一种禽流感病毒检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于病毒分子检测技术领域，具体涉及一种禽流感病毒检测试剂盒及其检测方法。

背景技术：

禽流感病毒属甲型流感病毒，分甲、乙、丙3个型。其中甲型流感病毒多发于禽类，一些甲型也可感染猪、马、鸡、海豹和鲸等各种哺乳动物及人类；乙型和丙型流感病毒则分别见于海豹和猪的感染。

禽流感h7n9病毒是一种能够传染人类并且致死的病毒。该病毒在鸡饲养的过程中感染，可以大规模扩散。发明人发现，鸡感染禽流感h7n9病毒的同时，又感染新城疫病毒的概率很大，同时感染两种病毒以后，使得两种病毒的核酸物质扩散都受到抑制，从而使得爆发疫情的潜伏期大大增加，在爆发新城疫病毒且被检测出来后，因为新城疫病毒不会感染人类，因此，病死鸡的处理往往比较随意，随意丢弃掩埋，处理过程中也不带防护措施，但是，感染新城疫病毒的鸡往往携带禽流感h7n9病毒，且该病毒由于没有爆发，往往难以被检测到，造成处理人员疏忽，降低处理级别，造成禽流感h7n9病毒感染。

同时感染禽流感h7n9病毒和新城疫病毒的鸡，在潜伏期后期也有可能造成禽流感h7n9病毒爆发，这种爆发的禽流感h7n9病毒是很容易被检测到的。但是，如果是造成新城疫病毒爆发，则禽流感h7n9病毒不容易被检测到，即使采用灵敏度最高的pcr方法，也会造成漏检。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种禽流感病毒检测试剂盒及其检测方法。

一种禽流感病毒检测试剂盒，包括检测禽流感h7n9病毒的特异性引物和检测新城疫病毒的特异性引物。

所述禽流感h7n9病毒的特异性引物包括如序列表seqidno：1和seqidno：2所述的引物；还包括如序列表seqidno：3、seqidno：4；seqidno：5和seqidno：6的两对巢式pcr引物；

所述检测新城疫病毒的特异性引物如序列表seqidno：7、seqidno：8所示。

一种禽流感病毒检测的方法，按照如下步骤进行：

(1)提取待检测样品的rna，反转录合成cdna；

(2)以序列表seqidno：1和seqidno：2所述的核苷酸序列为引物，进行pcr扩增；若扩增出目标条带，则停止检测，检测出禽流感病毒；若未扩增出目标条带，则再以seqidno：7、seqidno：8所示的核苷酸序列为引物，进行pcr扩增；若未扩增出目标条带，则终止检测，检测结果为禽流感病毒阴性；若扩增出目标条带，则进行下一步检测；

(3)以序列表seqidno：3、seqidno：4；seqidno：5和seqidno：6的所示的核苷酸序列作为引物，进行巢式pcr检测，看是否能扩增出目标条带，扩增出目标条带则检测结果为禽流感病毒阳性，否则为阴性。

所述反转录采用takara反转录试剂盒进行。反转录体系为：random6mers2μl，dntpmixture1μl，templaterna5μl，rnasefreedh2o5μl，混匀后65℃保温5min后，冰上迅速冷却；向其中加入5×primescriptbuffer4μl，rnaseinhibitor0.5μl，primescriptrtase1μl，加rnasefreedh2o定容至20μl，缓慢混匀；30℃下反应10min；然后95℃5min使酶失活。

步骤(2)所述pcr总体系为25μl，其中10×buffer2.5μl，dntps2μl，上、下游引物各1μl，taqdna聚合酶0.25μl，模板2μl，余下用灭菌ddh2o补足；反应条件为：95℃预变性3min，然后95℃30s，53℃30s，72℃2min，进行40个循环，最后72℃延伸10min；反应结束后，取6μlpcr产物于1％琼脂凝胶中电泳。

本发明的有益效果：本发明的禽流感病毒检测试剂盒，可以有效克服传统单一检测禽流感病毒试剂盒的漏检情况，避免因为饲养场同时伴随感染新城疫病毒对于检测结果的干扰，从而帮助饲养场做出精准的应对措施，最大限度的防止病毒感染人类。

附图说明

图1为ha-f和ha-r引物检测禽流感h7n9病毒结果图；

图中，m-100bpmarker，1-样本1，2-样本2。

图2为ndv-f和ndv-r引物检测新城疫病毒结果图；

图中，m-1kbmarker，1-样本1，2-样本2。

图3为ha-f1和ha-r1引物检测禽流感h7n9病毒结果图；

图中，m-1kbmarker，1-样本1，2-样本2。

图4为ha-f1和ha-r1引物检测禽流感h7n9病毒结果图；

图中，m-100bpmarker，1-样本1，2-样本2。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1引物设计

根据禽流感h7n9病毒的凝集素基因序列，通过保守序列分析比对，设计一对检测引物：5’-tgaatgaagaagctctgaggca-3’(ha-f,序列如序列表seqidno：1所示)；5’-ataattagaactcccaactgtc-3’(ha-r,序列如序列表seqidno：2所示)；巢式pcr引物两对，外侧引物：5’-tcctggtattcgctctgattgc-3’(ha-f1,序列如序列表seqidno：3所示)，5’-gctgcttagtttgactgggtca-3’(ha-r1,序列如序列表seqidno：4所示)；内侧引物：5’-atgctaaatcccaatgatacag-3’(ha-f2,序列如序列表seqidno：5所示)，5’-gtgcttttgtaatctgcagca-3’(ha-r2,序列如序列表seqidno：6所示)；根据新城疫病毒的全序列，分析其保守区域，在genbank:jn872152.1序列内设计特异检测引物如下：5’-cgatcgtcctacaagacacag-3’(ndv-f,序列如序列表seqidno：7所示),5’-gagtaacttgactatgattgac-3’(ndv-r,序列如序列表seqidno：8所示)。

实施例2样品rna提取及反转录

取同时感染h7n9病毒和新城疫病毒的鸡，取其咽拭子浸泡于1ml生理盐水中，充分搅动，然后以5000rpm的转速离心15min，取上清液500ul，加入800ultrizollsreagent，轻轻混匀后室温静置10min，加入400ul氯仿，轻微震荡混匀，室温静置5min，10000rpm离心10min，取上清夜1000ul，加入1000ul异丙醇，混匀后-20℃静置10min，10000rpm离心10min，弃上清，加入75％乙醇1000ul，混匀，10000rpm离心10min，弃上清，干燥后加入35uldepc-h2o,得到rna。

反转录采用takara反转录试剂盒进行。反转录体系为：random6mers2μl，dntpmixture1μl，templaterna5μl，rnasefreedh2o5μl，混匀后65℃保温5min后，冰上迅速冷却；向其中加入5×primescriptbuffer4μl，rnaseinhibitor0.5μl，primescriptrtase1μl，加rnasefreedh2o定容至20μl，缓慢混匀；30℃下反应10min；然后95℃5min使酶失活。

实施例3pcr

以序列表seqidno：1和seqidno：2所述的核苷酸序列为引物，进行pcr扩增；pcr总体系为25μl，其中10×buffer2.5μl，dntps2μl，ha-f、ha-r引物各1μl，taqdna聚合酶0.25μl，模板2μl，余下用灭菌ddh2o补足；反应条件为：95℃预变性3min，然后95℃30s，53℃30s，72℃2min，进行40个循环，最后72℃延伸10min；反应结束后，取6μlpcr产物于1％琼脂凝胶中电泳。电泳结果见图1，从图中可以看出，并未出现禽流感h7n9病毒特异序列条带。

以序列表seqidno：7和seqidno：8所述的核苷酸序列为引物，进行pcr扩增；pcr总体系为25μl，其中10×buffer2.5μl，dntps2μl，ha-f、ha-r引物各1μl，taqdna聚合酶0.25μl，模板2μl，余下用灭菌ddh2o补足；反应条件为：95℃预变性3min，然后95℃35s，53℃35s，72℃2min，进行40个循环，最后72℃延伸10min；反应结束后，取6μlpcr产物于1％琼脂凝胶中电泳。电泳结果见图2，从图中可以看出，扩增出新城疫病毒特异性条带。

以序列表seqidno：3和seqidno：4所述的核苷酸序列为引物，进行pcr扩增；pcr总体系为25μl，其中10×buffer2.5μl，dntps2μl，ha-f1、ha-r1引物各1μl，taqdna聚合酶0.25μl，模板2μl，余下用灭菌ddh2o补足；反应条件为：95℃预变性3min，然后95℃35s，53℃35s，72℃2min，进行40个循环，最后72℃延伸10min；反应结束后，取6μlpcr产物于1％琼脂凝胶中电泳。电泳结果见图3，从图中可以看出，并未出现禽流感h7n9病毒特异序列条带。

以序列表seqidno：5和seqidno：6所述的核苷酸序列为引物，以上一个步骤的扩增产物为模板，进行pcr扩增；pcr总体系为25μl，其中10×buffer2.5μl，dntps2μl，ha-f2、ha-r2引物各1μl，taqdna聚合酶0.25μl，模板2μl，余下用灭菌ddh2o补足；反应条件为：95℃预变性3min，然后95℃30s，53℃30s，72℃2min，进行40个循环，最后72℃延伸10min；反应结束后，取6μlpcr产物于1％琼脂凝胶中电泳。电泳结果见图4，从图中可以看出，扩增出禽流感h7n9病毒特异序列条带。

以上描述和显示了本发明的基本原理、主要特征。本领域的专业人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和描述只是说明本发明的基本原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附属的权利要求及其等同物界定。

序列表

<110>甘肃康承动物保健有限公司

<120>一种禽流感病毒检测试剂盒及其检测方法

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tgaatgaagaagctctgaggca22

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ataattagaactcccaactgtc22

<210>3

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tcctggtattcgctctgattgc22

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gctgcttagtttgactgggtca22

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

atgctaaatcccaatgatacag22

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gtgcttttgtaatctgcagca21

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

cgatcgtcctacaagacacag21

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gagtaacttgactatgattgac22