一株杰米拉类芽孢杆菌、其发酵产物与制备方法及应用与流程

本发明属于微生物领域，特别涉及一株杰米拉类芽孢杆菌、其发酵产物与制备方法及应用。

背景技术：

柑橘溃疡病是国内外的一种植物检疫性病害，是由xanthomonasaxonopodispv.citri(xac)地毯草黄单胞柑橘致病变种引起的细菌性植物病害，属于黄单胞杆菌属，是严重危害柑橘生产的主要病害之一。柑橘溃疡病菌主要危害柑橘的枝、叶、果实，最直接的病害症状表现为出现黄色晕圈，两面隆起及火山口状的圆形病斑。果实出现病斑会严重影响柑橘的品质，病害严重时会导致落果、落叶、枝条枯萎从而导致柑橘减产。近年来，柑橘溃疡病的防治主要依赖于化学农药，大量使用农药，不仅对土壤、水环境、生态环境以及人类健康造成危害，而且形成滥用农药的恶性循环，因此研究柑橘溃疡病的绿色防控具有重大意义。生物防治既可以降低对人的危害，也不会使病原菌产生耐药性，生物防治还具有省时、省力、安全低毒等特点，在未来的农业领域中，生物防治具有广阔的应用前景。目前，关于柑橘溃疡病生物防治的生防菌株已经有不少报道，主要有解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、放线菌(actinomyces)和莫哈韦芽孢杆菌(bacillusmojavensis)等，其中枯草芽孢杆菌是迄今为止研究最为深入的一种芽孢杆菌，还可控制多种疫病。

甘蔗黑穗病(sugarcanesmutdisease)由甘蔗鞭黑粉菌(sporisoriumscitanminea)侵染所致，亦称甘蔗鞭黑穗病、黑粉病、灰包病、蔗公等。该病于1877年在南非纳塔尔(natal)的“中国种”甘蔗品种上首先发现并报道，之后数十年里，在非洲和亚洲对该病做了许多观察，至1940年在阿根廷发现甘蔗黑穗病以前，该病仅限于东半球蔗区发生危害，目前该病害已在世界上除新几内亚以外的所有植蔗国或地区发生(参考沈万宽2013，热带作物学报2013，34(10)：2063-2068)。

研究开发新的生物防治资源，对于细菌性植物病害更为经济、有效且环保的防治具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株杰米拉类芽孢杆菌，该菌株为发明人从柑橘苗木根际深5cm地区的土壤中筛选得到，该菌株对柑橘溃疡病菌具有显著的拮抗作用。

本发明的另一目的在于提供所述的杰米拉类芽孢杆菌的发酵产物。

本发明的又一目的在于提供一种生物菌剂。

本发明的再一目的在于提供所述的杰米拉类芽孢杆菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一株杰米拉类芽孢杆菌，命名为paenibacillusjamilaewac199，于2018年10月31日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为gdmccno:60470。

所述的杰米拉类芽孢杆菌的形态学特征如下：菌落灰白色，凸起，不透明，边缘不整齐，革兰氏染色阳性，芽孢中生或偏端生，芽孢呈椭圆形，并且菌体单个或成对排列。

所述的杰米拉类芽孢杆菌的生理生化特征为：

所述杰米拉类芽孢杆菌的16srdna基因特征为：其16srdna序列如seqidno.3的核苷酸序列所示，序列长度为1359bp。

所述的杰米拉类芽孢杆菌的活化培养方法优选为挑取单菌落接种在lb液体培养基或lb固体培养基中，30℃震荡培养12h～36h。

一种发酵产物，通过所述的杰米拉类芽孢杆菌发酵培养得到。

所述的发酵培养的具体方法为：将所述的杰米拉类芽孢杆菌接种至发酵培养基中，150～250rpm，30±5℃培养72h以上，得到发酵产物。

所述的发酵产物优选为发酵上清液。

所述的发酵培养基可以是ypg培养基、ypd培养基、lb肉汤培养基、玉米粉培养基和胰酪大豆胨液培养基中的至少一种，优选为ypg培养基；所述培养基优选为液体培养基；所述培养基的ph值优选为7。

所述的ypg培养基的配方优选为酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，水1000ml，ph为7。

所述的ypg培养基的配方优选为酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml；所述的ypd培养基的配方优选为酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml；所述的lb肉汤培养基的配方优选为lb肉汤培养基30g，蒸馏水1000ml；所述的玉米粉培养基的配方优选为玉米提取物30g，蒸馏水1000ml；所述的胰酪大豆胨培养基的配方优选为胰酪大豆胨液体培养基30g，蒸馏水1000ml。

所述的杰米拉类芽孢杆菌接种量优选为1％。

一种生物菌剂，含有所述的杰米拉类芽孢杆菌、所述的杰米拉类芽孢杆菌的培养物和所述的杰米拉类芽孢杆菌的发酵产物中的至少一种。

所述的杰米拉类芽孢杆菌、所述的杰米拉类芽孢杆菌的培养物和/或所述的杰米拉类芽孢杆菌的发酵产物在防治柑橘溃疡病或甘蔗黑穗病中的应用，所述的杰米拉类芽孢杆菌或其培养物、发酵产物对柑橘溃疡病菌、甘蔗鞭黑粉菌具有显著的拮抗作用。

所述的柑橘溃疡病的病原菌为柑橘溃疡病菌，所述的甘蔗黑穗病的病原菌为甘蔗鞭黑粉菌。

所述的应用的温度优选为85℃以下；ph环境优选为酸性或弱碱性环境，进一步优选为ph2～8。

一种防治柑橘溃疡病的方法，在柑橘植物上施用所述的生物菌剂，使其与柑橘植物共生。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明提供了一株命名为paenibacillusjamilaewac199的杰米拉类芽孢杆菌，对柑橘溃疡病菌、甘蔗鞭黑粉菌均具有显著的抑制作用，在lb平板上的抑菌圈可达15mm。

2.本发明还提供了所述的杰米拉类芽孢杆菌的发酵方法，制备方法简单，易于操作，其发酵产物包括发酵上清液对柑橘溃疡病菌、甘蔗黑穗病均也具有良好的抑菌活性；所述的菌株wac199代谢活性物质的稳定性良好，在较高温度、较宽的ph范围及紫外线照射下均保持较高且稳定的抑菌活性。

3.本发明通过柑橘叶片活体接种试验进一步发现，所述的杰米拉类芽孢杆菌在植物活体上对柑橘溃疡病菌有显著的拮抗作用，能够有效抑制柑橘溃疡病菌的生长和定植，为柑橘溃疡病的生物防治提供更加经济、有效和环保的解决方式，在柑橘溃疡病的防治中具有良好的应用前景。

附图说明

图1是实施例1经过复筛所获得的9株菌株中的2株菌株对柑橘溃疡病菌的抑菌效果照片图；其中，左侧为菌株wac199。

图2是菌株wac199的菌落生长形态照片图。

图3是经革兰氏染色后的菌株wac199菌落形态显微镜照片图。

图4是菌株wac19916srdna的同源序列比较分析结果图。

图5是菌株wac199在不同培养基中对柑橘溃疡病菌抑菌效果的结果分析图。

图6是活体柑橘叶片接种wac199对柑橘溃疡病菌的影响结果照片图。

图7分别是菌株wac199对水稻基腐菌、洋葱伯克氏菌、甘蔗鞭黑粉菌和铜绿假单胞菌的抑菌效果照片图。

图8是菌株wac199的代谢活性物质在不同温度、不同ph环境及不同时长的紫外线照射下的抑菌活性结果分析图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1柑橘溃疡病菌拮抗菌株wac199的筛选

1.含有xacjx-6的lb固体培养基的配制

柑橘溃疡病菌(xanthomonasaxonopodispv.citrijx-6菌株，简称xacjx-6，(该菌株全长序列已在ncbi公开，序列号为cp011827.2)，由华南农业大学农学院群体微生物中心实验室提供。

柑橘溃疡病菌xacjx-6的活化培养基是lb固体培养基，挑取单菌落接种在lb液体培养基中，30℃震荡培养。

将lb固体培养基、xacjx-6菌悬液(od600大约在1左右)在40～50℃的温度下以每50mllb固体培养基加入500μl菌悬液的比例混匀，每皿大约倒12ml混匀后的培养基，即为含有xacjx-6的lb固体培养基。

2.柑橘溃疡病拮抗菌株的筛选

(1)拮抗菌株的初步筛选：取20g湖南省永州市江永县桃川镇柑橘园中柑橘苗木根际深5cm地区的土壤放入方形培养皿中，均匀摊开，在方形培养皿中采用五点法分别在5个点处分别取2g左右的土壤加到50ml无菌水中，200rpm，30℃培养30min；取出放在室温静止10min后，取1ml上清液体于无菌离心管中，将离心管中的1ml液体制成梯度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4等四个梯度稀释液；分别吸取各浓度稀释液150μl，用涂布棒涂于含有jx-6的lb固体培养基上，28℃培养3天后，观察有无抑菌圈。将有抑菌圈的菌落接种到含有1mllb液体培养基的24孔板中，30℃，200rpm过夜培养至菌液浑浊，用接种环蘸取菌液于lb培养皿上划线纯化，放入30℃培养箱中培养24h，进行后期的复筛实验。

(2)拮抗菌株的复筛：根据菌落形态、颜色、透明度和光滑度等特征，挑取纯化后培养特征相异的单菌落接种到含有1mllb液体培养基的24孔板中，30℃，200rpm过夜培养至菌液浑浊，制成菌悬液备用；用平板打孔培养法，用直径为5mm的打孔器在含有jx-6的lb固体培养基上打孔，取10μl菌悬液注入孔中，30℃培养48h后，观察有无抑菌圈以及抑菌效果。

实验结果：本实施例通过平板打孔法，共筛到9株对柑橘溃疡病菌具有拮抗作用的菌株对柑橘溃疡病菌的抑菌效果进行研究，部分抑菌效果如图1所示，选择其中一株具有较大抑菌圈的菌株，将其命名为wac199，该菌株抑菌圈直径达15mm(图1左侧抑菌圈)，图1右侧为前述筛选得到的9株生防菌中的其中一株菌株的抑菌结果。

实施例2柑橘溃疡病菌拮抗菌株wac199的鉴定

1.菌株的形态学特征观察

将保存的拮抗菌株wac199接种于lb平板上，30℃培养24h～36h，观察菌落特征。wac199在lb培养基培养生长良好，菌落灰白色，凸起，不透明，边缘不整齐，革兰氏染色阳性，芽孢中生或偏端生，芽孢呈椭圆形，并且菌体单个或成对排列，其生长形态和经革兰氏染色后用显微镜观察后的形态分别如图2、图3所示。

2.16srdna序列分析

将保存的拮抗菌株wac199接种于lb平板上，30℃培养24h～36h，采用细菌单菌落直接扩增pcr的方法，用16srdna通用引物f27：5'-agagtttgatcatggctcag-3'，r1492：5'-tacggttaccttgttacgactt-3'进行pcr扩增，获得约1500bp的dna片段，扩增产物送往广州擎科生物技术有限公司进行测序。得到的16srdna序列如下所示(seqidno.3)：

cgacttcgggtgttgtaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaagacccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcaattccgacttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaccggcttttctaggattggctccacctcgcgatttcgcttcccgttgtaccggccattgtagtacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctgcttagagtgcccagcttgacctgctggcaactaagcataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtctcctctgtcccgaaggaaaggtctatctctagaccggtcagagggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatactccactgcttgtgcgggtccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggaatgcttaatgtgttaacttcggcaccaagggtatcgaaacccctaacacctagcattcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagcgtcagttacagcccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatatctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagctccccagtttccagtgcgacccgaagttgagcctcgggattaaacaccagacttaaagagccgcctgcgcgcgctttacgcccaataattccggacaacgcttgccccytacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccggggctttcttctcaggtaccgtcactcttgtagcagttactctmcaagacgttcttccctggcaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgttccgtcaggctttcgcccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtttcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtaggcctttaccccaccaactagttaatgcgccgcaggcccatccacaagtgacagattgctccgtctttcctccttctcccatgcaggaaaaggatgtatcgggtattagctaccgtttccggtagttatccctgtcttgtgggcaggttgcctacgtgttactcacccgtccgccgctaggttaatt

在ezbiocloud上进行同源性比对，选取5株同源性较高的菌株，结果如图4所示，根据比对结果，wac199的16srdna测序结果序列与paenibacillusjamilae(杰米拉类芽孢杆菌)的同源性达99.56％，初步确定为杰米拉类芽孢杆菌(paenibacillusjamilae)。

3.生理生化特征分析

参照《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰细菌鉴定手册》对生防菌株wac199进行生理生化试验检测，其生理生化特征与paenibacillusjamilae(杰米拉类芽孢杆菌)最相似，因此确定wac199菌株属于杰米拉类芽孢杆菌，具体实验结果如表1所示：

表1wac199菌株生理生化特征

注：“+”表示阳性；“-”表示阴性

实施例3柑橘溃疡病菌拮抗菌株wac199最佳产代谢活性物质的培养基筛选

分别配制如下液体培养基：

(1)nyd液体培养基：牛肉膏8g，酵母提取物3g，葡萄糖1g，蒸馏水1000ml；

(2)ypg液体培养基：酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml；

(3)ypd液体培养基：酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml；

(4)lb液体培养基：酵母提取物5g，蛋白胨20g，nacl20g，蒸馏水1000ml、

(5)lb肉汤液体培养基：lb肉汤培养基(海博生物技术有限公司，产品货号：hb0128)30g，蒸馏水1000ml；

(6)玉米粉液体培养基：玉米浸粉(海博生物技术有限公司，产品货号：hbyl004)30g，蒸馏水1000ml；

(7)胰酪大豆胨液体培养基：胰酪大豆胨液体培养基，海博生物技术有限公司，产品货号：hb4114-19)30g，蒸馏水1000ml。

调节上述液体培养基的ph值至7.0左右，按1％比例将wac199分别接种到10ml各培养液中，200rpm，30℃恒温振荡连续培养72h，分别在各种培养液中取出1ml，12000rpm，离心15min，采用平板打孔培养法，在含有jx-6的lb固体培养基平板上打3个孔，每个孔加入10μl待测样品，30℃恒温培养箱培养48h，测量抑菌圈大小，研究菌株wac199在不同培养基中产抑菌活性物质的情况，实验设置三个重复。

实验结果如图5所示，结果显示ypg培养基是最佳产代谢活性物质的培养基。

实施例4柑橘溃疡病菌拮抗菌株wac199的柑橘叶片接种试验

为了检测拮抗菌株wac199在室外的拮抗效果，本实施例进行了柑橘叶片的活体接种试验。将拮抗菌株wac199单菌落接种于lb液体培养基中，30℃，200rpm培养至od600为0.6左右，取2ml菌悬液，12000rpm，离心1min，弃部分上清，剩余200μl的上清液重悬菌体，得到wac199菌悬液；将xacjx-6单菌落接种于lb液体培养基中，30℃，200rpm下培养至od600为0.6左右，取2ml菌悬液，12000rpm，离心1min，弃部分上清，剩余200μl的上清液重悬菌体，得到xac菌悬液。以叶脉为分界线，在一个叶片上设置无菌水阴性对照，wac199菌阴性对照，xac+水(1:1)实验组以及xac+wac199(1:1)实验组。每个实验组取6μl菌液置于不带针头的注射器顶端，在叶片背面用压力将四组样品分别注入到叶片内，经过7～10天后，观察wac199的防治效果。该实验重复三次，接种最终效果如图6所示。由图6结果可知无菌水和wac199阴性对照组没有黄色凸起的病斑和晕圈症状，证明阴性对照没有感染；从xac+水(1:1)实验组以及xac+wac199(1:1)实验组对比可以看出，xac+wac199(1:1)实验组的黄色凸起病斑和晕圈较xac+水(1:1)实验组明显减小，表明wac199菌株可以有效抑制xacjx-6在柑橘叶片上的扩展，所以本发明的杰米拉类芽孢杆菌wac199菌株接种柑橘叶片，可以有效抑制柑橘溃疡病菌的侵染；同时使用数码相机对叶片进行拍照后，使用adobephotoshop中photoshop的叶片相对病斑面积快速测定方法计量xac+水的阳性对照发病面积以及xac+wac199处理叶片发病面积，利用公式(处理发病面积-阳性对照发病面积)/处理发病面积×100，算出该生防菌的抑菌率约为46.56％。

实施例5wac199的抗菌谱实验

1.供试的病原菌株

参试的植物病原菌包括洋葱伯克氏菌(burkholderiacenocepaciah111，genbank:hg938372.1)、甘蔗鞭黑粉菌(sporisoriumscitamineassc39b，genbank:cp010913.1)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosapao1，ncbireferencesequence:nc_002516.2)、水稻基腐菌(dickeyazeaeec1，genbank:cp006929.1)均由华南农业大学农学院群体微生物中心实验室提供。

2.供试病原菌株的培养

(1)铜绿假单胞菌、洋葱伯克氏菌先在lb固体培养基(酵母提取物5g，蛋白胨20g，nacl20g，蒸馏水1000ml，agar15g)上培养得到单菌落，然后挑取单菌落至lb液体培养基上37℃供试培养；

(2)水稻基腐菌先在lb固体培养基上培养得到单菌落，然后挑取单菌落至液体培养基上30℃供试培养；

(3)甘蔗黑粉菌先在yeps固体(酵母提取物10g，蛋白胨20g，蔗糖20g,蒸馏水1000ml，agar20g)培养基上培养得到单菌落，然后挑取单菌落至yeps液体培养基上30℃培养。

3.柑橘溃疡病拮抗菌株wac199对其他病原菌株的防效实验

分别用供试菌株的最适液体培养基，参照步骤2将洋葱伯克氏菌和水稻基腐、甘蔗黑粉菌、铜绿假单胞菌制成菌悬液(od600大约在1左右)，供试菌株的最适固体培养基参照实施例1步骤1的含有xacjx-6的lb固体培养基的方法分别配制含有洋葱伯克氏菌的lb固体培养基、含有水稻基腐菌的lb固体培养基、含有甘蔗黑粉菌的yeps固体培养基、含有铜绿假单胞菌的lb固体培养基，采用平板打孔培养法，在每个平板上打3个孔，每个孔加入10μlwac199的菌悬液(制备方法同实施例4)，30℃恒温培养箱培养48h，观察抑菌效果，从而测定拮抗菌株wac199菌抑菌谱。结果如图7所示，根据结果，wac199还对甘蔗黑粉菌(basidiomycetes)有较为显著的抑制效果。

实施例6柑橘溃疡病拮抗菌株wac199代谢活性物质稳定性检测

将wac199按1％比例接种到50ml实施例3筛选确定的ypg液体培养基，200rpm，30℃恒温振荡连续培养72h，8000rpm离心20min，取发酵上清液体进行以下实验，实验设置3个重复，采用平板打孔培养法。

1.耐热性：取上述发酵上清液于离心管中，分别在45℃、65℃、85℃和100℃水浴处理1h，以室温处理的上述发酵上清液为对照，各个处理的样品10μl点在含有xacjx-6的lb固体培养基上，30℃培养48h，测量抑菌圈的大小。

2.ph值稳定性：取上述发酵上清液于离心管中用稀释的hcl和naoh将发酵上清液ph分别调至2、4、6、8和10，室温放置24h，期间来回振荡几次，以室温处理的上述发酵上清液为对照，各个处理的样品10μl点在含有xacjx-6的lb固体培养基上，30℃培养48h，测量抑菌圈的大小。

3.紫外线敏感性：取上述发酵上清液于培养皿中，敞口放置在超净工作台上，放置于紫外灯处，分别照射5min、10min、20min和40min，以不进行紫外线照射处理的上述发酵上清液为对照，各个处理的样品10μl点在含有xacjx-6的lb固体培养基上，30℃培养48h，测量抑菌圈的大小。

结果如图8所示。由柱状图分析比较得知，随着温度升高到85℃后，发酵滤液的抑菌活性下降，但是抑菌活性变化较小，说明代谢的活性物质较耐高温(图8-a)；ph为6时，菌株发酵滤液对柑橘溃疡病菌的抑制活性最强和室温条件下一致，当ph达到10时，抑菌活性下降较明显，证明该生防菌株的抑菌活性在酸性条件下更强(图8-b)；紫外线对抑菌活性物质的活性影响不大，在照射40min后，其抑菌活性基本不变，说明该菌株对紫外线的耐性较好(图8-c)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南农业大学

<120>一株杰米拉类芽孢杆菌、其发酵产物与制备方法及应用

<160>3

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