingintensityoflymphodepletionbeforeadoptivetransferoftumor-infiltratinglymphocytesforpatientswithmetastaticmelanoma.jclinoncol.2016jul10；34(20):2389-97.2sarnaika,klugerh,chesneyj,etal.efficacyofsingleadministrationoftumor-infiltratinglymphocytes(til)inheavilypretreatedpatientswithmetastaticmelanomafollowingcheckpointtherapy.jclinoncol.2017；35[suppl；abstr3045].实施例29：hnscc和宫颈癌的ii期研究hnscc(头颈部鳞状细胞癌；c-145-03)ii期研究入组。13名患者同意该研究，从10名患者收获til，最终给7名患者输注til，另有1名在进行中。宫颈癌ii期研究(c-145-04)入组。8名患者同意该研究，从4名患者收获til，最终为2名患者输注til，另有2名在进行中。图127提供了正在进行的研究的初始数据。在长达84天的til治疗的hcnscc和宫颈癌患者中均观察到病情稳定(sd)和/或进行性反应(progressiveresponse)。实施例30：冷冻保存的til细胞治疗的生产本实施例描述了根据现行良好组织操作(goodtissuepractices)和现行良好生产规范(goodmanufacturingpractices)，在g-rex烧瓶中，艾欧凡斯生物治疗公司(iovancebiotherapeutics,inc.)的til细胞治疗过程的cgmp生产。该材料将根据美国fda良好生产规范(21cfr第210、211、1270和1271部分)和适用于i期的ichq7标准通过商业材料进行生产。4.0过程参考扩增计划4.2烧瓶体积：烧瓶类型工作体积/烧瓶(ml)g-rex100mcs1000g-rex500mcs50004.3检查程序4.3.1在填充过程中，生产人员将对最终产品的袋子进行100％检查。4.3.2准备一个标有“检查失败最终产品”的容器。4.3.3检查以下不合格属性：4.3.3.1明显可见颗粒(不同于悬液颜色的纤维、颗粒等)(注：细胞/组织团聚不被视为不合格颗粒)。4.3.3.2袋子完整性缺陷，例如漏缝/端口。4.3.3.3外包装袋密封不完整。4.3.3.4密封泄漏。4.3.3.5结块迹象。4.3.4检查以下合格外观属性：4.3.4.1袋子完整。4.3.4.2无结块迹象。4.3.5如果未观察到不合格属性，将最终产品包装袋放回该批次。4.3.6如果发现任何不合格属性，给袋子上贴上“不合格产品”标签，然后将袋子放在“不合格”储存容器。4.4过程流程图(参见图128)5.0过程注释5.1包含最终报告数据结果的打印文件应附加到该批记录的指定区域中。每个打印文件必须标有批号、步骤号(如果适用)以及首字母和日期。如果无法获得打印文件，则必须手动记录读数以代替打印文件，参考注释部分中的注释。第二个同事必须验证数据。5.2获取材料、设置期间、过程后活动或步骤说明另有说明时，可以同时进行过程步骤。5.3在本批记录中，除非另有说明，否则假定1.0ml/l＝1.0g/kg。5.4如果必须在第7.1节更换关键材料/消耗品，则须在第10.0节注明，并联系相关人员。5.5除非整个批记录中另有说明，否则将所有数据四舍五入至小数点后一位(xx.x)或在所用设备的公差范围内(不包括打印数据)。5.6如果设备需要校准一个以上参数且校准到期日期不同，则记录最早的到期日期。5.7该批记录中记录的所有co2测量值均从leagueisland1处的vaisalaco2分析仪读取。该批记录中记录的所有co2测量值均从commercecenter3的led显示屏读取。5.8对leagueisland1的所有培养箱加湿。对commercecenter3的所有培养箱均不加湿。5.9打开后，将在2℃至8℃下进行以下试验：人类血清，ab型(hi)gemini，1个月；2-巯基乙醇，1个月。硫酸庆大霉素(50mg/ml储备溶液)可在室温下保存1个月。装有10laim-v培养基的袋子只能在室温下加热一次，使用前最多只能放24小时。5.10如果未给材料分配wuxiapptec批号，将greatplains的接收编号和批号记录在第7.1节“关键材料/消耗品”中。对于日后采购的新材料，接收编号和批号的组合将取代wuxiapptec批号，作为greatplains系统的实施和验证的一部分。5.11使用tscd焊机进行连接时，遵循印刷在机器正面的说明。确保按照机器指示正确插入管线。装入管线时，确保已插入管线，以使先前的连接不会放在焊机的夹子下(如果可能)。另外，确保为连接后步骤留有足够管线。开始连接过程之前，应在管线的两侧放置止血钳。连接完成后，检查连接以确保连接在管线周围密封均匀。沿连接处捏或滚动手指以弹出连接，然后移除止血钳。5.12每天使用手持式封管机之前，清洁并检查密封头，确保功能正常。当使用手持式封管机分开管时，应在靠近彼此处形成三个封口。确保管线外部干燥以防止产生电弧。除非另有说明，否则请通过断开中间封口来分离或分开管线。请勿在管线上施加反作用力，以防止在密封过程中管线过早分离。如果首次尝试失败，勿尝试重新密封。视需要，使用手持式密封机进行“测试连接”，必要时评估手持式密封机。5.13彻底检查所有夹子和止血钳是否存在缺陷或损坏，这些缺陷或损坏可能会导致止流能力受损或损坏管线。5.14如果nucelocounter通知显示计数1和/或计数2超过最佳计数范围(在稀释前为5×104至5×106)，则在细胞计数页面的其余部分n/a。制备另一个细胞溶液样品，用适当的稀释因子([新的稀释因子]＝[先前的稀释因子]×[报告的细胞数]÷[5×105])稀释，以使vcd或“活细胞”在最佳范围内。如果细胞计数1和/或计数2低于最佳范围(太稀)，联系区域管理，记录“活细胞”计数，进行计算。无论哪种情况，确保在脚注记录超出最佳范围的细胞计数。5.15在记录肿瘤接收信息时，如果尚未确保将从患者摘除肿瘤的时间转换为东部标准时间(est)，则记录在肿瘤运输批次记录。实验室中从患者摘除肿瘤到接受肿瘤所用的时间应以est进行计算。5.16在第22天收获期间，可使用两个gatherextm，从g-rex500mcs烧瓶收获til。两个单元均可用于取出上清液，两个单元之一可用于收集til。5.17在所有处理步骤期间，b级处理套间允许的最低人数为2人，最大人数为10人(包括环境处理人员)。5.18当等分培养基试剂体积≤1.0ml时，在分配后冲洗移液器。5.19在培养基加热期间以及在未进行积极处理的任何其他情况下，将重新孵育烧瓶。如果适用，将仅记录每小节开头和结尾的孵育步骤。在未安排处理的天数，根据区域管理或客户的要求，可观察烧瓶仅供参考，无需对房间进行消毒或监视设备。5.20在第0天肿瘤解剖、接种和烧瓶孵育结束后，应适当地丢弃所有剩余肿瘤碎片和肿瘤块。6.0设备设备列表：第0天，cm1培养基制备/肿瘤洗涤液制备/肿瘤解剖：·差压计(magnehelicgauge)·生物安全柜(bsc)·培养箱·co2分析仪·微量移液器(100-1000μl)·吸管辅助器(pipet-aid)·baxa中继泵·sebra封管机·2℃-8℃冰箱·-80℃冰柜·-20℃冰柜·计时器设备列表：cm2制备/第11天rep接种·差压计·生物安全柜(bsc)·培养箱·培养箱·co2分析仪·干浴·水浴·cytotherm·焊机·gatherex·nc200nucleocounter·baxa中继泵·sebra封管机秤设备列表：cm2制备/第11天rep接种·离心机·微量移液器(100-1000μl)·吸管辅助器(pipet-aid)·计时器·2℃-8℃冰箱·-80℃冰柜·控速冷冻机·ln2储存冷冻柜(quarantine)·-20℃冰柜设备列表：cm4制备/第16天·差压计·生物安全柜(bsc)·培养箱·培养箱·co2分析仪·焊机·焊机·gatherex·nc200nucleocounter·baxa中继泵·sebra封管机秤·微量移液器(100-1000μl)·吸管辅助器(pipet-aid)·2℃-8℃冰箱·-80℃冰柜设备列表：第22天，配制、填充、冷冻保存·差压计·生物安全柜(bsc)·培养箱·培养箱·co2分析仪·焊机·gatherex·nc200nucleocounter·baxa中继泵·sebra封管机秤·微量移液器(20-200μl)吸管辅助器(pipet-aid)设备列表：第22天，配制、填充、冷冻保存·吸管辅助器(pipet-aid)·2℃-8℃冰箱·-80℃冰柜·控速冷冻机·ln2储存冷冻柜·ln2储存冷冻柜(quarantine)·lovo细胞处理系统7.0材料列表材料：第0天，cm1培养基制备/肿瘤洗涤液制备/肿瘤解剖·一次性解剖刀，无菌·50ml血清移液管，无菌·1ml塑料血清移液管，无菌·10ml血清移液管，无菌·离心管，50ml，28×114mm，锥形底座，螺帽，pp，无菌·25ml血清移液管，无菌·5ml血清移液管，无菌·mf75系列，一次性组织培养过滤器，1000ml，apes过滤器，0.2μm，无菌·移液管，血清100ml·2-巯基乙醇1000x，液体，55mm，在d-pbs中·hank平衡钠盐溶液(1x)，液体，w/o氯化钙、氯化镁、硫酸镁·glutamax1-200mm(100x)，液体·artbarrier移液器吸头，1000μl，独立包装，无菌·150mm培养皿，加深，无菌·6孔超低吸附孔板，9.5cm2孔生长面积，ps，无菌·thermoscientificsamco通用移液器，7.7ml，无菌·中继泵流体转运套件，公鲁尔锁端·8英寸长镊子，无菌·硫酸庆大霉素，50mg/ml储备溶液·一次性科学镊子，4.5英寸，不锈钢，无菌·100mm培养皿，无菌，加深·泵送液体分配系统·硫酸庆大霉素，50mg/ml储备溶液·双功能注射器盖，红色·rpmi-1640，1l瓶·g-rex100m烧瓶，封闭系统·无菌性标尺·重组il-2·人体肿瘤样品，头颈，n/a·人体肿瘤样品，宫颈，n/a·gemcell人血清ab，热灭活，n/a·人类肿瘤样品，黑色素瘤·gemcell人血清ab，热灭活材料：cm2制备/第11天rep接种·鲁尔锁(luer-lok)注射器，60ml无菌针头16g×1.5”，无菌·50ml血清移液管，无菌·1ml血清移液管，塑料，无菌·nunc内螺纹冻存管，无菌·10ml血清移液管，无菌·离心管，15ml·离心管，50ml·移液管，血清100ml·1cc鲁尔锁注射器，无菌·3ml注射器，鲁尔锁吸头，无菌·5ml血清移液管，无菌·nalgene*mf75*系列过滤器单元接收容器，250ml，无菌·nalgenemf75系列过滤器单元接收容器，500ml，无菌·1000mlnalgene快速流动无菌一次性过滤器单元，0.22μmpes·cryostorcs-10·2-巯基乙醇1000x，液体，55mm，在d-pbs中·glutamax1-200mm(100x)，液体·1000μlartbarrier无菌移液器吸头，独立包装·via1盒·转运包容器，1000ml，带连接器，无菌·转运包300ml，带连接器·无菌酒精棉片·中继泵流体转运套件，公鲁尔锁端·ctsaimv1l瓶·纯macsgmpcd3(okt-3)·硫酸庆大霉素，50mg/ml储备溶液·4英寸管，带穿刺针和注射器适配器·仅鲁尔锁注射器，10ml·管，四尖嘴公鲁尔歧管·重力式给血装置(gravitybloodadministrationset)，y型，无注射位点，170μm血液过滤器·泵送液体分配系统·10llabtainer3端口袋·硫酸庆大霉素，50mg/ml储备溶液·100ml注射器·3000ml培养袋·origencellconnectcc2·双功能注射器盖，红色·rpmi-1640，1l瓶·g-rex500m烧瓶，封闭系统·重组il-2·同种异体的经辐照饲养细胞·同种异体的经辐照饲养细胞·人血清，ab(hi)型(gemini)·人血清，ab(hi)型(gemini)材料：cm4制备/第16天·鲁尔锁注射器，60ml，无菌·1ml塑料血清移液管，无菌·nunc无菌内螺纹圆柱管样品瓶·10ml血清移液管，无菌·离心管，15ml·离心管，50ml·血清移液管，100ml·带鲁尔锁的无菌注射器，3ml·5ml血清移液管，无菌·鲁尔锁注射器，10ml·nalgene*mf75*系列·过滤器单元接收容器，250ml，无菌·glutamax1-200mm(100x)，液体·1000μlartbarrier移液器吸头，独立包装，无菌·via1盒材料：cm4制备/第16天·转运包容器，1000ml，带连接器，无菌·无菌酒精棉片·中继泵流体转运套件，公鲁尔锁端·ctsaim-v1000ml，n/a·血浆转运装置4英寸管，带母鲁尔接头·30ml鲁尔锁无菌注射器·ctsaimv10l袋·泵送液体分配系统·10llabtainer3端口袋·双功能注射器盖，红色·g-rex500m烧瓶，封闭系统·重组il-2材料：第22天，配制、填充、冷冻保存·鲁尔锁注射器，60ml，无菌·16g针x1.5英寸，无菌·50ml血清移液管，无菌·nunc内螺纹冻存管，无菌·10ml血清移液管，无菌·离心管，15ml·离心管，50ml·1cc鲁尔锁注射器，无菌·3ml注射器，鲁尔锁吸头，无菌·25ml血清移液管，无菌·5ml血清移液管，无菌·鲁尔锁注射器10ml·血清移液管，100ml·artbarrier无菌移液器吸头，200μl，独立包装·via1盒·plasma-lytea注射液1l·lovo一次性细胞洗涤套装·lovo辅助袋套件·无菌酒精棉片·中继泵流体转运套件，公鲁尔锁端·ctsaimv1l瓶·人白蛋白25％·血浆转运装置4英寸管，带母鲁尔接头·管，四公鲁尔歧管·重力式给血装置·y型装置，无注射位点，170μm血液过滤器·泵送液体分配系统·10llabtainer3端口袋·100ml注射器·cs750冻存袋·3l培养袋·origencellconnectcc2·双功能注射器盖，红色·cryostorcs10，100ml袋·分配尖嘴，通风·重组il-28.0过程步骤描述：主要过程信息8.1第0天，cm1培养基制备8.1.1检查房间消毒、管线清除和材料。确认房间消毒。8.1.2确保完成预处理表格。8.1.3环境监测。在处理前，确保已开始进行预处理环境监控。8.1.4制备rpmi1640培养基。在bsc中，使用适当尺寸的移液器，从1000mlrpmi1640培养基中取出100.0ml，放入适当尺寸的带有“废弃物”标签的容器中。8.1.5在bsc中，将试剂添加至rpmi1640培养基瓶中。如下表所示，向rpmi1640培养基瓶中添加以下试剂。记录添加的体积。每瓶添加的量：热灭活的人ab血清(100.0ml)；glutamax(10.0ml)；硫酸庆大霉素50mg/ml(1.0ml)；2-巯基乙醇(1.0ml)。8.1.6混合培养基。给步骤8.1.5的rpmi1640培养基瓶加盖，旋转旋瓶子以确保试剂充分混合。8.1.7过滤rpmi培养基。通过1l0.22微米过滤器单元过滤步骤8.1.6的rpmi1640培养基。8.1.8给经过滤的培养基贴上标签。无菌盖住经过滤的培养基，标签上具有以下信息。8.1.9从bsc中取出不必要材料。从bsc中取出培养基试剂，将硫酸庆大霉素和hbss留在bsc中以用于8.2节中洗涤培养基的配制。8.1.10储存未使用的消耗品。将所有剩余的打开/解冻的培养基试剂转移到适当储存条件下或丢弃为废物。注：按照过程注释5.9，给培养基试剂分配适当有效期，贴上批次记录批号。8.1.11解冻il-2等分试样。解冻一个1.1ml的il-2等分试样(6×106iu/ml)(br71424)，直至所有的冰均熔化。记录il-2：批号和有效期(注：确保已粘贴il-2标签)。8.1.12将il-2储备溶液转移至培养基。在bsc中，将1.0mlil-2储备溶液转移至步骤8.1.8中制备的cm1第0天培养基瓶中。加入cm1第0天培养基1瓶和il-2(6×106iu/ml)1.0ml。8.1.13混合，重新贴标签。盖上盖子，旋转瓶子以混合含有il-2的培养基。重新标记为“完全cm1第0天培养基”，分配新的批号。8.1.14按照样品计划，取出样品培养基。使用适当尺寸的移液管取出20.0ml培养基，加到50ml锥形管中。8.1.15贴好标签，储存。给样品贴上样品计划库存标签，在2℃至8℃下储存“培养基保留”样品，直至根据样品计划提交登录进行检测。8.1.16签名，取样。确保完成lims样品计划表，取出样品。8.1.17准备“组织块”锥形管。在bsc中，将25.0ml的“完全cm1第0天培养基”(步骤8.1.13中制备)转移至50ml锥形管中。将试管贴上标签“组织小块”，记录批号。8.1.18将g-rex100mcs转移到bsc。无菌通过g-rex100mcs(w3013130)进入bsc。8.1.19准备g-rex100mcs。在bsc中，关上g-rex100mcs上的所有夹子，使排气过滤器夹子保持打开状态。8.1.20准备g-rex100mcs。通过鲁尔连接件将g-rex100mcs烧瓶的红色管线连接到中继泵流体转运装置(w3009497)的较大直径端。8.1.21准备baxa泵。将baxa泵置于bsc旁边。从bsc卸下中继泵流体转运装置的泵管部分，将其安装在中继泵中。8.1.22准备泵送培养基。在bsc内，从泵送液体分配系统(plds)(w3012720)卸下注射器并丢弃。注：确保不损害plds移液器的无菌性。8.1.23准备泵送培养基。通过鲁尔连接件将plds移液器连接到中继泵流体转运装置的较小直径端，将移液器尖端放置在“完全cm1第0天培养基”(步骤8.1.13中制备)中以进行抽吸。打开培养基和g-rex100mcs之间的所有夹子。8.1.24将完全cm1培养基泵入g-rex100mcs烧瓶中。将泵速设置为“高”和“9”，然后将所有完全cm1第0天培养基泵入g-rex100mcs烧瓶。一旦转移完所有培养基，清除管线，停止泵送。8.1.25从烧瓶上断开泵。确保除通气过滤器外，所有烧瓶上的夹子都已关闭。从红色培养基管线上拆下中继泵流体转运装置，在红色培养基管线上放一个红色盖子(w3012845)。8.1.26热封。从bsc上取下g-rex100mcs烧瓶，热封(按照过程注释5.12)住终端鲁尔接口附近红色管线上的红色盖子。8.1.27标记g-rex100mcs。给g-rex100mcs烧瓶贴上qa提供的过程中“第0天”标签。给样品贴上以下标签“第0天”。8.1.28监控培养箱。保温箱参数：温度led显示屏：37.0±2.0℃；co2百分比：5.0±1.5％co2。8.1.29加热培养基。将步骤8.1.17制备的标有“组织碎片”的50ml锥形管和步骤8.1.27制备的g-rex100mcs放入培养箱中，加热≥30分钟。下面记录加热时间。如果预热时间≥30分钟(是/否)，则进行记录。[组织碎片锥形管或grex100mcs]8.1.30检查8.1节。8.2第0天，制备肿瘤洗涤培养基8.2.1将庆大霉素添加至hbss中。在bsc中，将5.0ml庆大霉素(w3009832或w3012735)添加至1×500mlhbss培养基(w3013128)瓶中。记录体积。每瓶添加：hbss(500.0ml)；硫酸庆大霉素50mg/ml(5.0ml)。8.2.2盖上hbss瓶，旋紧。盖上步骤8.2.1制备的含有庆大霉素的hbss，旋紧瓶子，确保彻底混合试剂。8.2.3过滤溶液。通过1l0.22微米过滤器单元(w1218810)过滤在步骤8.2.1中制备的含庆大霉素的hbss。8.2.4无菌地盖上过滤后的培养基，贴上标签。无菌地盖上过滤后的培养基，标记以下信息。进入8.3节。8.2.5检查8.2节。8.3第0天，肿瘤处理8.3.1获得肿瘤。从qar获得肿瘤标本，立即转移到2℃至8℃套件中进行处理。确保将所有必要信息记录在肿瘤运输批记录。8.3.2记录肿瘤信息。8.3.3贴上肿瘤标签。贴上肿瘤附件。qar发布标签如下。贴上的肿瘤运输批次记录为#5。8.3.4将用于肿瘤解剖的必要材料放入bsc。8.3.5打开材料。打开bsc内部的所有材料，确保不影响材料的无菌性。8.3.6标记材料。标记3个50ml锥形管：第一个标记为“镊子”，第二个标记为“解剖刀”，第三个标记为“新鲜肿瘤洗涤培养基”。将5×100mm培养皿标记为“洗涤1”、“洗涤2”，“洗涤3”、“保持”和“不良”。将1个6孔板标记为“良好中间碎片”。8.3.7等分肿瘤洗涤培养基。使用适当尺寸的移液器，将步骤8.2.4中制备的5.0ml的“肿瘤洗涤培养基”转移至良好中间肿瘤碎片的一个6孔板的每个孔中(总计30.0ml)。注：在进行肿瘤洗涤和解剖过程中，视需要将镊子和解剖刀分别存放在各自的肿瘤洗涤培养基锥形瓶中。8.3.8等分肿瘤洗涤培养基。使用适当尺寸的移液器，将步骤8.2.4中制备的50.0ml“肿瘤洗涤培养基”转移至“洗涤1”、“洗涤2”，“洗涤3”和“保持”的每个100mm培养皿中(总共200.0ml)。8.3.9等分肿瘤洗涤培养基。使用适当尺寸的移液器，将步骤8.2.4中制备的20.0ml“肿瘤洗涤培养基”转移至每个50ml锥形瓶中(总共60.0ml)。8.3.10准备盖子用于肿瘤块。从2个6孔板上无菌取下盖子。将盖子用于所选肿瘤块。注：在整个肿瘤处理过程中，不要跨过开放的组织培养板和盖子。8.3.11将肿瘤转移到bsc中。将肿瘤无菌转移到bsc中。记录处理开始时间。8.3.12肿瘤洗涤1：使用8”镊子(w3009771)从标本瓶中取出肿瘤，转移至步骤8.3.8准备的“洗涤1”皿中。注：将溶液保留在样本瓶中。8.3.13肿瘤洗涤1。用镊子轻轻洗涤肿瘤，通过下方计时器使标本放置≥3分钟。记录洗涤时间(某分：某秒)。8.3.14按照样品计划，准备生物负载样品。根据样品计划，将20.0ml(或可用体积)溶液从肿瘤标本瓶转移至50ml锥形瓶中。8.3.15贴好标签，储存样品。贴上样品计划库存标签，储存在2℃至8℃下收集的生物负载样品，直至提交进行检测。8.3.16签名，取样。确保完成lims样品计划表，取出样品。8.3.17肿瘤洗涤2。使用一套新的镊子，将肿瘤从“洗涤1”皿中取出，转移至8.3.8中准备的“洗涤2”皿中。8.3.18肿瘤洗涤2。用镊子轻轻搅动≥3分钟以洗涤肿瘤标本，然后静置。记录时间。8.3.19为所需肿瘤块准备肿瘤洗涤培养基液滴。使用移液管，将步骤8.3.9准备的锥形瓶的4滴单独的肿瘤洗涤培养基滴入6孔板的上翻盖(2个盖)上的6个圆圈中的每个圆圈中。将一个额外的液滴放置在两个圆圈上，总计50滴。8.3.20肿瘤洗涤3。使用镊子，将肿瘤从“洗涤2”皿中取出，转移至步骤8.3.8准备的“洗涤3”皿中。8.3.21肿瘤洗涤3。用镊子轻轻搅动洗涤肿瘤标本，静置≥3分钟。记录时间。8.3.22准备肿瘤解剖皿。将尺子放在150mm培养皿盖下方。8.3.23将肿瘤转移到解剖皿中。使用镊子，将肿瘤标本无菌转移至150mm解剖皿盖上。8.3.24测量肿瘤。从头到尾排列所有肿瘤样品，记录大概的总长度和碎片数。给每个肿瘤标本拍摄清晰图片。8.3.25评估肿瘤。评估肿瘤坏死/脂肪组织。评估肿瘤坏死组织/脂肪组织。评估是否发现>30％的整个肿瘤区域是坏死组织和/或脂肪组织；如果是，联系区域管理确保肿瘤大小合适，然后进行步骤8.3.26。评估是否发现<30％的整个肿瘤区域是坏死组织或脂肪组织；如果是，继续步骤8.3.27，不进行清理解剖。8.3.26如果适用：清理解剖。如果肿瘤较大并且观察到>30％的组织外部为坏死/脂肪，则通过解剖刀和/或镊子的组合，通过切除坏死/脂肪组织进行“清理解剖”，同时保留肿瘤的内部结构。注：为了维持肿瘤的内部结构，仅使用垂直切割压力。不用解剖刀切锯动作。注：将脂肪组织、坏死组织和外来组织放在“不良”培养皿中。8.3.27解剖肿瘤。使用解剖刀和/或镊子的组合，将肿瘤样品切成均匀的适当尺寸的碎片(最多6个中间碎片)。注：为了维持肿瘤的内部结构，只能使用垂直切割压力。不用解剖刀切锯动作。注：确保将未解剖的中间碎片完全浸没在“肿瘤洗涤培养基”(步骤8.2.4中制备)中。8.3.28转移中间肿瘤碎片。将步骤8.3.8的每个中间碎片转移到“保持”皿中。8.3.29解剖肿瘤碎片一次处理一个中间碎片，将解剖皿中的肿瘤中间碎片切成约3mm×3mm×3mm的小块，以使每块上的出血组织、坏死组织和/或脂肪组织的量最小。注：为了维持肿瘤的内部结构，仅使用垂直切割压力。不用解剖刀切锯动作。8.3.30选择肿瘤块。选择多达八(8)个无出血组织、坏死组织和/或脂肪组织的肿瘤块。使用标尺作为参考。继续解剖，直至获得8个良好碎片段，或解剖整个中间碎片。将每个选定的片段转移至步骤8.3.19制备的“肿瘤洗涤培养基”滴液之一中。8.3.31储存中间碎片以防止干燥。从中间碎片中选择至多八(8)个小块后，将中间碎片的残余物放入步骤8.3.7中制备的“良好中间碎片”6孔板的新的单个孔中。注：将脂肪组织或坏死组织置于“不良”皿中(步骤8.3.6制备)。8.3.32重复中间碎片解剖。进行下一个中间碎片，重复步骤8.3.29至步骤8.3.31，直至所有中间碎片都被处理，视需要获得新鲜解剖刀和镊子。8.3.33确定收集的块的数量。如果所需组织有剩余，则从“良好中间碎片”6孔板中选择另外的良好肿瘤块，以将液滴填充为最多50个。记录产生的解剖小块总数。注：在整个解剖过程中，必要时确保用清洗培养基保持肿瘤中间碎片的水分。记录收集的解剖块总数。8.3.34从培养箱中取出锥形管。从培养箱中取出“组织小块”50ml锥形管。在步骤8.1.29中记录时间。确保锥形管加热≥30分钟。8.3.35准备锥形管。将50ml锥形管“组织小块”放到bsc中，确保不损害开放处理表面的无菌性。8.3.36将肿瘤碎片转移到50ml锥形管中。使用移液器、解剖刀、镊子或组合，将选定的50个最佳肿瘤碎片从合适的培养皿盖转移至“组织小块”50ml锥形管。注：如果肿瘤块在转移过程中掉落且所需组织保留，则应添加来自良好肿瘤中间碎片孔的其他小块。记录小块数量。8.3.37为g-rex100mcs准备bsc。从bsc取出容器接种的所有非必需物品，保留“良好组织”板(如果它们包含过量的碎片)。8.3.38从培养箱中取出g-rex100mcs。从培养箱中取出含有培养基的g-rex100mcs。完成步骤8.1.29。8.3.39将烧瓶放入bsc。无菌通过g-rex100mcs烧瓶进入bsc。注：转移烧瓶时，不要握住容器的盖子或底部。通过握住容器的侧面来转移容器。注：处理g-rex烧瓶时仅使用ipawipes。8.3.40将肿瘤碎片加到g-rex100mcs烧瓶中。在bsc中，举起g-rex100mcs烧瓶盖子，确保内部管线保持无菌状态。旋转装有肿瘤块的锥形管以使肿瘤块悬浮，将内容物快速倒入g-rex100mcs烧瓶。8.3.41使肿瘤块均匀分布。确保肿瘤块均匀地分布在烧瓶的膜上。视需要，轻轻地前后摇动烧瓶以均匀分布肿瘤块。8.3.42记录容器中肿瘤碎片的总数。记录容器的底部膜上的肿瘤碎片的数量和观察到漂浮在容器中的肿瘤碎片的数量。注：如果接种的碎片数量不等于步骤8.3.36h收集的数量，联系区域管理和第10.0节中的文档。8.3.43孵育g-rex烧瓶。在以下参数孵育g-rex100mcs：孵育g-rex烧瓶：温度led显示屏：37.0℃±2.0℃；co2百分比：5.0％±1.5％co2。8.3.44计算孵育窗口。进行计算以确定在第11天取出g-rex100mcs培养箱的适当时间。计算：孵育时间；下限＝孵育时间+252小时；上限＝孵育时间+276小时。8.3.45环境监测。处理后，验证bsc和人员监控。8.3.46丢弃材料。将剩余的未加热的培养基储存在2℃至8℃，贴好标签。处理完成后，弃去任何剩余的加热过的培养基，解冻il-2的等分试样。8.3.47提交样品。确保将所有第0天的样品提交给登录并以lims转移。8.3.48检查8.3节。8.4第11天-培养基制备8.4.1检查房间、清洁、管线清除和材料。确认房间消毒、管线清除以及材料在有效期内。8.4.2预处理表格。设备列表：bsc；天平；sebra封管机；gatherextm培养基取出和细胞恢复设备；确保将提供的qa标示放在适当的bsc上；确保提供的qa标示批号和患者id与批次记录中的批号和患者id匹配。8.4.3监控培养箱。监控培养箱。培养箱参数：温度led显示屏：37.0℃±2.0℃；co2百分比：5.0±1.5％co2。注：8.4节可与8.5节同时运行。8.4.4加热培养基。将3x1000mlrpmi1640培养基(w3013112)瓶和3x1000mlaim-v(w3009501)瓶在培养箱中加热≥30分钟。记录时间。培养基：rpmi1640和aim-v。注：在室温下放置另外1x1000ml的aim-v培养基(w3009501)瓶，以用于步骤8.5.34。将瓶子标上“仅用于细胞计数稀释”和批次记录批号。8.4.5环境监测。进行处理前，确保按照sop-00344进行预处理环境监控。8.4.6从培养箱中取出rpmi1640培养基。当到达时间时，取出rpmi1640培养基。在步骤8.4.4中记录结束孵育时间。确保将培养基加热≥30分钟。8.4.7制备rpmi1640培养基。在bsc中，从三个预热的1000mlrpmi1640培养基瓶中各取100.0ml，放入尺寸合适的标有“废弃物”的容器中。8.4.8在bsc中，将试剂添加至rpmi1640培养基瓶。在bsc中，将以下试剂添加至三个rpmi1640培养基瓶中的每一个中，记录添加至每个瓶中的体积。gemcell人血清，热灭活的ab型(100.0ml)，glutamax(10.0ml)，硫酸庆大霉素，50mg/ml(1.0ml)，2-巯基乙醇(1.0ml)。8.4.9过滤培养基。盖上步骤8.4.8的瓶子，旋转以确保试剂充分混合。通过单独的1l0.22微米过滤器过滤每瓶培养基。8.4.10给过滤培养基贴上标签。无菌地盖上过滤后的培养基，给每个瓶子贴上标签“cm1第11天培养基”。8.4.11解冻il-2等分试样。解冻3×1.1mlil-2的等分试样(6×106iu/ml)(br71424)，直至所有冰解冻为止。记录il-2批号和有效期。注：确保已贴上il-2标签。8.4.12从培养箱中取出aim-v培养基。从培养箱中取出三瓶aim-v培养基。记录步骤8.4.4中的孵育结束时间。确保培养基已加热≥30分钟。8.4.13将il-2添加到aim-v。在bsc中，使用微量移液器，将3.0ml解冻的il-2加入一个1l瓶的预热aim-v培养基中。加入il-2后，用培养基冲洗微量移液器吸头。每个等分试样均使用新的无菌微量移液器吸头。记录添加的总体积。给瓶子贴上标签“含aim-v的il-2”。8.4.14转移材料。无菌地转移10llabtainer袋和中继泵转运装置到bsc中。8.4.15准备10llabtainer培养基袋。关闭10llabtainer袋上的所有管线。通过鲁尔锁连接将中继泵转运装置的较大直径的管端连接到10llabtainer袋的中间母端口。8.4.16准备baxa泵。将baxa泵安装在bsc旁边。将转运装置管线通过位于bsc外部的baxa泵。将baxa泵设置为“高”和“9”。8.4.17准备10llabtainer培养基袋。在bsc中，从泵送液体分配系统(plds)中取出注射器并丢弃。注：确保不损害plds移液器的无菌性。8.4.18准备10llabtainer培养基袋。通过鲁尔连接件将plds移液管连接到中继泵流体转运装置的较小直径端，将移液管尖端放入含有il-2的aim-v培养基瓶(在步骤8.4.13中制备)中进行抽吸。打开培养基瓶和10llabtainer之间的所有夹子。8.4.19将培养基泵入10llabtainer。在bsc中，使用plds，将步骤8.4.13制备的包含il-2的预热aim-v培养基以及另外两个aim-v瓶转移至10llabtainer袋中。添加3瓶步骤8.4.10的经过滤的cm1第11天培养基。添加最后一瓶后，清除连接袋子的管线。注：在添加每瓶培养基之间停止泵。8.4.20取下labtainer袋的plds。从转运装置上取下plds，在bsc中管线的鲁尔接口上盖上一个红色的盖子。8.4.21混合培养基。轻轻揉按袋子以使其混合。8.4.22给培养基贴上标签。在bsc中，在培养基袋上贴上以下信息。到期日期为制备日期起的24小时。8.4.23按照样品计划取样培养基。在bsc中，将60ml注射器连接到步骤8.4.22制备的“完全cm2第11天培养基”袋的可用母端口。取出20.0ml培养基，放入50ml锥形管中。在“完全cm2第11天培养基”袋的母端口上放一个红色盖子。8.4.24贴好标签，储存样品。贴上样品计划库存标签，将培养基保留样品储存在2℃至8℃下，直至提交登录进行检测。8.4.25签名，取样。确保完成lims样品计划表，取出样品。8.4.26密封转运装置管线。在bsc外，在靠近红色盖子处热封(按照操作说明5.12)转运装置管线上的红色盖子。将转运装置保留在袋子上。8.4.27准备细胞计数稀释管。在bsc中，向4个15ml锥形管中添加4.5ml标记有“用于细胞计数稀释”和批号的aim-v培养基。用批号和管编号(1至4)标记管。将4个冻存管标上“饲养细胞”和管编号(1至4)。将管保存在bsc，用于步骤8.5.30。8.4.28将试剂从bsc转移到2℃至8℃。将所有剩余的2-巯基乙醇、glutamax和人血清从bsc转移至2℃至8℃。确保所有试剂均贴有记录批号和按照过程注释5.9的适当有效期。8.4.29准备1l转运包。在bsc外，将1l转运包连接(按照过程注释5.11)到步骤8.4.22制备的“完全cm2第11天培养基”袋上的转运装置上。转运包标上“饲养细胞cm2培养基”和批号。8.4.30准备1l转运包。在距离袋子几英寸的1l转运包管线的管线上做一个标记。将空的转运包放在天平上，使管线在天平上达到标记的点。8.4.31去皮称重。将秤去皮，将空的转运包留在秤上。8.4.32准备饲养细胞转运包。将baxa泵设置为“中”和“4”。将步骤8.4.22中制备的500.0±5.0ml的“完全cm2第11天”培养基泵入“细胞cm2培养基”转运包中。称重，记录添加至转运包中的完全cm2培养基的体积。8.4.33热封管线。一旦填充，根据过程注释5.12热封管线。将带有转运装置的cm2第11天培养基袋与饲养细胞培养基转运包分开，保持连接至1l转运包。8.4.34如果适用：孵育饲养细胞培养基转运包。如果适用，将“完全cm2第11天培养基”放置在培养箱中，直至用于步骤8.6.6。8.4.35孵育完全cm2第11天培养基。将步骤8.4.22制备的“完全cm2第11天培养基”放入培养箱，直至用于步骤8.7.2。8.4.36检查8.4节。8.5第11天-til收获8.5.1预处理表格。监控培养箱。培养箱参数：温度led显示：37.0℃±2.0℃；co2百分比：5.0±1.5％co2。注：第8.5节可与第8.4节和第8.6节同时运行。8.5.2从培养箱中取出g-rex100mcs。从培养箱中取出g-rex100mcs之前，进行以下检查以确保符合培养参数。下限来自步骤8.3.44b。上限来自步骤8.3.44c。记录从培养箱取出的时间。确定：是否8.3.44b≤从培养箱中取出的时间<步骤8.3.44c？*如果否，联系区域管理。小心地从培养箱中取出g-rex100mcs，确保除大型过滤器管线外，所有夹子均已关闭。记录处理开始时间。8.5.3准备300ml转运包。将300ml转运包标记为“til悬液”。8.5.4准备300ml转运包。无菌连接(按照过程注释5.11)重力血液过滤器的til悬液转移(单线)。例如参见图129。8.5.5准备300ml转运包。将300ml转运包放在天平上，记录干重。8.5.6准备1l转运包。1l转运包标记为“上清液”和批号。8.5.7将转运包连接到g-rex100mcs。将来自g-rex100mcs的红色培养基取出管线无菌连接(按照过程注释5.11)到“上清液”转运包。将g-rex100mcs的透明细胞取出管线无菌连接到与“til悬液”转运包相连的血液过滤器顶部的两个加标管线(spikeline)之一。例如参见图130。8.5.8gatherex设置。将g-rex100mcs放置在gatherex的左侧，将“上清液”和“til悬液”转运包放置在gatherex的右侧。8.5.9gatherex设置。将红色培养基取出管线从grex100mcs安装到gatherex上的顶部夹子(标有红色线)和导管。将透明收获管线从g-rex100mcs安装到gatherex上的底部夹子(标有蓝色线)和导管。8.5.10gatherex设置。将来自gatherex的气体管线连接到g-rex100mcs烧瓶的无菌过滤器上。注：从g-rex100mcs烧瓶中取出上清液之前，确保关闭细胞取出管线上的所有夹子。8.5.11减少g-rex100mcs体积。将约900ml培养上清液从g-rex100mcs转移至1l转运包中。目视检查g-rex100mcs烧瓶，以确保烧瓶处于水平状态且培养基已减少至抽吸汲取管的末端。注：如果gatherex过早停止，则可通过再次按下向右箭头按钮来重启。8.5.12准备烧瓶，收获til。在取出上清液之后，关闭至红色管线的所有夹子。8.5.13开始收获til。记录til收获的开始时间。8.5.14开始收获til。用力敲击烧瓶并旋转培养基以释放细胞。检查烧瓶以确保所有细胞均已分离。注：如果细胞未分离，联系区域管理。8.5.15开始收获til。将烧瓶向远离收集管倾斜，使肿瘤块沿边缘沉降。向收集管缓慢倾斜烧瓶，使碎片留在烧瓶的另一侧。注：如果细胞收集吸管不在壁和底部膜的交界处，以450度倾斜的角度敲击烧瓶通常足以正确放置吸管。8.5.16收获til。释放所有通往til悬液转运包的夹子。8.5.17收获til。使用gatherex，将细胞悬液通过血液过滤器转移至300ml转运包中。注：保持倾斜的边缘，直至收集所有细胞和培养基。8.5.18收获til。检查膜上是否有贴壁细胞。8.5.19冲洗烧瓶膜。冲洗g-rex100mcs的底部。用洗涤培养基覆盖约1/4的气体交换膜。注：如果肿瘤块阻塞收集管线，按下细胞收集管线上的“x”以暂停收集。按下gatherex的“释放夹子”按钮，拿起转运包，用逐渐增加的压力轻轻挤压，直至碎片被取出。请勿过分挤压袋子，否则可能会导致管线或袋子破裂。清除障碍物后，继续收集。8.5.20关闭g-rex100mcs的夹子。确保所有夹子均已关闭。8.5.21热封。在尽可能靠近连接处将til悬液转运包热封(按照过程注释5.12)，以使总管长度保持大致相同。8.5.22热封。按照过程注释5.12热封“上清液”转运包。保持足够的连接线。8.5.23计算til悬液体积。记录til悬液转运包的重量，计算细胞悬液的体积。8.5.24准备用于取样的上清液转运包。将4英寸血浆转运装置连接(按照过程注释5.11)到300ml“til悬液”转运包上，将鲁尔连接件保持在4英寸血浆转运装置上，然后转移至bsc中。8.5.25准备用于取样的上清液转运包。将4英寸血浆转运装置连接(按照过程注释5.11)到300ml“til悬液”转运包上，将鲁尔连接件保持在4英寸血浆转运装置上，然后转移至bsc中。8.5.26抽取bac-t样品。在bsc中，使用适当尺寸的注射器，从1l“上清液”转运包中吸取约20.0ml上清液，然后加到标有“bac-t”的无菌50ml锥形管中。保存在bsc，用于步骤8.5.27。8.5.27按照样品计划接种bact。使用适当尺寸的注射器，从步骤8.5.26中制备的50ml锥形标记的bact中取出1.0ml样品，接种厌氧瓶。使用瓶子标签上留下的空白，记录瓶子的接种时间。好氧瓶重复以上操作。注：此步骤可不按顺序进行。8.5.28贴好标签，储存样品。贴上样品计划库存标签，在室温下保存bac-t样品，避光，直至根据样品计划提交登录进行检测。注：不要让标签挡住瓶子上的条形码。8.5.29签名，取样。确保完成lims样品计划表，取出样品。8.5.30对样品进行til细胞计数。用瓶号(1至4)标记4个冻存管。使用单独的3ml注射器，使用鲁尔连接件从til悬液转运包中提取4x1.0ml细胞计数样品，放置在各自的冻存管中。8.5.31关闭鲁尔接头。在行上放一个红色盖子(w3012845)。8.5.32孵育til。直至需要时将til转运包放在培养箱中。8.5.33进行细胞计数。使用nc-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。对未稀释的初始细胞进行计数。8.5.34记录细胞计数的样品体积。注：如果无需稀释，则“样品[μl]”＝200，“稀释[μl]”＝0。8.5.35确定乘法因数(multiplicationfactor)。总细胞计数样品体积：8.5.34a+8.5.34b。乘法因数c÷8.5.34a。8.5.36选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μl]”＝200，“稀释[μl]”＝0。8.5.37记录文件名、活力和nucleoview的细胞计数。8.5.38确定平均活细胞浓度和进行计数细胞的活力。活力：(8.5.37a+8.5.37b)÷2。活细胞浓度：(8.5.37c+8.5.37d)÷2。8.5.39确定计数的上限和下限。下限：8.5.38f×0.9。上限：8.5.38f×1.1。8.5.40两个计数均在可接受范围内吗？下限：8.5.37c+8.5.37d≥8.5.39g。上限：8.5.37c+8.5.37d≤8.5.39h。*如果任一结果为“否”，则在步骤8.5.41至步骤8.5.48进行第二组计数*。8.5.41如果适用：进行细胞计数。利用nc-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。注：根据预期细胞浓度调整稀释度。8.5.42如果适用：记录细胞计数的样品体积。8.5.43如果适用：确定乘法因数。总细胞计数样品体积：8.5.42a+8.5.42b。乘法因数c÷8.5.42ad8.5.44如果适用：选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μl]”＝200，“稀释[μl]”＝0。8.5.45如果适用：从nucleoview记录细胞计数8.5.46如果适用：确定平均活细胞浓度和进行计数细胞的活力。确定平均活细胞浓度。8.5.47如果适用：确定计数的上限和下限。下限：8.5.46f×0.9。上限：8.5.46f×1.1。8.5.48如果适用：计数是否在可接受范围内？下限：8.5.45c+8.5.45d≥8.5.47g。上限：8.5.45c+8.5.45d≤8.5.47h。注：如果结果为“否”，进行步骤8.5.49，确定平均值。8.5.49如果适用：由进行的所有4个计数来确定平均活细胞浓度。平均活细胞浓度：(a+b+c+d)÷4＝平均值8.5.50调整til悬液体积。计算取出细胞计数样品后til悬液的调整体积。步骤8.5.23c(a)的til细胞总体积。取出的细胞计数样品的体积(4.0ml)(b)。调整的til细胞总体积c＝a-b。8.5.51计算活til细胞总数。平均活细胞浓度*：8.5.38f*或8.5.46f*或*8.5.49e*；总体积：8.5.50；活细胞总数：c＝a×b。*圈出步骤参考用于确定活细胞浓度。注：如果“活til细胞总数”少于5×106个细胞，联系“区域管理”，进行步骤8.7.1。如果“活til细胞总数”>5×106，进行步骤8.5.52。8.5.52流式细胞仪计算。如果步骤8.5.51c的活til细胞总数≥4.0×107，计算获得流式细胞仪样品有1.0×107个细胞的体积。*如果细胞数<4.0×107，则n/a表中的其余字段。进行步骤8.7.1。流式细胞术所需的活细胞总数：1.0×107个细胞。流式细胞术所需的细胞体积：8.5.51的活细胞浓度/1.0×107细胞a。8.5.53如果适用：从培养箱中取出til。从培养箱中取出til悬液并记录步骤8.5.32中的最终培养时间。8.5.54如果适用：根据“样品计划”取出流式细胞仪样品。使用适当尺寸的注射器，从til悬液转运包中取出样品进行表型分析的计算体积(8.5.52c)，放入50ml锥形管中。8.5.55如果适用：标记，储存流式细胞仪样品。贴上样品计划库存标签，在2℃至8℃下储存流式细胞术样品，直至根据样品计划提交登录进行检测。8.5.56签名，取样。确保完成lims样品计划表，取出样品。8.5.57如果适用：重新计算的活细胞总数和体积流量。计算取出下面的细胞计数样品后的剩余活细胞总数和剩余体积。8.5.58如果适用：计算til体积。计算等于2.0×108个活细胞的til悬液体积。8.5.59如果适用：计算要取出的til体积，计算要取出的过量til体积。8.5.60如果适用：取出过量til。在bsc中，使用适当尺寸的注射器，从til悬液转运包取出计算体积(步骤8.5.59c)。注：请勿多次使用注射器。如果适用，使用多个注射器。放在适当尺寸的无菌容器中，贴上日期和批号标签。在“til悬液”转运包管线上放一个红色盖子。8.5.61如果适用：将til放在培养箱中。将til悬液转运包放在培养箱中，直至需要。记录时间。8.5.62如果适用：计算。计算取出的过量til的总数。步骤8.5.51a步骤8.5.59c取出的til体积。计算取出的过量til的总数8.5.63如果适用：计算。计算要添加到步骤8.5.62c的过量til细胞中的cs-10培养基的量。冷冻的目标细胞浓度为1.0×108个细胞/ml。8.5.64如果适用：离心过量til。离心过量til细胞悬液。速度：350×g。时间：10:00分钟。温度：环境。制动：全速(9)。加速：全速(9)。8.5.65如果适用：观察锥形管。记录观察结果：是否观察到沉淀？上清液是否清澈？*注：如果答案为否，联系区域管理。8.5.66如果适用：添加cs-10。在bsc中，无菌吸出上清液。轻轻拍打试管底部，将细胞重悬在剩余液体中。8.5.67如果适用：添加cs10。缓慢添加步骤8.5.63c中计算的cs10体积。8.5.68如果适用：标记小管。用qa提供标签的标记管。贴上样品标签。8.5.69如果适用：填充小管。将1.0ml细胞悬液等分到适当尺寸的冻存管中。注：填充不超过10个小管的过量til。8.5.70如果适用：填充小管。根据sop-00242，将剩余体积等分到适当尺寸的冻存管中。如果体积≤0.5ml，则将cs10加到小管中，直至体积为0.5ml。8.5.71如果适用：填充小管。用1.0mlcs10填充一个小管，标记为“空白”。8.5.72如果适用：记录已填充小管数量。记录以下已填充小管数量，不包括空白。8.5.73如果适用：环境监测。处理后，对bsc和人员监控进行验证。样品的til冷冻保存8.5.74如果适用：计算冷冻保存的体积。计算获得用于冷冻保存的1×107个细胞所需的细胞体积。8.5.75如果适用：取出样品进行冷冻保存。在bsc中，使用适当尺寸的注射器，从“til悬液”转运包中取出计算的体积(步骤8.5.74c)。放入适当尺寸的锥形管中，贴上标记“冷冻保存样品1×107个细胞”、日期和批号。在til悬液转运包上放一个红色盖子(w3012845)。8.5.76如果适用：将til放在培养箱中。将til悬液转运包放在培养箱中，直至需要。8.5.77如果适用：冷冻保存样品。根据以下参数将“冷冻保存样品1×107个细胞”离心：速度：350×g，时间：10：00分钟，温度：环境，制动：全速(9)；加速：全速(9)。注：确保离心机的速度和时间设置的单位适当。8.5.78如果适用：观察锥形管。记录观察结果：是否观察到沉淀？上清液是否清澈？*注：如果答案为否，联系区域管理。8.5.79如果适用：添加cs-10。在bsc中，无菌吸出上清液。轻轻拍打试管底部，将细胞重悬在剩余液体中。8.5.80如果适用：添加cs-10。缓慢加入0.5mlcs10。记录添加的体积。8.5.81如果适用：标记小管。用qa签发标签标记小管。8.5.82如果适用：填充小管。将重悬体积等分到标记的冻存管中。8.5.83如果适用：填充空白。用0.5mlcs10填充另一个小管，标记为“空白”。8.5.84如果适用：记录填充小管数量，不包括“空白”。冷冻保存样品小管装入约0.5ml。8.5.85如果适用：环境监测。处理后，对bsc和人员监控进行验证。8.5.86检查8.5节8.6第11天-饲养细胞8.6.1获得饲养细胞。从ln2冷冻机中获得3袋具有至少两个不同批号的饲养细胞。将细胞保存在干冰上，直至准备解冻。注：8.6节可与8.5节同时进行。8.6.2获得饲养细胞。记录饲养细胞信息。确认获得了至少两个不同批次的饲养细胞。8.6.3准备水浴或低温浴。准备用于饲养细胞解冻的水浴或低温浴。8.6.4根据批号将饲养细胞袋放入单个拉链封口袋中，37.0℃±2.0℃水浴或低温浴约3至5分钟来解冻，或直至冰刚刚消失。用计时器记录解冻时间。8.6.5饲养细胞线束准备。将4s-4m60(按照过程注释5.11)连接到cc2cellconnect(w3012820)，在g处，用4s-4m60歧管的4个尖嘴端代替cellconnect装置(b)的单个尖嘴。将h连接到g(例如参见图131)。8.6.6如果适用：从培养箱中取出培养基。从培养箱中取出在步骤8.4.34准备的饲养细胞cm2培养基转运包。8.6.7附加培养基转运包。将“饲养细胞cm2培养基”转运包(按照过程注释5.11)连接到cc2鲁尔接口上。注：通过无针注射口将袋子连接到线束的侧面。8.6.8转移线束。将包含完全cm2第11天培养基的组件转移至bsc中。8.6.9合并解冻的饲养细胞。在bsc内，将10ml的空气吸入100ml注射器中。用它来替换cc2上的60ml注射器。8.6.10合并解冻的饲养细胞在取下盖子之前，先用酒精棉片擦拭饲养细胞袋上的每个端口。使用cc2的三个尖嘴刺入三个饲养细胞袋。注：保持恒定压力，同时沿一个方向旋转尖嘴。确保不要刺穿端口的侧面。8.6.11合并解冻的饲养细胞。打开旋塞阀，以便打开从饲养细胞袋中取出的管线，关闭通往无针注射口的管线。8.6.12合并解冻的饲养细胞。将饲养细胞袋的内容物吸进注射器。立刻排干全部三个袋子。排干饲养细胞袋后，在保持注射器压力的同时，夹住饲养细胞袋上的管线。8.6.13记录饲养细胞体积。不要将下面的注射器从线束拆掉。记录注射器中饲养细胞的总体积。8.6.14将饲养细胞添加至转运包。转动旋塞阀，以关闭通往饲养细胞袋的管线，打开通往培养基转运包的管线。确保未松开到培养基转运包的管线。8.6.15将注射器中的饲养细胞加到“饲养细胞cm2培养基”转运包中。夹住包含饲养细胞的转运包的管线，将注射器留在线束上。8.6.16混合合并的饲养细胞。揉按袋子以混合转运包中合并的饲养细胞。8.6.17标记转运包。将袋子标为“饲养细胞悬液”。8.6.18计算转运包中的总体积，计算饲养细胞悬液的总体积。8.6.19取出细胞计数样品。对每个样品使用单独的3ml注射器，使用无针注射口从饲养细胞悬液转运包中提取4×1.0ml细胞计数样品。将每个样品等分到步骤8.4.27标记的冻存管中。注：在每次细胞计数取样之间，用无菌酒精棉片(w3009488)擦拭不需要的注射端口，混合饲养细胞悬液。8.6.20进行细胞计数。利用nc-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。通过将0.5ml细胞悬液添加至标有批号和“用于细胞计数稀释”的4.5mlaim-v培养基中，稀释细胞计数样品。这将产生1:10的稀释度。必要时进行调整。8.6.21记录细胞计数的样品体积。8.6.22确定乘法因数。8.6.23选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。8.6.24记录文件名、活力和nucleoview的细胞计数。8.6.25确定平均活细胞浓度和进行计数细胞的活力。参数公式结果活力(8.6.24a+8.6.24b)÷2e.％活细胞浓度(8.6.24c+8.6.24d)÷2f.个细胞/ml8.6.26确定计数的上限和下限。参数公式结果下限8.6.25f×0.9g.个细胞/ml上限8.6.25f×1.1h.个细胞/ml8.6.27两个计数均在可接受范围内吗？参数公式结果(是/否)下限8.6.24c+8.6.24d≥8.6.26g上限8.6.24c+8.6.24d≤8.6.26h注：如果任一结果为“否”，则在步骤8.6.28至步骤8.6.35进行第二组计数8.6.28如果适用：进行细胞计数。按照sop-00314和过程注释5.14，利用nc-200进行细胞计数和计算。注：稀释可根据预期细胞浓度进行调整。8.6.29如果适用：记录细胞计数的样品体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μl]”＝200，“稀释[μl]”＝0。8.6.30如果适用：确定乘法因数。8.6.31选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μl]”＝200，“稀释[μl]”＝0。8.6.32如果适用：从nucleoview记录细胞计数8.6.33如果适用：确定平均活细胞浓度和进行计数细胞的活力。参数公式结果活力(8.6.32a+8.6.32b)÷2e.％活细胞浓度(8.6.32c+8.6.32d)÷2f.个细胞/ml8.6.34如果适用：确定计数的上限和下限。参数公式结果下限8.6.33f×0.9g.个细胞/ml上限8.6.33f×1.1h.个细胞/ml8.6.35如果适用：计数是否在可接受范围内？参数公式结果(是/否)下限8.6.32c+8.6.32d≥8.6.34g上限8.6.32c+8.6.32d≤8.6.34h注：如果任一结果为“否”，则进行步骤8.6.36，找到总的平均活细胞浓度，进行计算。8.6.36如果适用：由进行的所有4个计数确定平均活细胞浓度。8.6.37调整饲养细胞悬液的体积。取出细胞计数样品后，计算调整后的饲养细胞悬液体积。由步骤8.6.18c的总饲养细胞体积减去4.0ml。8.6.38计算活饲养细胞的总数。如果活细胞总数小于5×109，继续步骤8.6.39。如果活细胞总数≥5×109，则进行步骤8.5.70。8.6.39如果适用：获得另外的饲养细胞。从ln2冰箱获得另外一袋饲养细胞。将细胞放在干冰上，直至准备解冻。8.6.40如果适用：获得另外的饲养细胞。记录饲养细胞信息。8.6.41如果适用：解冻另外的饲养细胞。将第4个饲养细胞袋放入拉链封口袋中，在37.0±2.0℃水浴或cytotherm中解冻约3-5分钟，或直至冰刚刚消失。记录解冻时间。8.6.42如果适用：合并另外的饲养细胞。在bsc中，将10ml空气吸入一个新的100ml注射器中。用它来更换线束上的注射器。8.6.43如果适用：合并另外的饲养细胞，然后用酒精棉片擦拭饲养细胞袋的端口，然后再取下盖子。使用在步骤8.6.7中准备的线束的剩余尖嘴之一刺入饲养细胞袋。注：保持恒定压力，同时沿一个方向旋转尖嘴。确保不要刺穿端口的侧面。8.6.44如果适用：合并另外的饲养细胞。打开旋塞阀，从而打开饲养细胞袋的管线，关闭不需要注射口的管线。8.6.45如果适用：合并另外的饲养细胞。将饲养细胞袋的内容物吸进注射器。记录体积。8.6.46如果适用：测量体积。测量注射器中饲养细胞的体积，记录在下面(b)。计算饲养细胞的新的总体积。8.6.47如果适用：将饲养细胞添加到转运包中。转动旋塞阀，关闭通往饲养细胞袋的管线，打开通往“饲养细胞悬液”转运包的管线。确保未打开转运包的管线。将注射器中的饲养细胞分配到“饲养细胞悬液”转运包中。将管线夹在转运包上，将注射器留在线束上。8.6.48如果适用：将饲养细胞添加到转运包中。揉按袋子，混合饲养细胞悬液转运包中的合并的饲养细胞。8.6.49如果适用：制备稀释液。在bsc中，将4.5ml标有“用于细胞计数稀释”和批号的aim-v培养基添加到4个15ml锥形管中。用批号和小管编号(1至4)标记管。给4个冻存管标上“另外的饲养细胞”和小管编号(1至4)。8.6.50如果适用：准备细胞计数。对每个样品使用单独的3ml注射器，使用不需要的进样口从饲养细胞悬液转运包中取出4×1.0ml细胞计数样品。将每个样品等分到步骤8.6.49中标记的冻存管中。注：用无菌酒精棉片擦拭不需要的注射端口，在每次取样之间混合饲养细胞悬液以进行细胞计数。8.6.51如果适用：进行细胞计数。利用nc-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。通过将0.5ml细胞悬液添加到4.5ml标有批号和“用于细胞计数稀释”的aim-v培养基中，稀释细胞计数样品。这将产生1:10的稀释度。必要时进行调整。8.6.52如果适用：记录细胞计数的样品体积。8.6.53如果适用：确定乘法因数。8.6.54如果适用：选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。8.6.55如果适用：记录文件名、活力和nucleoview的细胞计数。8.6.56如果适用：确定活细胞浓度的平均值和进行计数细胞的活力。参数公式结果活力(8.6.55a+8.6.55b)÷2e.％活细胞浓度(8.6.55c+8.6.55d)÷2f.个细胞/ml8.6.57如果适用：确定计数的上限和下限。参数公式结果下限8.6.56f×0.9g.个细胞/ml上限8.6.56f×1.1h.个细胞/ml两者均在可接受范围内吗？注：如果任一结果为“否”，则在步骤8.5.59至步骤8.5.65进行第二组计数。8.6.59如果适用：进行细胞计数。利用nc-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。注：稀释可根据预期细胞浓度进行调整。8.6.60如果适用：记录细胞计数的样品体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μl]”＝200，“稀释[μl]”＝08.6.61如果适用：确定乘法因数。8.6.62如果适用：选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μl]”＝200，“稀释[μl]”＝08.6.63如果适用：从nucleoview记录细胞计数。8.6.64如果适用：确定平均活细胞浓度和进行计数细胞的活力。参数公式结果活力(8.6.63a+8.6.63b)÷2e.％活细胞浓度(8.6.63c+8.6.63d)÷2f.个细胞/ml8.6.65如果适用：确定计数的上限和下限。参数公式结果下限8.6.64f×0.9g.个细胞/ml上限8.6.64f×1.1h.个细胞/ml8.6.66如果适用：计数是否在可接受范围内？参数公式结果(是/否)下限8.6.63c和d≥8.6.65g上限8.6.63c和d≤8.6.65h注：如果任一结果为“否”，则进行步骤8.6.67，找到总的平均活细胞浓度，进行计算。8.6.67如果适用：由进行的所有4个计数确定平均活细胞浓度。8.6.68如果适用：调整饲养细胞悬液的体积。取出细胞计数样品后，计算调整后的饲养细胞悬液体积。用步骤8.6.46c的总饲养细胞体积减去4.0ml。8.6.69如果适用：计算活饲养细胞的总数。*圈出用于确定活细胞浓度的步骤参考。8.6.70计算饲养细胞的体积。计算获得5×109个活饲养细胞所需的饲养细胞悬液的体积。*圈出适用步骤8.6.71计算过量饲养细胞的体积。计算要取出的过量饲养细胞的体积。向下舍入到最接近的整数。*圈出适用步骤8.6.72取出过量的饲养细胞。在新的100ml注射器中，吸出10ml空气，将注射器连接到线束上。8.6.73取出过量的饲养细胞。打开“饲养细胞悬液”转运包的管线。使用注射器吸取步骤8.6.71c计算出的饲养细胞体积，再从转运包中将另外的10.0ml放入100ml注射器中。取出饲养细胞体积后，关闭通往饲养细胞悬液转运包的管线。不要卸下最终注射器。注：注射器装满后，换上新的注射器。可使用多个注射器取出总体积。每个新注射器都吸入10ml空气。8.6.74记录体积。记录取出的饲养细胞的总体积(包括另外的10ml)。8.6.75添加okt3。在bsc中，使用1.0ml注射器和16g针头吸取0.15mlokt3。8.6.76添加okt3。从注射器上无菌地取下针头，将注射器连接到无针注射口上。注入okt3。8.6.77添加okt3。打开旋塞阀进入“饲养细胞悬液”转运包，添加10ml步骤8.6.73取出的饲养细胞以冲洗okt3。8.6.78添加okt3。将注射器上下颠倒并推动空气通过，以清除通往饲养细胞悬液转运包的管线。8.6.79添加okt3。将剩余的饲养细胞悬液留在注射器中。关闭所有夹子，然后从bsc上拆下线束。8.6.80热封。热封(按照过程注释5.12)饲养细胞悬液转运包，留下足够的管线进行连接。丢弃线束。8.6.81检查8.6节8.7第11天g-rex填充和接种8.7.1设置g-rex500mcs。在bsc外，从包装中取出g-rex500mcs，检查烧瓶中是否有任何裂纹或扭结。确保所有鲁尔连接件和密封件都拧紧。关闭除排气过滤器管线之外的所有g-rex500mcs管线上的夹子。使用记号笔在4.5l刻度处画一条线。8.7.2从培养箱中取出培养基。从培养箱中取出步骤8.4.35制备“完全cm2第11天培养基”。8.7.3准备泵送培养基。将g-rex500mcs的红色管线(按照过程注释5.11)连接到与完全cm2第11天培养基相连的中继泵转运装置上。8.7.4准备泵送培养基。将“完全cm2第11天培养基”袋挂在输液架上。通过baxa泵进料泵管。8.7.5将培养基泵入g-rex500mcs。将baxa泵设置为“高”和“9”。将4.5l培养基泵入g-rex500mcs，填充至步骤8.7.1中标记的烧瓶刻度处。8.7.6热封。将步骤8.7.3产生的连接附近的g-rex500mcs红色管线热封(按照过程注释5.12)。8.7.7给烧瓶贴上标签。在烧瓶上贴上“第11天”标签。给样品贴上过程中的“第11天qc”标签。8.7.8如果适用：孵育烧瓶。直至用til接种时放在培养箱中。8.7.9连接饲养细胞：将悬液转运包接到烧瓶。将g-rex500mcs的红色管线无菌连接(按照过程注释5.11)到“饲养细胞悬液”转运包。8.7.10向g-rex500mcs添加饲养细胞。打开饲养细胞悬液和g-rex500mcs之间的所有夹子，通过重力进料将饲养细胞悬液添加至烧瓶中。确保线路已完全清除。8.7.11热封。热封(按照过程注释5.12)步骤8.7.9创建的连接附近的红色管线。8.7.12将til悬液转运包连接到烧瓶上。将g-rex500mcs的红色管线无菌连接(按照过程注释5.11)到“til悬液”转运包。8.7.13向g-rex500mcs添加til。打开til悬液和g-rex500mcs之间的所有夹子，通过重力进料将til悬液添加至烧瓶中。确保线路已完全清除。8.7.14热封。热封(按照过程注释5.12)步骤8.7.12创建的连接附近的红色管线，取出til悬液袋。8.7.15孵育g-rex500mcs。检查是否已关闭g-rex500mcs上除大型过滤器管线之外的所有夹子，放置在培养箱中。培养箱参数：温度led显示：37.0℃±2.0℃，co2百分比：5.0±1.5％co2。8.7.16计算孵育窗口。进行计算以确定在第16天从培养箱中取出g-rex500mcs的正确时间。孵育时间(步骤8.7.15)。下限：培养时间+108小时。上限：孵育时间+132小时。8.7.17环境监测。处理后，对bsc和人员监控进行验证。8.7.18提交样品。提交样品登录。8.7.19检查8.7节。8.8第11天，冷冻保存过量的til8.8.1如果适用：冻结过量的til瓶。冻结之前，已设置验证crf。进行冷冻保存。8.8.2如果适用：启动crf。记录放入crf中的瓶的总数(不包括空白)。验证转移到crf中的样品瓶的数量是否与步骤8.5.72或步骤8.5.84或步骤8.5.72c或步骤8.5.84中准备的样品瓶总数匹配。8.8.3如果适用：开始冷冻方案的自动部分。记录开始时间，启动冷冻方案的自动部分。8.8.4如果适用：将小管从控速冷冻机转移到适当的储存容器中。冷冻完成后，将小管从crf转移至适当的储存容器中。8.8.5如果适用：将小管转移到适当的储存容器中。记录在ln2中的储存位置。8.8.6检查8.8节8.9第16天，制备培养基8.9.1预热aim-v培养基。至少在使用前12小时从2℃至8℃取出3个ctsaimv10l培养基袋，在室温下避光放置。确认每个袋子均在有效期内。在每个袋子上贴上袋子编号(1至3)、批号、日期和“加热开始时间：某时某分”。记录预热开始时间和日期。8.9.2计算时间。加热步骤8.9.1的培养基。由步骤8.9.1计算培养基袋1、2和3的加热时间。确保将所有袋子加热12到24小时。8.9.3检查房间消毒、管线清除和材料。确认房间消毒、管线清除和材料。8.9.4确保完成预处理表格。8.9.5环境监测。进行处理前，确保已开始进行预处理环境监控。8.9.6设置10llabtainer用于上清液。在bsc中，用鲁尔连接件器将流体泵转运装置的较大直径的一端连接到10llabtainer袋的母端口之一。8.9.7设置10llabtainer用于上清液。标为“上清液”和批号。8.9.8设置10llabtainer用于上清液。在从bsc上卸下之前，确保所有夹子都已关闭。注：til收获(8.10节)期间使用上清液袋，其可与培养基制备同时进行。8.9.9解冻il-2。每个ctsaimv培养基袋解冻5x1.1ml的il-2等分试样(6×106iu/ml)(br71424)，直至所有冰熔化。记录il-2批号和有效期。贴上il-2标签。8.9.10等分glutamax。在bsc中，将100.0ml的glutamax分装到适当大小的接收容器中。记录添加至每个接收容器的体积。注：按照步骤8.9.10至步骤8.9.28，最初制备一袋aim-v培养基。步骤8.10.59确定了所需的其他袋子。8.9.11标记接收容器。将每个接收容器标记为“glutamax”。8.9.12将il-2添加至glutamax。用微量移液器向每个glutamax接收器中加入5.0mlil-2。确保按照操作说明5.18冲洗吸头，针对添加的每毫升，使用新的移液器吸头。记录添加至每个glutamax接收容器的体积。8.9.13标记接收容器。将每个接收器标记为“glutamax+il-2”和接收容器编号。8.9.14准备用于制剂的ctsaimv培养基袋。确保在使用前在室温下加热ctsaimv10l培养基袋(w3012717)并避光放置12至24小时。在步骤8.9.2记录结束孵育时间。8.9.15准备用于制剂的ctsaimv培养基袋。在bsc中，关闭4英寸血浆转运装置上的夹子，然后使用尖嘴端口(spikeport)将夹子连接到袋子。注：保持恒定压力，同时沿一个方向旋转尖嘴。确保不要刺穿端口的侧面。8.9.16准备用于制剂的ctsaimv培养基袋。通过鲁尔接口将中继泵流体转运装置的较大直径端连接到4英寸血浆转运装置。8.9.17安装baxa泵。将baxa泵安装在bsc旁。从bsc取出中继泵流体转运装置的泵管部分，将其安装在中继泵中。8.9.18准备配制培养基。在bsc中，将注射器从泵送液体分配系统(plds)中移除并丢弃。注：确保不损害plds移液器的无菌性。8.9.19准备配制培养基。通过鲁尔连接件将plds移液器连接到中继泵流体转运装置的较小直径端，将移液器吸头置于步骤8.9.13中制备的“glutamax+il-2”中，用于抽吸。打开接收器和10l袋之间的所有夹子。8.9.20将glutamax+il-2泵入袋中。将泵速设为“中”和“3”，将所有“glutamax+il-2”泵入10lctsaimv培养基袋中。一旦无溶液残留，清理管线并停止泵。记录添加至下面每个aimv袋中的含il-2的glutamax的体积。8.9.21移除plds。确保关闭所有夹子，从中继泵流体转运装置上卸下plds移液器。卸下中继泵流体转运装置，盖上4英寸血浆转运装置的红色盖子。8.9.22标记袋子。标记每个制备好的“完全cm4第16天培养基”袋。8.9.23按照样品计划，取出培养基保留。使用30ml注射器，通过将注射器连接到4英寸血浆转运装置上，取出20.0ml的“完全cm4第16天培养基”，然后将样品加到50ml锥形管中。注：仅从准备好的第一袋培养基中取出培养基保留样品。注：取出注射器后，确保将4英寸血浆转运装置夹紧或盖上红色盖子。8.9.24连接新的中继泵流体转运装置。将新的流体泵转运装置的较大直径的一端连接到“完全cm4第16天培养基”袋的4英寸血浆转运装置上。8.9.25贴好标签，储存样品。贴上样品计划库存标签，将培养基保留样品储存在2℃至8℃下，直至根据样品计划提交登录进行检测。8.9.26签名，取样。确保完成lims样品计划表，取出样品。8.9.27监控培养箱。如果适用，监控步骤8.9.10准备的其他袋子。培养箱参数：温度led显示：37.0±2.0℃，co2百分比：5.0±1.5％co2。8.9.28加热完全cm4第16天培养基。在培养箱中将第一袋完全cm4第16天培养基加热≥30分钟，直至可使用。如果适用，按照步骤8.10.59加热其他袋子。8.9.29制备稀释液。在bsc中，向每个4x15ml锥形管中加入4.5ml标记有“用于细胞计数稀释”的aim-v培养基。用批号和管编号(1至4)标记锥形管。用管编号(1至4)标记4个冻存管。在bsc下保存管，用于步骤8.10.31。8.9.30检查8.9节8.10第16天，rep分装8.10.1预处理表格。8.10.2监控培养箱。培养箱参数：温度led显示屏：37.0±2.0℃，co2百分比：5.0±1.5％co2。8.10.3从培养箱中取出g-rex500mcs。在从培养箱中取出g-rex500mcs之前，进行以下检查以确保符合培养参数。从培养箱中取出g-rex500mcs。8.10.4设置1l转运包。按照过程注释5.12，热封1l转运包(w3006645)，留下约12英寸管线。8.10.5准备1l转运包。将1l转运包标为“til悬液”。8.10.6称重1l转运包，将包括整个管线在内的1l转运包放在秤上，记录干重。8.10.7gatherex设置。将g-rex500mcs的红色培养基取出管线无菌连接到步骤8.9.8准备的10llabtainer袋“上清液”上的中继泵转运装置上。将g-rex500mcs的透明细胞取出管线无菌连接到步骤8.10.5准备的til悬液转运包上。8.10.8gatherex设置。将g-rex500mcs烧瓶放在gatherex的左侧。将上清液实验室容器袋和til悬液转运包放在右侧。8.10.9gatherex设置。从g-rex500mcs到顶部夹子(标有红色线)安装了红色培养基取出管线，gatherex上安装了导管。从g-rex500mcs到底部夹子(标有蓝色线)安装了透明收获管线，在gatherex上安装了导管。8.10.10gatherex设置。将gatherex的气体管线连接到g-rex500mcs的无菌过滤器上。注：从g-rex500mcs取出上清液之前，确保已关闭细胞取出管线上的所有夹子。8.10.11减少g-rex500mcs体积。按照sop-01777，将约4.5l培养上清液从g-rex500mcs转移至10llabtainer。目视检查g-rex500mcs，确保将烧瓶的液位和培养基减小至吸管的末端。注：如果gatherex过早停止，则可通过再次按下向右箭头按钮来重启。8.10.12准备烧瓶用于til收获。取出上清液后，关闭至红色管线的所有夹子。8.10.13开始til收获。记录til收获的开始时间。8.10.14开始til收获。用力敲击烧瓶并旋转培养基以释放细胞。检查烧瓶以确保所有细胞均已分离。注：如果细胞未分离，联系区域管理。8.10.15开始til收获。倾斜烧瓶以确保软管在烧瓶的边缘。注：如果细胞收集吸管不在壁和底部膜的交界处，则以450度倾斜的角度敲击烧瓶通常足以正确放置吸管。8.10.16收获til。松开通往til悬液转运包的所有夹子。8.10.17收获til。使用gatherex将细胞悬液转移至til悬液转运包中。注：确保保持倾斜的边缘，直至收集完所有细胞和培养基。8.10.18收获til。检查膜的贴壁细胞。8.10.19冲洗烧瓶膜。冲洗g-rex500mcs的底部。用洗涤培养基覆盖约1/4的气体交换膜。8.10.20关闭g-rex500mcs上的夹子。确保关闭g-rex500mcs上的所有夹子。8.10.21热封。(按照过程注释5.12)将包含til的转运包热封到尽可能靠近连接处的位置，以使总管长度保持大致相同。8.10.22热封。(按照过程注释5.12)热封含有上清液的10llabtainer，放入bsc用于进行步骤8.10.25的样品收集。8.10.23计算til悬液体积。记录具有细胞悬液的转运包的重量，计算体积悬液。8.10.24准备好的转运包用于样品取出。按照过程注释5.11，将4英寸血浆转运装置连接到步骤8.10.21的til悬液转运包，使母鲁尔接口端尽可能靠近袋子。8.10.25从细胞上清液中取出检测样品。在bsc中，使用母鲁尔端口和适当尺寸的注射器从10l实验室容器中取出10.0ml上清液。放入15ml锥形管中，标记为“bact”，在步骤8.10.28保留该管用于bact样品。8.10.26从细胞上清液中取出检测样品。使用另一个注射器，取出10.0ml上清液，放入15ml锥形管中。保留用于支原体样品的试管，用于步骤8.10.32。试管标记为“支原体稀释液”。8.10.27封闭上清液袋。在鲁尔端口上放一个红色盖子，以关闭袋子，从bsc中送出。8.10.28无菌性和bact检测取样。在bsc中，使用适当尺寸的注射器从步骤8.10.25制备的标记了bact的15ml锥形瓶中取出1.0ml样品，接种厌氧瓶。对有氧瓶重复上述步骤。注：此步骤可不按顺序进行。8.10.29标记并储存样品。用样品计划库存标签标记样品，在室温下保存bact样品，避光，直至根据样品计划提交登录进行检测。注：不要让标签挡住瓶子上的条形码。8.10.30签名，取样。确保完成lims样品计划表，取出样品。8.10.31取出细胞计数样品。在bsc中，对每个样品使用单独的3ml注射器，使用鲁尔连接件从“til悬液”转运包中取出4x1.0ml细胞计数样品。将样品置于步骤8.9.29制备的冻存管中。8.10.32取出支原体样品。使用3ml注射器，从til悬液转运包中取出1.0ml，放入上面制备的15ml锥形标签“支原体稀释液”中。8.10.33标记并储存样品。在2℃至8℃下标记并储存支原体样品，直至根据样品计划提交登录进行检测。8.10.34签名，取样。确保完成lims样品计划表，取出样品。8.10.35准备用于接种的转运包。在bsc中，将中继泵流体转运装置的大直径管线末端连接到包含til的转运包上的鲁尔接口适配器。使用止血钳将管线夹在转运包附近。在转运装置的末端放一个红色盖子。8.10.36将til放在培养箱中。从bsc中取出细胞悬液，放入培养箱中直至需要。记录时间。8.10.37进行细胞计数。利用nc-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。最初通过将0.5ml细胞悬液加入步骤8.9.29制备的4.5mlaim-v培养基中来稀释细胞计数样品。得到1:10的稀释度。8.10.38记录细胞计数的样品体积。8.10.39确定乘法因数。8.10.40选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。8.10.41记录文件名、活力和nucleoview的细胞计数。参数公式结果活力(8.10.41a+8.10.41b)÷2e.％活细胞浓度(8.10.41c+8.10.41d)÷2f.个细胞/ml8.10.42确定平均活细胞浓度和进行计数细胞的活力。8.10.43确定计数的上限和下限。参数公式结果下限8.10.42f×0.9g.个细胞/ml上限8.10.42f×1.1h.个细胞/ml8.10.44两个计数均在可接受范围内吗？参数公式结果(是/否)下限8.10.41c和d≥8.10.43g上限8.10.41c和d≤8.10.43h8.10.45如果适用：进行细胞计数。利用nc-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。注：可根据预期细胞浓度调整稀释度。8.10.46如果适用：记录细胞计数的样品体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μl]”＝200，“稀释[μl]”＝08.10.47如果适用：确定乘法因数。8.10.48如果适用：选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μl]”＝200，“稀释[μl]”＝0。8.10.49如果适用：从nucleoview记录细胞计数。8.10.50如果适用：确定平均活细胞浓度和进行计数细胞的活力。参数公式结果活力(8.10.49a+8.10.49b)÷2e.％活细胞浓度(8.10.49c+8.10.49d)÷2f.个细胞/ml8.10.51如果适用：确定计数的上限和下限。参数公式结果下限8.10.50f×0.9g.个细胞/ml上限8.10.50f×1.1h.个细胞/ml8.10.52如果适用：计数是否在可接受范围内？参数公式结果(是/否)下限8.10.49c和d≥8.10.51g上限8.10.49c和d≤8.10.51h注：如果任一结果为“否”，进行步骤8.10.53，确定所收集的所有细胞计数的平均值。8.10.53如果适用：由进行的所有4个计数来确定平均活细胞浓度。8.10.54调整til悬液体积。取出细胞计数样品后，计算调整后的til悬液的体积。用步骤8.10.23c的til细胞总体积减去用于检测的5.0ml取出体积。8.10.55计算活til细胞总数。8.10.56计算用于传代培养的烧瓶。计算要接种的烧瓶总数。注：将要接种的g-rex500mcs烧瓶的数量向上舍入，得到接近的整数。注：要接种的g-rex500mcs烧瓶的最大数量为5个。如果计算得出的要接种的烧瓶数量超过5个，则使用所有可用的细胞悬浮液仅接种5个。8.10.57计算用于传代的烧瓶数量8.10.58qa检查步骤8.10.38至步骤8.10.57中的细胞计数计算。8.10.59确定所需的其他培养基袋的数量。除步骤8.9.28准备的袋子之外，计算还需要的培养基袋子数量。*将所需培养基袋数量向上舍入为最接近的整数。8.10.60如果适用：准备其他培养基。对于步骤8.10.59d计算出的需要的每两个g-rex-500m烧瓶，准备一个10l袋子的“cm4第16天培养基”。进行步骤8.10.62，在准备和加热另外的培养基的同时，对第一个g-rex-500m烧瓶进行接种。8.10.61如果适用：准备另外的培养基袋。准备并加热步骤8.10.59d确定的另外的培养基袋的计算数量，重复步骤8.9.10至步骤8.9.28。8.10.62填充g-rex500mcs。在台式机上打开g-rex500mcs，检查了容器中是否有裂纹或管子是否扭结。确保所有鲁尔连接件和密封件都拧紧。用记号笔在烧瓶外部的4500ml线上标记。关闭g-rex500mcs上所有大型过滤器线夹之外的所有线夹。8.10.63填充g-rex500mcs。将g-rex500mcs的红色培养基管线无菌连接(按照过程注释5.11)到步骤8.9.28准备的培养基袋上的流体转运装置上。8.10.64准备泵送培养基。将“cm4第16天培养基”挂在输液杆上。通过baxa泵喂入泵管。8.10.65将培养基泵送到g-rex500mcs中。将baxa泵设置为“高”和“9”，然后将4500ml的培养基泵入烧瓶。将4.5l的“cm4第16天培养基”泵入g-rex500mcs，填充至上述烧瓶的线标记处。一旦转移了4.5l的培养基，停止泵。8.10.66热封。将g-rex500mcs的红色培养基管线热封(按照过程注释5.12)在步骤8.10.63产生的连接附近，取下培养基袋。8.10.67重复填充。加热培养基并准备使用时，对步骤8.10.56c计算的每个烧瓶重复步骤8.10.62至步骤8.10.66。注：使用重力填充以上泵可以同时填充多个烧瓶。注：每袋培养基只能装满两个烧瓶。8.10.68记录并标记装满的烧瓶。每个烧瓶装满后，用字母和qa提供的过程中“第16天”标签对每个烧瓶进行标记。8.10.69标记样品。下面给样品贴上“第16天”标签。8.10.70如果适用：孵育烧瓶。在等待用til接种的同时将烧瓶放在培养箱中。8.10.71验证填充的烧瓶数量。记录已装瓶的总数。8.10.72计算要添加的细胞悬液的体积。计算添加至新的g-rex500mcs烧瓶中的til悬液的目标体积。8.10.56c如果烧瓶的数量超过5个，则使用细胞悬液的整个体积仅接种5个。8.10.73准备用于接种的烧瓶。从培养箱的步骤8.10.70中取出g-rex500mcs。8.10.74准备泵送。关闭g-rex500mcs上除了大型过滤器管线之外的所有夹子。通过baxa泵喂入泵管。8.10.75从培养箱中取出til。从培养箱中取出“til悬液”转运包，在步骤8.10.36记录培养结束时间。8.10.76准备用于接种的细胞悬液。(按照过程注释5.11)将步骤8.10.75的“til悬液”转运包无菌连接到泵入口管线。8.10.77去皮称重。将til悬液袋放在秤上。使用设置为“低”和“2”的baxa泵，填装从til悬液袋至连接处的管线。放磅秤。8.10.78用til悬液接种烧瓶。将baxa泵设为“中”和“5”。将步骤8.10.72c计算出的til悬液的体积泵入烧瓶中。记录添加至每个烧瓶中的til悬液的体积。8.10.79热封。(按照过程注释5.12)热封“til悬液”转运包，留下足够的管子以连接在下一个烧瓶上。使用管线汽提器，将g-rex烧瓶管线中残留的til悬液清除到容器中。8.10.80填充剩余的烧瓶。在接种的每个烧瓶之间，确保混合“til悬液”转运包，重复步骤8.10.76至步骤8.10.79，以接种所有剩余烧瓶。以字母顺序填充烧瓶。8.10.81监控培养箱。注：如果必须在两个培养箱之间分装培养瓶，确保同时监控两个培养箱。培养箱参数：温度led显示：37.0℃±2.0℃，co2百分比：5.0±1.5％co2。8.10.82孵育烧瓶。记录每个烧瓶放在培养箱中的时间。8.10.83计算孵育窗口。进行以下计算，以确定在第22天从培养箱中取出g-rex500mcs的时间范围。8.10.84环境监测。处理后，对bsc和人员监控进行验证。8.10.85提交样品。确保第16天所有样品均已提交登录。8.10.86检查8.10节。8.11第22天，制备洗涤缓冲液8.11.1检查房间消毒、管线清除和材料。8.11.2确保完成预处理表格。8.11.3环境监测。进行处理前，确保已进行预处理环境监控。8.11.4准备10llabtainer袋。在bsc中，通过鲁尔连接件将4英寸血浆转运装置连接到10llabtainer袋中。8.11.5准备10llabtainer袋，标上“上清液”、批号和初始/日期。8.11.6准备10llabtainer袋。移出bsc之前，关闭所有夹子。注：对于每两个要收获的g-rex500mcs烧瓶，准备一个10llabtainer袋。注：8.12节中使用上清液袋，其可与8.11节同时运行。8.11.7连接流体转运装置。在bsc外，关闭4s-4m60上的所有夹子。将中继流体转运装置连接(按照过程注释5.11)至4s-4m60的公鲁尔接口端之一(例如参见图132。)8.11.8将材料放到bsc中。将plasmalyte-a和人白蛋白25％放入bsc。将4s-4m60和中继流体转运装置装配放进bsc。8.11.9将plasmalyte泵入3000ml袋中。将三袋plasmalyte-a刺入4s-4m60连接器套件。注：在卸下之前，用酒精棉签(w3009488)擦拭端口盖。注：保持恒定压力，同时沿一个方向旋转尖嘴。确保不要刺穿端口的侧面。8.11.10将plasmalyte泵入3000ml袋中。通过鲁尔连接件将origen3000ml收集袋连接到中继站泵转运装置的较大直径端。8.11.11将plasmalyte泵入3000ml袋中。封闭3000mlorigen袋未使用的管线上的夹子。8.11.12将plasmalyte泵入3000ml袋中。将baxa泵安装在bsc旁边。通过位于bsc外部的baxa泵喂入转运装置管。将泵设置为“高”和“9”。8.11.13将plasmalyte泵入3000ml袋中。打开从plasmalyte-a到3000mlorigen袋的所有夹子。8.11.14将plasmalyte泵入3000ml袋中。将所有plasmalyte-a泵入3000ml源袋中。转移完所有plasmalyte-a后，停止泵。8.11.15将plasmalyte泵入3000ml袋中。视需要，通过倒转泵并操纵袋子的位置，从3000mlorigen袋子中除去空气。8.11.16将plasmalyte泵入3000ml袋中。关闭所有夹子。通过鲁尔连接件从中继泵流体转运装置中取出3000ml袋子，在通往袋子的管线上放一个红色盖子(w3012845)。8.11.17向3000ml袋中添加25％人白蛋白。打开排气迷你尖嘴。在不影响尖嘴无菌性的情况下，确保牢固地固定蓝色盖子。8.11.18向3000ml袋中添加25％人白蛋白。用排气的迷你尖嘴刺入25％人白蛋白瓶的隔垫。注：确保不损害尖嘴的无菌性。8.11.19向3000ml袋中添加25％人白蛋白。重复步骤8.11.17至步骤8.11.18两次，共三(3)个加标25％的人白蛋白瓶。8.11.20向3000ml袋中添加25％人白蛋白。从一个排气的迷你尖嘴上取下蓝色盖子，将60ml注射器连接到25％人血清白蛋白瓶上。8.11.21向3000ml袋中添加25％人白蛋白。吸取60ml25％的人血清白蛋白。注：可能需要使用一瓶以上25％的人血清白蛋白。视需要，将注射器从排气迷你尖嘴断开，将其连接到25％人血清白蛋白瓶中的下一个排气迷你尖嘴上。请勿从25％人血清白蛋白瓶中取出排气迷你尖嘴。8.11.22向3000ml袋中添加25％人白蛋白。一旦获得60ml，从排气的迷你尖嘴中取出注射器。8.11.23向3000ml袋中添加25％人白蛋白。在步骤8.11.16中，将注射器连接到装有plasmalyte-a的3000mlorigen袋的无针进样口上。加入所有人白蛋白25％。注：每次使用前，用酒精棉片擦拭不需要的进样口。8.11.24向3000ml袋中添加25％人白蛋白。重复步骤8.11.20至步骤8.11.23，获得最终体积为120.0ml的人白蛋白25％。8.11.25混合袋子。加入所有25％的人白蛋白后，轻轻混合袋子。8.11.26标记袋子。标记为“lovo洗涤缓冲液”和批号，标明24小时到期。8.11.27制备il-2稀释液。使用10ml注射器，通过lovo洗涤缓冲液袋上的无针进样取出5.0mllovo洗涤缓冲液。将lovo洗涤缓冲液加到50ml锥形管中，标记为“il-2稀释液”和批号。注：每次使用前，用酒精棉片擦拭不需要的进样口。8.11.28等分crf空白袋lovo洗涤缓冲液。使用100ml注射器，从无针进样口中吸出70.0mllovo洗涤缓冲液。注：每次使用前，用酒精棉片擦拭不需要的进样口。8.11.29等分crf空白袋lovo洗涤缓冲液。在注射器上盖上红色盖子，贴上“空白冻存袋”和批号的标签。注：保持注射器在室温下，直至在步骤8.14.3中需要。8.11.30完成洗涤缓冲液的制备。关闭lovo洗涤缓冲液袋上的所有夹子。8.11.31解冻il-2。解冻1个1.1mlil-2(6×106iu/ml)，直至所有冰解冻为止。记录il-2批号和有效期。注：确保贴有il-2标签。8.11.32制备il-2。向标有“il-2稀释液”的50ml锥形管中加入50μlil-2储备溶液(6×106iu/ml)。8.11.33制备il-2。将锥形管重新标记为“il-26x104”、日期、批号和有效期24小时。盖上盖子，保存在2℃至8℃下。8.11.34冷冻保存制剂。将5个冻存盒放在2℃至8℃进行预处理，以进行最终产品的冷冻保存。8.11.35制备细胞计数稀释液。在bsc中，向4个单独的15ml锥形管中添加4.5ml的aim-v培养基(已标记批号和“用于细胞计数稀释”)，用记录批号和管编号(1至4)标记管。放在一边，在步骤8.12.34中使用。8.11.36准备细胞计数。用瓶编号(1至4)标记4个冻存管。在bsc下保存管，在步骤8.12.33中使用。8.11.37检查8.11节8.12第22天，til收获8.12.1监控培养箱。培养箱参数温度led显示屏：37℃±2.0℃，co2百分比：5％±1.5％。注：8.12节可与8.11节同时运行。8.12.2从培养箱中取出g-rex500mcs烧瓶。从培养箱中取出g-rex500mcs之前，进行以下检查以确保符合培养参数。注：必须从培养箱中取出每个烧瓶后进行此步骤。8.12.3准备til收集袋。将3000ml收集袋标记为“til悬液”、批号和初始/日期。8.12.4密封额外的连接。按照过程注释5.12，在收集袋的每个连接末端附近将两个鲁尔连接件热封。8.12.5gatherex设置。将红色培养基取出管线从g-rex500mcs无菌连接(按照过程注释5.11)至步骤8.11.5准备的10llabtainer袋。注：有关使用多个gatherex设备，参考过程注释5.16。8.12.6gatherex设置。将g-rex500mcs的透明细胞移除管线无菌连接至步骤8.12.3准备的til悬液收集袋(按照过程注释5.11)。注：有关使用多个gatherex设备，参考过程注释5.16。8.12.7gatherex设置。将g-rex500mcs烧瓶放在gatherex的左侧。将上清液labtainer袋和合并的til悬液收集袋放在右侧。8.12.8gatherex设置。将g-rex500mcs的红色培养基取出管线安装到gatherex的顶部夹子(标有红色线)和导管。将g-rex500mcs的透明收获线安装到gatherex的底部夹子(标有蓝色线)和导管。8.12.9gatherex设置。将gatherex的气体管线连接到g-rex500mcs的无菌过滤器。从g-rex500mcs去除上清液之前，确保关闭细胞取出管线上的所有夹子。8.12.10减小体积。将约4.5l的上清液从g-rex500mcs转移至上清液袋中。目视检查g-rex500mcs以确保烧瓶处于水平状态，培养基已减少至抽吸汲取管的末端。视需要，重复步骤。注：如果gatherex过早停止，则可通过再次按下向右箭头按钮来重启。8.12.11准备用于til收获的烧瓶。取出上清液后，关闭至红色管线的所有夹子。8.12.12开始收集til。记录til收获的开始时间。8.12.13开始收集til。用力敲击烧瓶并旋转培养基以释放细胞。检查烧瓶以确保所有细胞均已分离。将“til悬液”3000ml收集袋放在平坦表面的干抹布上。注：如果细胞未分离，联系区域管理。8.12.14开始收集til。倾斜烧瓶以确保软管在烧瓶的边缘。注：如果细胞收集软管不在壁膜和底部膜的连接处，则将烧瓶以45°角倾斜时敲击烧瓶通常足以正确放置软管。8.12.15收获til松开通往til悬液收集袋的所有夹子。8.12.16收获til。使用gatherex，将til悬液转移至3000ml收集袋中。注：保持边缘倾斜直至收集所有细胞和培养基。8.12.17收获til。检查膜上是否有贴壁细胞。8.12.18冲洗烧瓶膜。冲洗g-rex500mcs的底部。用洗涤培养基覆盖约1/4的气体交换膜。8.12.19关闭g-rex500mcs上的夹子。确保所有夹子都已关闭。8.12.20热封。将装有til的收集袋热封(按照过程注释5.12)尽可能靠近连接的位置，以使总管长度保持大致相同。8.12.21热封。热封(按照过程注释5.12)上清液袋。8.12.22完成剩余g-rex500mcs烧瓶的收获。重复步骤8.12.2和步骤8.12.5至步骤8.12.21，将所有til合并到同一收集袋中。注：每第二个烧瓶后必须更换10l上清液袋。注：有关使用多个gatherex设备，参考过程注释5.16。8.12.23准备lovo源袋。获得一个新的3000ml收集袋。标记为“lovo源袋”、批号和初始/日期。8.12.24准备lovo源袋。热封(按照过程注释5.12)“lovo袋”的管线，取下母鲁尔接头，留下足够的线进行连接。8.12.25称重lovo源袋。在秤和皮重上放置适当大小的塑料箱。将lovo源袋(包括端口和管线)放入垃圾箱，记录干重。8.12.26将细胞悬液转移到lovo源袋中。关闭170μm重力血液过滤器的所有夹子。8.12.27将细胞悬液转移到lovo源袋中。将重力血液过滤器的长末端无菌连接(按照过程注释5.11)到lovo源袋上。8.12.28将细胞悬液转移到lovo源袋中。将过滤器的两根来源管线之一无菌连接(按照过程注释5.11)到“合并的til悬液”收集袋中。8.12.29将细胞悬液转移到lovo源袋中。连接完成后，将过滤器上未使用的管线加热封(按照过程注释5.12)以将其移除。8.12.30将转移细胞悬液装入lovo源袋中。打开所有必要的夹子，将收集袋悬挂在iv杆上，以提升til悬液，以启动til的重力流转移，使其通过血液过滤器进入lovo源袋。排水时轻轻旋转或揉捏til悬吊袋，以保持til均匀悬吊。注：不要将lovo源袋悬挂在过滤设备上。将lovo源袋放在平坦的干抹布上。8.12.31关闭所有夹子。将所有til转移到lovo源袋后，关闭所有夹子。8.12.32热封。尽可能靠近连接加热封(根据过程注释5.12)以去除重力血液过滤器8.12.33取出细胞计数样品。在bsc中，对每个样品使用单独的3ml注射器，使用无针注射口从lovo源袋中取出4x1.0ml细胞计数样品。将样品放在步骤8.11.36中准备的冻存管中。注：用酒精棉片擦拭不需要的进样口，混合每个样品之间的lovo源袋。8.12.34进行细胞计数。利用nc-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。最初通过将0.5ml细胞悬液加入步骤8.11.35制备的4.5mlaim-v培养基中来稀释细胞计数样品。得到1:10的稀释度。8.12.35记录细胞计数的样品体积。8.12.36确定乘法因数。8.12.37选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μl]”＝200，“稀释[μl]”＝08.12.38从nucleoview记录细胞计数。8.12.39确定进行细胞计数的平均活力，活细胞浓度和有核细胞总浓度。参数公式结果活力(8.12.38a+8.12.38b)÷2g.活细胞浓度(8.12.38c+8.12.38d)÷2h.个细胞有核细胞总浓度(8.12.38e+8.12.38f)÷2i.个细胞8.12.40确定计数的上限和下限8.12.41两个计数均在可接受范围内吗？参数公式结果(是/否)下限8.12.38c和d≥8.12.40j上限8.12.38c和d≤8.12.40k注：如果任一结果为“否”，则在步骤8.12.42至步骤8.12.49进行第二组计数。8.12.42如果适用：进行细胞计数。利用nc-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。注：可根据预期细胞浓度调整稀释度。8.12.43如果适用：记录细胞计数的样品体积8.12.44如果适用：确定乘法因数。8.12.45如果适用：选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μl]”＝200，“稀释[μl]”＝08.12.46如果适用：从nucleoview记录细胞计数。8.12.47如果适用：确定进行细胞计数的平均活力、活细胞浓度和有核细胞总浓度。参数公式结果活力(8.12.46a+8.12.46b)÷2g.活细胞浓度(8.12.46c+8.12.46d)÷2h.个细胞/ml有核细胞总浓度(8.12.46e+8.12.46f)÷2i.个细胞/ml8.12.48如果适用：确定计数的上限和下限参数公式结果下限8.12.47h×0.9j.个细胞/ml上限8.12.47h×1.1k.个细胞/ml8.12.49如果适用：计数是否在可接受范围内？注：如果任一结果为“否”，进行步骤8.12.50以确定平均值。8.12.50如果适用：用进行的所有4个计数确定平均活细胞浓度和平均有核细胞总浓度。8.12.51qa检查细胞计数。qa人员检查步骤8.12.38至步骤8.12.50中进行的计算。8.12.52称重lovo源袋。在去皮天平上放置适当尺寸的塑料箱。将完整lovo源袋放入箱中，记录重量。计算细胞悬液的体积。8.12.53计算活til细胞总数。*圈出用于确定活细胞浓度的步骤参考。**如果“是”，则继续。如果“否”，联系区域管理。8.12.54计算有核细胞总数。*圈出用于确定有核细胞总浓度的步骤参考。8.12.55制备支原体稀释液。在bsc中，通过鲁尔样品端口从一个上清液袋中取出10.0ml，放入15ml锥形瓶中。标记15ml锥形“支原体稀释液”，保存在bsc中以用于步骤8.14.69。8.12.56检查8.12节8.13lovo8.13.1使用仪器左后方的开关打开lovo。注：步骤8.13.1至8.13.13可与8.11节至8.12节同时进行。8.13.2检查秤和压力传感器。8.13.3确保任一秤上均未悬挂物品，检查每个秤的读数。记录步骤8.13.5中的值。注：如果任一秤的读数超出0+/-2g的范围，校准秤。8.13.4如果所有秤在未悬挂重量时有公差，则在每个秤(#1至#4)上悬挂1kg重量，检查读数。记录步骤8.13.5中的值。8.13.5检查秤。记录每个秤的显示值。如果值在范围内，继续处理。如果值不在范围内，进行校准。8.13.6检查仪器操作方案屏幕的压力传感器读数，记录。压力的可接受范围读数为0+/-10mmhg。如果显示值超出此范围，则按照机器说明储存新大气压设置。8.13.7重复步骤。如果进行新的电子秤校准或储存新的大气压设置，重复步骤8.13.3至步骤8.13.6。8.13.8从下拉菜单开始“tilg-rex收获”方案。8.13.9显示溶液1屏幕：读取缓冲液类型为plasmalyte。8.13.10至8.13.16遵循lovo触摸屏提示。8.13.17确定最终产品目标体积。注：使用步骤8.12.54c的有核细胞总数(tnc)值和下表，确定最终产物目标体积。记录最终产物体积(ml)。注：如果步骤8.12.53c的tvc>1.5×1011，联系区域管理。8.13.18至8.13.22遵循lovo触摸屏提示。8.13.23装入一次性试剂盒。在装入一次性试剂盒之前，先用酒精抹布擦拭再用不起毛的抹布擦拭压力传感器端口。装入一次性试剂盒。按照屏幕上的指示安装一次性试剂盒。8.13.24取出滤液袋。装入标准lovo一次性试剂盒后，触摸“下一步”按钮。显示“集装箱信息和位置”屏幕。从秤上取下滤液袋。8.13.25确保滤液容器是新的且超出刻度(off-scale)。8.13.26输入滤液容量。将lovo辅助袋无菌连接到现有过滤袋的公鲁尔接口管线上。确保所有夹子均已打开且流体通道畅通。触摸过滤容器容量输入字段。显示数字小键盘。输入总的新滤液容量(5,000ml)。触摸按钮以接受输入。注：估计滤液量不应超过5000ml。8.13.27将滤液容器放在工作台上。注：如果在连接过程中从f夹上拆下了管子，则将其放回夹子中。将新的过滤容器放在工作台上。不要将过滤袋挂在#3秤上。在此过程中，秤#3将为空。8.13.28跟随过滤容器更换后的lovo触摸屏提示。8.13.29确保正确装入试剂盒。将显示“一次性试剂盒干燥检查”覆盖图。检查试剂盒是否正确装入，所有夹子均已打开。检查所有管线是否有扭结或其他障碍物，尽可能进行纠正。确保已正确安装试剂盒，检查所有robert的夹子。按下“是”按钮。所有lovo机械夹子自动关闭，并显示“检查一次性试剂盒安装”屏幕。lovo经历了一系列加压步骤以检查试剂盒。8.13.30试剂盒检查结果。如果工具包检查通过，则继续下一步。*如果否，则在检查完成后可进行第二次试剂盒检查。*如果否，请检查所有管线是否有扭结或其他障碍物，并进行纠正。*如果否，请确保正确安装了确定的是，检查所有罗伯特夹子。如果第二个是检查失败：请联系区域施用人员，并准备在第10.0节中安装新是。重复步骤8.13.23-所需的步骤8.13.30。8.13.31连接plasmalyte。显示“连接溶液”屏幕。洗涤值将始终为3000ml。在屏幕上输入此值。按照过程注释5.11，将3000ml的plasmalyte袋无菌连接到穿过夹子1的管线上。将plasmalyte袋挂在iv杆上，将两个角袋环都放在钩子上。8.13.32验证plasmalyte已连接。打开所有塑料夹。验证溶液体积条目为3000ml。触摸“下一步”按钮。显示“灌注一次性试剂盒”覆盖。确认已连接plasmalyte且通向plasmalyte袋的管线上的所有连接和塑料夹都已打开，然后触摸“是”按钮。8.13.33观察到plasmalyte正在移动。一次性试剂盒灌注开始，显示“灌注一次性试剂盒”屏幕。肉眼观察到plasmalyte通过连接到plasmalyte袋的管子移动。如果没有流体在移动，按下屏幕上的“暂停”按钮，确定是否仍关闭了夹子或连接。解决问题后，请按屏幕上的“继续”按钮以继续使用一次性试剂盒。一次性试剂盒灌注成功完成后，将显示“连接源”屏幕。8.13.34至8.13.35遵循lovo触摸屏提示。8.13.36将来源容器附接到管线上。按照过程注释5.11将步骤8.12.31中准备的lovo源袋无菌连接到穿过s夹的管线上。可能有必要从夹子上拆下管线。注：如果已拆下，确保将来源管线更换到s夹中。8.13.37悬挂源容器。将源容器挂在iv杆上，将两个角袋环都放在钩子上。不要将源悬挂在#1秤上。打开所有到源袋的夹子。8.13.38连接已验证的源容器。触摸下一步按钮。显示灌注源覆盖。确认源已连接到一次性试剂盒且通往源的管线上的所有连接和塑料夹都已打开。触摸“是”按钮。8.13.39确认plasmalyte正在移动。开始源灌注，显示源灌注屏幕。肉眼观察到plasmalyte正在通过与源袋相连的管线移动。如果没有流体在移动，按屏幕上的“暂停”按钮，然后确定夹子或连接是否仍关闭。解决问题后，按屏幕上的“继续”按钮以恢复源灌注。8.13.40启动程序屏幕。当源灌注成功完成后，将显示“启动过程”屏幕。按下开始键，按下开始键后，将立即出现“预洗涤循环1”暂停屏幕。8.13.41倒置处理袋。从#2磅秤上卸下过程中包装袋(也可以从过程中顶部端口管线导板中移除管线)，将其手动翻转，以允许在一次性试剂盒灌注步骤中添加的洗涤缓冲液覆盖包装袋的所有内表面。重新将处理中的袋子挂在#2的秤上(袋子上的标签朝左)。如果顶管已卸下，则将其更换。8.13.42倒置源袋。在按下“开始”按钮之前，混合源袋，但不从iv电极上移开，方法是揉按袋角并轻轻搅动细胞，以形成均匀的细胞悬液。按下恢复按钮。lovo开始处理源袋中的液体，显示洗涤循环1屏幕。8.13.43源冲洗暂停。一旦排放源容器排空并且lovo已向洗涤源袋中添加了洗涤缓冲液，就会显示“冲洗源暂停”屏幕。在不从静脉输液架上取下源袋的情况下，揉按角落并充分混合。按下恢复。8.13.44混合过程中袋子暂停。为使细胞再次准备通过旋转器，用洗涤缓冲液稀释处理袋。在将洗涤缓冲液添加至处理袋中后，lovo会自动暂停并显示“混合处理袋”暂停屏幕。在不从秤上移开袋子的情况下，通过轻轻挤压袋子将产品充分混合。按下继续。8.13.45揉按过程中角落暂停。当处理袋为空时，将洗涤缓冲液添加至处理袋的底部以冲洗袋子。添加冲洗液后，lovo自动暂停并显示“揉按ip角落”暂停屏幕。当显示“揉按ip角落”暂停屏幕时，请勿从秤#2取出袋子。待处理袋仍悬在秤#2上时，揉按袋子角落，使残留的细胞悬浮。确保袋子没有在秤上摆动，按下“继续”按钮。8.13.46等待“取出产品”屏幕。lovo过程结束时，将显示“取出产品”屏幕。当显示此屏幕时，可以操纵lovo套件上的所有行李袋。注：直至显示“取出产品”时，才可以触摸任何袋子。8.13.47取出滞留物袋。在滞留物袋的端口附近非常靠近管线的位置放置止血钳，以防止细胞悬液沉淀到管线中。在止血钳下方加热封(按照过程注释5.12)，确保保持足够的线数以在步骤8.13.48中进行连接。取出滞留物袋。8.13.48制备用于制剂的滞留物袋。将4英寸血浆转运装置的母鲁尔锁定端连接(按照过程注释5.11)到滞留物袋上。转移滞留物袋以用于步骤8.14.11。8.13.49取出产品。按照“取出产品”屏幕上的说明进行操作。关闭lovo套件上的所有夹子，以防止流体移动。8.13.50取出产品。触摸下一步按钮。打开所有lovo机械夹子，显示“拆卸套件”屏幕。8.13.51记录数据。按照“拆卸工具包”屏幕上的说明进行操作。触摸“下一步”按钮。关闭所有lovo机械夹子，显示结果概述屏幕。从结果概述屏幕记录数据。关闭所有泵和过滤器支撑。当lovo提示时，卸下套件。*注：适用时，直接从lovo结果摘要屏幕以hh：分分：秒秒格式和(hh：分分：秒秒)格式记录所有记录时间。8.13.52至8.13.54通过lovo关机选择方案。按照lovo屏幕提示进行操作。8.13.55检查8.13节8.14最终制剂和填充8.14.1目标体积/袋子计算。从下表ddd中，选择要填充的cs750袋数量、每袋目标填充体积、每袋取出用于保留的体积以及对应于步骤8.13.22中lovo滞留物体积的每袋最终目标体积。8.14.2准备crf空白。计算cs-10和lovo洗涤缓冲液的体积以配制空白袋。8.14.3准备crf空白。在bsc外部，使用步骤8.11.29准备的lovo洗涤缓冲液注射器，通过鲁尔连接件将步骤8.14.2b计算出的体积添加至空cs750袋中。注：空白的cs750袋子配方无需无菌操作。8.14.4准备crf空白。使用适当尺寸的注射器，将在步骤8.14.2中计算出的cs-10体积添加到与步骤8.14.3制备的相同的cs750袋中。在cs750包上放一个红色盖子。8.14.5准备crf空白。尽可能从cs-750袋中赶出空气。将cs750袋尽可能热封(按照过程注释5.12)，使其尽可能靠近袋，拆下管线。8.14.6准备crf空白。在cs750袋上贴上“crf空白”、批号和首字母/日期标签。将crf空白放置在冷袋上，直至将其放入crf中为止。8.14.7计算所需il-2体积。计算添加至最终产品中的il-2的体积8.14.8组装连接设备。将4s-4m60无菌连接(按照过程注释5.11)至cc2cellconnect，在(g)处用4s-4m60歧管的4尖嘴端替换cellconnect设备(b)的单个尖嘴(例如参见图135。)8.14.9组装连接设备。将cs750冻存袋无菌连接(按照过程注释5.11)至步骤8.14.8中准备的线束上，用每个袋替换4个鲁尔接口公端(e)之一。参考步骤8.14.1确定所需的袋子数量(例如参见图136)。8.14.10组装连接设备。将cs-10袋(按过程注释5.11)连接到4s-4m60的尖嘴上。将袋子放在2℃至8℃的两个冰袋之间来保存cs-10(例如参见图137)。8.14.11将材料放入bsc。项目项目#或步骤参考质量4”血浆转运装置1il-2(6.0×104)等分试样8.11.331用适当尺寸注射器添加il-28.14.7f1lovo滞留物袋8.13.481红色盖子58.14.12用il-2制备til。使用适当大小的注射器，从“il-26x104”等分试样中取出步骤8.14.7确定的il-2量。8.14.13用il-2制备til。通过鲁尔连接件将注射器连接到步骤8.13.48准备的滞留物袋上，注入il-2。8.14.14用il-2制备til。通过将注射器中的空气推入管线来清理管线。8.14.15标为配制的til袋。关闭转运装置上的夹子，将袋子标为“配制的til”，然后将其从bsc取出。8.14.16如果适用：按照样品计划取样。如果步骤8.11.33制备的“il-26×104”等分试样有剩余，则使用适当尺寸的注射器，根据样品计划取出约5ml样品滞留物，加到50ml锥形管中。8.14.17如果适用：按照样品计划取样。贴上样品计划库存标签，储存在2℃至8℃下，直至根据样品计划提交登录进行检测。8.14.18如果适用：按照样品计划取样。对于取出的样品，确保填写lims样品计划表。8.14.19将配制的til袋添加至设备中。添加il-2后，将步骤8.14.10中“配制的til”袋连接(按照过程注释5.11)到设备上剩余的尖嘴上(例如参见图138)。8.14.20添加cs10。将已安装配制的til、cs-750袋和cs-10的组装好的设备放入bsc。注：cs-10袋和所有cs-750袋都放在两个预先设置为2℃-8℃的冷袋之间。未将配制的til袋放在冷袋上。8.14.21添加cs10。确保关闭所有夹子。转动旋塞阀，以关闭注射器。8.14.22切换注射器。将约10ml的空气吸入100ml的注射器中，更换设备上的60ml的注射器。8.14.23添加cs10。旋开旋塞阀，以使通往cs750袋的管线关闭。打开cs-10袋子的夹子，将在步骤8.14.1b中计算的体积拉入注射器。注：将使用多个注射器添加适当体积的cs-10。注：在步骤8.14.26中记录每个注射器的体积。8.14.24添加cs10。关闭cs-10的夹子，打开配制的til袋的夹子，添加cs-10。以约10.0ml/分钟的速度添加第一个10.0ml的cs10。以约1.0ml/秒的速度添加剩余的cs-10。注：使用多个注射器添加适量的cs-10。添加完后，勿重复使用注射器。8.14.25添加cs10。记录时间。注：从第一次添加cs-10到开始冻结的目标时间是30分钟。8.14.26添加cs10。记录每次cs10添加的体积和添加的总体积。根据步骤8.14.1b计算的总匹配体积。8.14.27添加cs10。关闭所有cs10袋子的夹子。8.14.28准备cs-750袋子。转动旋塞阀，以便打开注射器。打开配方til袋的夹子，在悬液到达旋塞阀之前，将悬液停下来。8.14.29准备cs-750袋。关闭配制的til袋的夹子。旋动旋塞阀，使其对cs750最终产品袋开放。8.14.30准备cs-750袋子。使用新的注射器，通过抽出空气，从cs750最终产品袋中除去尽可能多的空气。在保持注射器柱塞压力的同时，将袋子夹紧。8.14.31准备cs-750袋子。将约20ml的空气吸入新的100ml注射器中，连接至设备。注：每个cs-750最终产品袋应位于两个冷袋之间，以使配制好的til悬液保持低温。8.14.32分配细胞。转动旋塞阀，以关闭通往最终产品袋的管线。从配制的til袋中将上述计算出的体积拉入注射器。注：可使用多个注射器获得正确的体积。8.14.33分配细胞。转动旋塞阀，以使通往配制的til袋的管线关闭。一次使用一个最终产品袋，将细胞加到最终产品袋中。在步骤8.14.35记录到上述每个cs750袋中的细胞体积。8.14.34分配细胞。用注射器中的空气清除管线，使细胞与尖嘴端口的顶部均匀。关闭装满袋子的夹子。对每个最终产品袋子重复步骤8.14.29至步骤8.14.34，在每个袋子之间轻轻混合配制的til袋子。8.14.35分配细胞。记录在下面每个最终产品包装袋中的til的体积。8.14.36从最终产品袋中赶走空气，取出保留液。装满最后一个最终产品袋后，关闭所有夹子。8.14.37从最终产品袋中赶走空气，取出保留液。将10ml的空气吸入新的100ml注射器中，更换设备上的注射器。8.14.38从最终产品袋中赶走空气，取出保留液。一次操作一个袋子，从每个产品袋中抽出所有空气，再加上步骤8.14.1d确定的要保留的产品体积。注：取下样品体积后，将注射器倒转，用空气清理通向产品袋顶部端口的管线。除去保留体积和空气后，将管线夹在袋子上。8.14.39记录取出的体积。记录从每个袋子中取出的保留体积。8.14.40添加滞留物。将滞留物加入50ml锥形管中，标记为“保留”和批号。对每个袋子重复步骤8.14.37至步骤8.14.39。8.14.41制备用于冷冻保存的最终产品。使用止血钳，靠近袋子夹住管线。拆下注射器和注射器所在设备上的红色盖子鲁尔连接件。将设备移出bsc。8.14.42制备用于冷冻保存的最终产品。取出空的滞留物袋和cs-10袋。注：保留设备上的用于注射器的鲁尔连接件。丢弃空的滞留物和cs-10袋(例如参见图139)。8.14.43进行目视检查。注：步骤8.14.43至步骤8.14.46可与步骤8.14.47至步骤8.14.68同时进行。8.14.44给最终产品袋贴上标签。下面附有样品最终产品标签。8.14.45制备用于冷冻保存的最终产品。将冻存袋放在冰袋上或2℃至8℃下直至冷冻保存。8.14.46准备外部标签。确保将qa合格的外部标签贴在盒标签上，与相应的最终产品标签匹配。将qa合格的外部标签贴在盒上。以下给样品贴上外部标签：8.14.47取出细胞计数样品。使用适当尺寸的移液器，取出步骤8.14.38取出的2.0ml滞留物，放入15ml锥形管中以进行细胞计数。8.14.48进行细胞计数。根据sop-00314和过程注释5.14，利用nc-200进行细胞计数和计算。注：仅将一个样品稀释至适当的稀释因子以验证稀释是否足够。将其他样品稀释至适当的稀释倍数，然后进行计数。8.14.49记录细胞计数的样品体积。注：如果无需稀释，则“样品[μl]”＝200，“稀释[μl]”＝0。8.14.50确定乘法因数。8.14.51选择方案，输入乘法因数。确保已根据“sop–00314”选择了“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μl]”＝200，“稀释[μl]”＝08.14.52记录文件名、活力和nucleoview的细胞计数。8.14.53确定平均活细胞浓度和进行计数细胞的活力。参数公式结果活力(8.14.52a+8.14.52b)÷2e.％活细胞浓度(8.14.52c+8.14.52d)÷2f.个细胞/ml8.14.54确定计数的上限和下限。参数公式结果下限8.14.53f×0.9g.个细胞/ml上限8.14.53f×1.1h.个细胞/ml8.14.55两个计数均在可接受范围内吗？参数公式结果(是/否)下限8.14.52c和d≥8.14.54g上限8.14.52c和d≤8.14.54h注：如果任一结果为“否”，则在步骤8.14.56至步骤8.14.63中进行第二组计数。8.14.56如果适用：进行细胞计数。根据sop-00314和过程注释5.14，使用nc-200时进行细胞计数和计算。注：可根据预期细胞浓度调整稀释度。8.14.57如果适用：记录细胞计数的样品体积。8.14.58如果适用：确定乘法因数。8.14.59如果适用：选择方案，输入乘法因数。确保已选择“活细胞计数测定”方案，已输入所有乘法因数、样品体积和稀释液体积。注：如果无需稀释，输入“样品[μl]”＝200，“稀释[μl]”＝0。8.14.60如果适用：从nucleoview记录细胞计数。8.14.61如果适用：确定平均活细胞浓度和进行计数细胞的活力。参数公式结果活力(8.14.60a+8.14.60b)÷2e.％活细胞浓度(8.14.60c+8.14.60d)÷2f.个细胞/ml8.14.62如果适用：确定计数的上限和下限。参数公式结果下限8.14.61f×0.9g.个细胞/ml上限8.14.61f×1.1h.个细胞/ml8.14.63如果适用：计数是否在可接受范围内？参数公式结果(是/否)下限8.14.60c和d≥8.14.62g上限8.14.60c和d≤8.14.62h注：如果任一结果为“否”，则进行步骤8.14.64，确定平均值。8.14.64如果适用：由进行的所有4个计数来确定平均活细胞浓度。8.14.65计算流式细胞术样品。进行计算，确保用于流式细胞术取样的细胞浓度足够。*圈出用于确定活细胞浓度的步骤参考。**注：如果“否”，则联系区域管理。8.14.66计算ifn-γ。对样品进行计算，确保用于ifn-γ取样的细胞浓度足够。*圈出用于确定活细胞浓度的步骤参考。**注：如果“否”，则联系区域管理。8.14.67报告结果。完成提交样品表格的填写。8.14.68热封。一旦确定样品体积，尽可能靠近袋子热封(按照过程注释5.12)最终产物袋，从设备中取出。8.14.69按照样品计划，贴上标签，收集样品。*注：对于支原体样品，将上方配制的细胞悬液体积添加至步骤8.12.55标记为“支原体稀释液”的15ml锥形管中。**注：进行步骤8.14.70的bac-t接种。8.14.70无菌和bact。测试采样。在bsc中，使用适当大小的注射器从上面收集的保留的细胞悬液中取出1.0ml样品，接种厌氧瓶。对有氧瓶重复上述步骤。注：储存的bac-t瓶应在室温下避光保存。8.14.71贴好标签，储存样品。给所有样品贴上样品计划库存标签，妥善保存直至转移登录。进行下一步以冷冻保存最终产品和样品。注：有关最终产品和样品的冷冻保存，参见8.15节。8.14.72签名，取样。确保完成lims样品计划表，取出样品。8.14.73样品提交。第22天将所有测试样品提交登录。8.14.74环境监测。处理后，对bsc和人员监控进行验证。8.14.75检查8.14节8.15最终产品冷冻保存8.15.1准备控速冷冻机。确认已在冻结之前设置crf。记录crf设备。进行冷冻保存。8.15.2设置crf探针。刺破crf空白袋上的隔膜。插入6ml样品瓶温度探针。8.15.3将最终产品和样品置于crf中。将空白袋放入预处理的盒中，转移至crf机架的约中间位置。将最终产品盒转移至crf样品架中，将样品瓶转移至crf样品瓶架中。8.15.4将最终产品和样品置于crf中。将产品架和样品瓶架转移至crf中。在步骤8.15.5记录产品转移至crf中的时间和反应室温度。注：将盒和样品瓶架均匀分布在crf中，在每个架子之间留出尽可能大的空间。8.15.5确定达到4℃±1.5℃所需的时间并进行crf运行。箱内温度达到4℃±1.5℃后，开始运行。记录时间。参数公式值时间，最终产品转移到crf(hhmm)温度，最终产品转移到crf从监视器℃b.crf开始时间(hhmm)从配制到crf开始所经过的时间c＝b–步骤8.14.25a分钟8.15.6完成crf，储存。运行完成后停止crf。从crf取出盒子和小管。将盒子和小管转移至气相ln2进行储存。记录储存位置。后处理(postprocessing)概述·后处理：最终药物产品o(第22天)在rep第22天通过流式细胞术测定cd3+细胞o(第22天)革兰染色法(gmp)o(第22天)通过凝胶凝块lal测定(gelclotlalassay)进行细菌内毒素测试(gmp)o(第16天)bact无菌性测定(gmp)o(第16天)通过td-pcr检测支原体dna(gmp)o合格外观属性(步骤8.14.43)o(第22天)bact无菌性测定(gmp)o(第22天)ifn-γ测定提供以上提出的实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的组合物、系统和方法的实施方式的完整公开和描述，并不意图限制发明人认为是其发明的范围。对于本领域技术人员显而易见的用于实施本发明的上述模式的修改旨在落入所附权利要求的范围内。本说明书中提及的所有专利和出版物表示本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有标题和小节名称仅用于清楚和参照目的，并不以任何方式视为限制。例如，本领域技术人员将理解，根据本文描述的本发明的精神和范围，适当地组合来自不同标题和小节的各个方面的有效性。本文引用的所有参考文献通过引用整体并入本文，并且出于所有目的，其程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请被明确地和单独地指出通过引用整体并入用于所有目的。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本申请进行许多修改和变化，这对本领域技术人员来说是显而易见的。这里描述的特定的实施方式和实施例仅作为示例提供，并且本申请仅受所附权利要求以及权利要求所赋予的等同物的全部范围的限制。序列：seqidno：1是莫罗单抗的重链的氨基酸序列。seqidno：2是莫罗单抗的轻链的氨基酸序列。seqidno：3是重组人il-2蛋白的氨基酸序列。seqidno：4是阿地白介素的氨基酸序列。seqidno：5是重组人il-4蛋白的氨基酸序列。seqidno：6是重组人il-7蛋白的氨基酸序列。seqidno：7是重组人il-15蛋白的氨基酸序列。seqidno：8是重组人il-21蛋白的氨基酸序列。莫罗单抗的氨基酸序列白介素的氨基酸序列序列表<110>艾欧凡斯生物治疗公司(iovancebiotherapeutics,inc.)<120>肿瘤浸润淋巴细胞的制备方法及其在免疫治疗中的用途<130>116983-5036-wo<150>us15/940,901<151>2018-03-29<160>53<170>patentin版本3.5<210>1<211>450<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>莫罗单抗重链<400>1glnvalglnleuglnglnserglyalagluleualaargproglyala151015servallysmetsercyslysalaserglytyrthrphethrargtyr202530thrmethistrpvallysglnargproglyglnglyleuglutrpile354045glytyrileasnproserargglytyrthrasntyrasnglnlysphe505560lysasplysalathrleuthrthrasplysserserserthralatyr65707580metglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys859095alaargtyrtyraspasphistyrcysleuasptyrtrpglyglngly100105110thrthrleuthrvalserseralalysthrthralaproservaltyr115120125proleualaprovalcysglyglythrthrglyserservalthrleu130135140glycysleuvallysglytyrpheprogluprovalthrleuthrtrp145150155160asnserglyserleuserserglyvalhisthrpheproalavalleu165170175glnseraspleutyrthrleuserserservalthrvalthrserser180185190thrtrpproserglnserilethrcysasnvalalahisproalaser195200205serthrlysvalasplyslysilegluproargprolyssercysasp210215220lysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleuglygly225230235240proservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetile245250255serargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisglu260265270aspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhis275280285asnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrarg290295300valvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylys305310315320glutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglu325330335lysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyr340345350thrleuproproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleu355360365thrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrp370375380gluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproproval385390395400leuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasp405410415lysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethis420425430glualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserpro435440445glylys450<210>2<211>213<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>莫罗单抗轻链<400>2glnilevalleuthrglnserproalailemetseralaserprogly151015glulysvalthrmetthrcysseralaserserservalsertyrmet202530asntrptyrglnglnlysserglythrserprolysargtrpiletyr354045aspthrserlysleualaserglyvalproalahispheargglyser505560glyserglythrsertyrserleuthrileserglymetglualaglu65707580aspalaalathrtyrtyrcysglnglntrpserserasnprophethr859095pheglyserglythrlysleugluileasnargalaaspthralapro100105110thrvalserilepheproprosersergluglnleuthrserglygly115120125alaservalvalcyspheleuasnasnphetyrprolysaspileasn130135140vallystrplysileaspglysergluargglnasnglyvalleuasn145150155160sertrpthraspglnaspserlysaspserthrtyrsermetserser165170175thrleuthrleuthrlysaspglutyrgluarghisasnsertyrthr180185190cysglualathrhislysthrserthrserproilevallysserphe195200205asnargasnglucys210<210>3<211>134<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>重组人il-2(rhil-2)<400>3metalaprothrserserserthrlyslysthrglnleuglnleuglu151015hisleuleuleuaspleuglnmetileleuasnglyileasnasntyr202530lysasnprolysleuthrargmetleuthrphelysphetyrmetpro354045lyslysalathrgluleulyshisleuglncysleugluglugluleu505560lysproleuglugluvalleuasnleualaglnserlysasnphehis65707580leuargproargaspleuileserasnileasnvalilevalleuglu859095leulysglysergluthrthrphemetcysglutyralaaspgluthr100105110alathrilevalglupheleuasnargtrpilethrphecysglnser115120125ileileserthrleuthr130<210>4<211>132<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>阿地白介素<400>4prothrserserserthrlyslysthrglnleuglnleugluhisleu151015leuleuaspleuglnmetileleuasnglyileasnasntyrlysasn202530prolysleuthrargmetleuthrphelysphetyrmetprolyslys354045alathrgluleulyshisleuglncysleugluglugluleulyspro505560leuglugluvalleuasnleualaglnserlysasnphehisleuarg65707580proargaspleuileserasnileasnvalilevalleugluleulys859095glysergluthrthrphemetcysglutyralaaspgluthralathr100105110ilevalglupheleuasnargtrpilethrpheserglnserileile115120125serthrleuthr130<210>5<211>130<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>重组人il-4(rhil-4)<400>5methislyscysaspilethrleuglngluileilelysthrleuasn151015serleuthrgluglnlysthrleucysthrgluleuthrvalthrasp202530ilephealaalaserlysasnthrthrglulysgluthrphecysarg354045alaalathrvalleuargglnphetyrserhishisglulysaspthr505560argcysleuglyalathralaglnglnphehisarghislysglnleu65707580ileargpheleulysargleuaspargasnleutrpglyleualagly859095leuasnsercysprovallysglualaasnglnserthrleugluasn100105110pheleugluargleulysthrilemetargglulystyrserlyscys115120125serser130<210>6<211>153<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>重组人il-7(rhil-7)<400>6metaspcysaspilegluglylysaspglylysglntyrgluserval151015leumetvalserileaspglnleuleuaspsermetlysgluilegly202530serasncysleuasnasnglupheasnphephelysarghisilecys354045aspalaasnlysgluglymetpheleupheargalaalaarglysleu505560argglnpheleulysmetasnserthrglyasppheaspleuhisleu65707580leulysvalsergluglythrthrileleuleuasncysthrglygln859095vallysglyarglysproalaalaleuglyglualaglnprothrlys100105110serleuglugluasnlysserleulysgluglnlyslysleuasnasp115120125leucyspheleulysargleuleuglngluilelysthrcystrpasn130135140lysileleumetglythrlysgluhis145150<210>7<211>115<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>重组人il-15(rhil-15)<400>7metasntrpvalasnvalileseraspleulyslysilegluaspleu151015ileglnsermethisileaspalathrleutyrthrgluseraspval202530hisprosercyslysvalthralametlyscyspheleuleugluleu354045glnvalileserleugluserglyaspalaserilehisaspthrval505560gluasnleuileileleualaasnasnserleuserserasnglyasn65707580valthrgluserglycyslysglucysglugluleugluglulysasn859095ilelysglupheleuglnserphevalhisilevalglnmetpheile100105110asnthrser115<210>8<211>132<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>重组人il-21(rhil-21)<400>8metglnasparghismetileargmetargglnleuileaspileval151015aspglnleulysasntyrvalasnaspleuvalproglupheleupro202530alaprogluaspvalgluthrasncysglutrpseralaphesercys354045pheglnlysalaglnleulysseralaasnthrglyasnasngluarg505560ileileasnvalserilelyslysleulysarglysproproserthr65707580asnalaglyargargglnlyshisargleuthrcysprosercysasp859095sertyrglulyslysproprolysglupheleugluargphelysser100105110leuleuglnlysmetilehisglnhisleuserserargthrhisgly115120125sergluaspser130<210>9<211>255<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>人4-1bb，肿瘤坏死因子受体超家族，成员9智人(homosapiens)<400>9metglyasnsercystyrasnilevalalathrleuleuleuvalleu151015asnphegluargthrargserleuglnaspprocysserasncyspro202530alaglythrphecysaspasnasnargasnglnilecysserprocys354045proproasnserpheserseralaglyglyglnargthrcysaspile505560cysargglncyslysglyvalpheargthrarglysglucysserser65707580thrserasnalaglucysaspcysthrproglyphehiscysleugly859095alaglycyssermetcysgluglnaspcyslysglnglyglngluleu100105110thrlyslysglycyslysaspcyscyspheglythrpheasnaspgln115120125lysargglyilecysargprotrpthrasncysserleuaspglylys130135140servalleuvalasnglythrlysgluargaspvalvalcysglypro145150155160serproalaaspleuserproglyalaserservalthrproproala165170175proalaarggluproglyhisserproglnileileserphepheleu180185190alaleuthrserthralaleuleupheleuleuphepheleuthrleu195200205argpheservalvallysargglyarglyslysleuleutyrilephe210215220lysglnprophemetargprovalglnthrthrglnglugluaspgly225230235240cyssercysargpheproglugluglugluglyglycysgluleu245250255<210>10<211>256<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>鼠4-1bb,肿瘤坏死因子受体超家族，成员9小家鼠(musmusculus)<400>10metglyasnasncystyrasnvalvalvalilevalleuleuleuval151015glycysglulysvalglyalavalglnasnsercysaspasncysgln202530proglythrphecysarglystyrasnprovalcyslyssercyspro354045proserthrpheserserileglyglyglnproasncysasnilecys505560argvalcysalaglytyrpheargphelyslysphecysserserthr65707580hisasnalaglucysglucysilegluglyphehiscysleuglypro859095glncysthrargcysglulysaspcysargproglyglngluleuthr100105110lysglnglycyslysthrcysserleuglythrpheasnaspglnasn115120125glythrglyvalcysargprotrpthrasncysserleuaspglyarg130135140servalleulysthrglythrthrglulysaspvalvalcysglypro145150155160provalvalserpheserproserthrthrileservalthrproglu165170175glyglyproglyglyhisserleuglnvalleuthrleupheleuala180185190leuthrseralaleuleuleualaleuilepheilethrleuleuphe195200205servalleulystrpilearglyslyspheprohisilephelysgln210215220prophelyslysthrthrglyalaalaglnglugluaspalacysser225230235240cysargcysproglngluglugluglyglyglyglyglytyrgluleu245250255<210>11<211>441<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>乌托鲁单抗的重链<400>11gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyglu151015serleuargilesercyslysglyserglytyrserpheserthrtyr202530trpilesertrpvalargglnmetproglylysglyleuglutrpmet354045glylysiletyrproglyaspsertyrthrasntyrserproserphe505560glnglyglnvalthrileseralaasplysserileserthralatyr65707580leuglntrpserserleulysalaseraspthralamettyrtyrcys859095alaargglytyrglyilepheasptyrtrpglyglnglythrleuval100105110thrvalserseralaserthrlysglyproservalpheproleuala115120125procysserargserthrsergluserthralaalaleuglycysleu130135140vallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnsergly145150155160alaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnserser165170175glyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserasnphe180185190glythrglnthrtyrthrcysasnvalasphislysproserasnthr195200205lysvalasplysthrvalgluarglyscyscysvalglucyspropro210215220cysproalaproprovalalaglyproservalpheleuphepropro225230235240lysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcys245250255valvalvalaspvalserhisgluaspprogluvalglnpheasntrp260265270tyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglu275280285gluglnpheasnserthrpheargvalvalservalleuthrvalval290295300hisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasn305310315320lysglyleuproalaproileglulysthrileserlysthrlysgly325330335glnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglu340345350metthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyr355360365proseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasn370375380asntyrlysthrthrproprometleuaspseraspglyserphephe385390395400leutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasn405410415valphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthr420425430glnlysserleuserleuserprogly435440<210>12<211>214<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>乌托鲁单抗的轻链<400>12sertyrgluleuthrglnproproservalservalserproglygln151015thralaserilethrcysserglyaspasnileglyaspglntyrala202530histrptyrglnglnlysproglyglnserprovalleuvaliletyr354045glnasplysasnargproserglyileprogluargpheserglyser505560asnserglyasnthralathrleuthrileserglythrglnalamet65707580aspglualaasptyrtyrcysalathrtyrthrglypheglyserleu859095alavalpheglyglyglythrlysleuthrvalleuglyglnprolys100105110alaalaproservalthrleupheproproserserglugluleugln115120125alaasnlysalathrleuvalcysleuileseraspphetyrprogly130135140alavalthrvalalatrplysalaaspserserprovallysalagly145150155160valgluthrthrthrproserlysglnserasnasnlystyralaala165170175sersertyrleuserleuthrprogluglntrplysserhisargser180185190tyrsercysglnvalthrhisgluglyserthrvalglulysthrval195200205alaprothrglucysser210<210>13<211>116<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>乌托鲁单抗的重链可变区<400>13gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyglu151015serleuargilesercyslysglyserglytyrserpheserthrtyr202530trpilesertrpvalargglnmetproglylysglyleuglutrpmet354045glylysiletyrproglyaspsertyrthrasntyrserproserphe505560glnglyglnvalthrileseralaasplysserileserthralatyr65707580leuglntrpserserleulysalaseraspthralamettyrtyrcys859095alaargglytyrglyilepheasptyrtrpglyglnglythrleuval100105110thrvalserser115<210>14<211>108<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>乌托鲁单抗的轻链可变区<400>14sertyrgluleuthrglnproproservalservalserproglygln151015thralaserilethrcysserglyaspasnileglyaspglntyrala202530histrptyrglnglnlysproglyglnserprovalleuvaliletyr354045glnasplysasnargproserglyileprogluargpheserglyser505560asnserglyasnthralathrleuthrileserglythrglnalamet65707580aspglualaasptyrtyrcysalathrtyrthrglypheglyserleu859095alavalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu100105<210>15<211>6<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>乌托鲁单抗的重链cdr1<400>15serthrtyrtrpileser15<210>16<211>17<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>乌托鲁单抗的重链cdr2<400>16lysiletyrproglyaspsertyrthrasntyrserproserphegln151015gly<210>17<211>8<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>乌托鲁单抗的重链cdr3<400>17argglytyrglyilepheasptyr15<210>18<211>11<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>乌托鲁单抗的轻链cdr1<400>18serglyaspasnileglyaspglntyralahis1510<210>19<211>7<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>乌托鲁单抗的轻链cdr2<400>19glnasplysasnargproser15<210>20<211>11<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>乌托鲁单抗的轻链cdr3<400>20alathrtyrthrglypheglyserleualaval1510<210>21<211>448<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>乌瑞鲁单抗的重链<400>21glnvalglnleuglnglntrpglyalaglyleuleulysproserglu151015thrleuserleuthrcysalavaltyrglyglyserpheserglytyr202530tyrtrpsertrpileargglnserproglulysglyleuglutrpile354045glygluileasnhisglyglytyrvalthrtyrasnproserleuglu505560serargvalthrileservalaspthrserlysasnglnpheserleu65707580lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala859095argasptyrglyproglyasntyrasptrptyrpheaspleutrpgly100105110argglythrleuvalthrvalserseralaserthrlysglyproser115120125valpheproleualaprocysserargserthrsergluserthrala130135140alaleuglycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrval145150155160sertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproala165170175valleuglnserserglyleutyrserleuserservalvalthrval180185190proserserserleuglythrlysthrtyrthrcysasnvalasphis195200205lysproserasnthrlysvalasplysargvalgluserlystyrgly210215220proprocysproprocysproalaproglupheleuglyglyproser225230235240valpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserarg245250255thrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserglngluasppro260265270gluvalglnpheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnala275280285lysthrlysproargglugluglnpheasnserthrtyrargvalval290295300servalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyr305310315320lyscyslysvalserasnlysglyleuproserserileglulysthr325330335ileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleu340345350proproserglngluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcys355360365leuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluser370375380asnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuasp385390395400seraspglyserphepheleutyrserargleuthrvalasplysser405410415argtrpglngluglyasnvalphesercysservalmethisgluala420425430leuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserleuglylys435440445<210>22<211>216<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>乌瑞鲁单抗的轻链<400>22gluilevalleuthrglnserproalathrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysargalaserglnservalsersertyr202530leualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleuile354045tyraspalaserasnargalathrglyileproalaargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglupro65707580gluaspphealavaltyrtyrcysglnglnargserasntrppropro859095alaleuthrphecysglyglythrlysvalgluilelysargthrval100105110alaalaproservalpheilepheproproseraspgluglnleulys115120125serglythralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproarg130135140glualalysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnserglyasn145150155160serglngluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrser165170175leuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshislys180185190valtyralacysgluvalthrhisglnglyleuserserprovalthr195200205lysserpheasnargglyglucys210215<210>23<211>120<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>乌瑞鲁单抗的重链可变区<400>23metlyshisleutrpphepheleuleuleuvalalaalaproargtrp151015valleuserglnvalglnleuglnglntrpglyalaglyleuleulys202530prosergluthrleuserleuthrcysalavaltyrglyglyserphe354045serglytyrtyrtrpsertrpileargglnserproglulysglyleu505560glutrpileglygluileasnhisglyglytyrvalthrtyrasnpro65707580serleugluserargvalthrileservalaspthrserlysasngln859095pheserleulysleuserservalthralaalaaspthralavaltyr100105110tyrcysalaargasptyrglypro115120<210>24<211>110<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>乌瑞鲁单抗的轻链可变区<400>24metglualaproalaglnleuleupheleuleuleuleutrpleupro151015aspthrthrglygluilevalleuthrglnserproalathrleuser202530leuserproglygluargalathrleusercysargalaserglnser354045valsersertyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalapro505560argleuleuiletyraspalaserasnargalathrglyileproala65707580argpheserglyserglyserglythraspphethrleuthrileser859095serleugluprogluaspphealavaltyrtyrcysglngln100105110<210>25<211>5<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>乌瑞鲁单抗的重链cdr1<400>25glytyrtyrtrpser15<210>26<211>16<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>乌瑞鲁单抗的重链cdr2<400>26gluileasnhisglyglytyrvalthrtyrasnproserleugluser151015<210>27<211>13<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>乌瑞鲁单抗的重链cdr3<400>27asptyrglyproglyasntyrasptrptyrpheaspleu1510<210>28<211>11<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>乌瑞鲁单抗的轻链cdr1<400>28argalaserglnservalsersertyrleuala1510<210>29<211>7<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>乌瑞鲁单抗的轻链cdr2<400>29aspalaserasnargalathr15<210>30<211>11<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>乌瑞鲁单抗的轻链cdr3<400>30glnglnargserasptrpproproalaleuthr1510<210>31<211>230<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>fc结构域<400>31lyssercysasplysthrhisthrcysproprocysproalaproglu151015leuleuglyglyproservalpheleupheproprolysprolysasp202530thrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalasp354045valserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspgly505560valgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasn65707580serthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrp859095leuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleupro100105110alaproileglulysthrileserlysalalysglyglnproargglu115120125proglnvaltyrthrleuproproserarggluglumetthrlysasn130135140glnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspile145150155160alavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthr165170175thrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrserlys180185190leuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercys195200205servalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleu210215220serleuserproglylys225230<210>32<211>22<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>接头<400>32glyglyproglyserserlyssercysasplysthrhisthrcyspro151015procysproalaproglu20<210>33<211>22<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>接头<400>33glyglyserglyserserlyssercysasplysthrhisthrcyspro151015procysproalaproglu20<210>34<211>27<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>接头<400>34glyglyproglyserserserserserserserlyssercysasplys151015thrhisthrcysproprocysproalaproglu2025<210>35<211>27<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>接头<400>35glyglyserglyserserserserserserserlyssercysasplys151015thrhisthrcysproprocysproalaproglu2025<210>36<211>29<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>接头<400>36glyglyproglyserserserserserserserserserlyssercys151015asplysthrhisthrcysproprocysproalaproglu2025<210>37<211>29<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>接头<400>37glyglyserglyserserserserserserserserserlyssercys151015asplysthrhisthrcysproprocysproalaproglu2025<210>38<211>24<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>接头<400>38glyglyproglyserserglyserglyserserasplysthrhisthr151015cysproprocysproalaproglu20<210>39<211>23<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>接头<400>39glyglyproglyserserglyserglyserasplysthrhisthrcys151015proprocysproalaproglu20<210>40<211>21<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>接头<400>40glyglyproserserserglyserasplysthrhisthrcyspropro151015cysproalaproglu20<210>41<211>25<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>接头<400>41glyglyserserserserserserserserglyserasplysthrhis151015thrcysproprocysproalaproglu2025<210>42<211>246<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>fc结构域<400>42metgluthraspthrleuleuleutrpvalleuleuleutrpvalpro151015alaglyasnglyasplysthrhisthrcysproprocysproalapro202530gluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolysprolys354045aspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalval505560aspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalasp65707580glyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyr859095asnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasp100105110trpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleu115120125proalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnproarg130135140gluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglumetthrlys145150155160asnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproserasp165170175ilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlys180185190thrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrser195200205lysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalpheser210215220cysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysser225230235240leuserleuserprogly245<210>43<211>11<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>接头<400>43serglyserglyserglyserglyserglyser1510<210>44<211>12<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>接头<400>44serserserserserserglyserglyserglyser1510<210>45<211>16<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>接头<400>45serserserserserserglyserglyserglyserglyserglyser151015<210>46<211>254<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>4-1bbl<400>46metglutyralaseraspalaserleuaspproglualaprotrppro151015proalaproargalaargalacysargvalleuprotrpalaleuval202530alaglyleuleuleuleuleuleuleualaalaalacysalavalphe354045leualacysprotrpalavalserglyalaargalaserproglyser505560alaalaserproargleuarggluglyprogluleuserproaspasp65707580proalaglyleuleuaspleuargglnglymetphealaglnleuval859095alaglnasnvalleuleuileaspglyproleusertrptyrserasp100105110proglyleualaglyvalserleuthrglyglyleusertyrlysglu115120125aspthrlysgluleuvalvalalalysalaglyvaltyrtyrvalphe130135140pheglnleugluleuargargvalvalalaglygluglyserglyser145150155160valserleualaleuhisleuglnproleuargseralaalaglyala165170175alaalaleualaleuthrvalaspleuproproalasersergluala180185190argasnseralapheglypheglnglyargleuleuhisleuserala195200205glyglnargleuglyvalhisleuhisthrglualaargalaarghis210215220alatrpglnleuthrglnglyalathrvalleuglyleupheargval225230235240thrprogluileproalaglyleuproserproargserglu245250<210>47<211>168<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>4-1bbl可溶性结构域<400>47leuargglnglymetphealaglnleuvalalaglnasnvalleuleu151015ileaspglyproleusertrptyrseraspproglyleualaglyval202530serleuthrglyglyleusertyrlysgluaspthrlysgluleuval354045valalalysalaglyvaltyrtyrvalphepheglnleugluleuarg505560argvalvalalaglygluglyserglyservalserleualaleuhis65707580leuglnproleuargseralaalaglyalaalaalaleualaleuthr859095valaspleuproproalaserserglualaargasnseralaphegly100105110pheglnglyargleuleuhisleuseralaglyglnargleuglyval115120125hisleuhisthrglualaargalaarghisalatrpglnleuthrgln130135140glyalathrvalleuglyleupheargvalthrprogluileproala145150155160glyleuproserproargserglu165<210>48<211>118<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>4b4-1-1版本1的重链可变区<400>48glnvalglnleuglnglnproglyalagluleuvallysproglyala151015servallysleusercyslysalaserglytyrthrphesersertyr202530trpmethistrpvallysglnargproglyglnvalleuglutrpile354045glygluileasnproglyasnglyhisthrasntyrasnglulysphe505560lysserlysalathrleuthrvalasplysserserserthralatyr65707580metglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys859095alaargserphethrthralaargglyphealatyrtrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalser115<210>49<211>107<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>4b4-1-1版本1的轻链可变区<400>49aspilevalmetthrglnserproalathrglnservalthrprogly151015aspargvalserleusercysargalaserglnthrileserasptyr202530leuhistrptyrglnglnlysserhisgluserproargleuleuile354045lystyralaserglnserileserglyileproserargphesergly505560serglyserglyseraspphethrleuserileasnservalglupro65707580gluaspvalglyvaltyrtyrcysglnaspglyhisserphepropro859095thrpheglyglyglythrlysleugluilelys100105<210>50<211>119<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>4b4-1-1版本2的重链可变区<400>50glnvalglnleuglnglnproglyalagluleuvallysproglyala151015servallysleusercyslysalaserglytyrthrphesersertyr202530trpmethistrpvallysglnargproglyglnvalleuglutrpile354045glygluileasnproglyasnglyhisthrasntyrasnglulysphe505560lysserlysalathrleuthrvalasplysserserserthralatyr65707580metglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys859095alaargserphethrthralaargglyphealatyrtrpglyglngly100105110thrleuvalthrvalserala115<210>51<211>108<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>4b4-1-1版本2的轻链可变区<400>51aspilevalmetthrglnserproalathrglnservalthrprogly151015aspargvalserleusercysargalaserglnthrileserasptyr202530leuhistrptyrglnglnlysserhisgluserproargleuleuile354045lystyralaserglnserileserglyileproserargphesergly505560serglyserglyseraspphethrleuserileasnservalglupro65707580gluaspvalglyvaltyrtyrcysglnaspglyhisserphepropro859095thrpheglyglyglythrlysleugluilelysarg100105<210>52<211>120<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>h39e3-2的重链可变区<400>52metasptrpthrtrpargileleupheleuvalalaalaalathrgly151015alahissergluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalgln202530proglyglyserleuargleusercysalaalaserglyphethrphe354045serasptyrtrpmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleu505560glutrpvalalaaspilelysasnaspglysertyrthrasntyrala65707580proserleuthrasnargphethrileserargaspasnalalysasn859095serleutyrleuglnmetasnserleuargalagluaspthralaval100105110tyrtyrcysalaarggluleuthr115120<210>53<211>109<212>prt<213>人工序列（artificialsequence）<220><223>h39e3-2的轻链可变区<400>53metglualaproalaglnleuleupheleuleuleuleutrpleupro151015aspthrthrglyaspilevalmetthrglnserproaspserleuala202530valserleuglygluargalathrileasncyslysserserglnser354045leuleuserserglyasnglnlysasntyrleutrptyrglnglnlys505560proglyglnproprolysleuleuiletyrtyralaserthrarggln65707580serglyvalproaspargpheserglyserglyserglythraspphe859095thrleuthrileserserleuglnalagluaspvalala100105当前第1页12当前第1页12