4-(4-氯苯基)-5-(4-氯苯基)-4H-1,2,4-三氮唑-3-胺及其应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，特别是一种4-(4-氯苯基)-5-(4-氯苯基)-4h-1,2,4-三氮唑-3-胺及其应用。

背景技术：

据2018年最新全球癌症数据显示，有1700多万新增癌症病例，和950万癌症死亡病例。其中发病率及死亡率最高的均为肺癌。传统的癌症治疗药物是以天然药物提取为先导物进行结构修饰以开发研究新药的。而近年来，对于合成的靶向用药得到了人们的关注，其中最为关注的就是氨基三唑类结构，氨基三唑结构具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗菌等多种生物活性。尤其是抗癌研究中，已报导其具有抑制多种肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡等多种作用机制。因此，氨基三唑类结构成为了一个研究热点。

肺癌治疗方法主要为手术治疗和化疗；目前常用的化疗药物包括顺铂、5-氟尿嘧啶、巯嘌呤、羟基脲、紫杉醇、二氢叶酸还原酶抑制剂、奥沙利铂、长春碱、塞莱昔布等药物。但目前的药物在临床应用的过程中常常出现一些毒副作用，使其在治疗过程中会引起其他脏器不同程度的损伤，且其疗效也由于机体耐药性使其疗效越来越不显著。为了改善治疗效果，降低其药物毒性，需要新的结构特征和新的作用的机理的新型化合物出现。

本发明深入开发4h-1,2,4-三氮唑-3-胺衍生物的抗肿瘤活性，成功发现了一种抗肺癌活性较强的4-(4-氯苯基)-5-(4-氯苯基)-4h-1,2,4-三氮唑-3-胺（bcta）。

技术实现要素：

本发明对于上述现有技术的不足，提供了一种4-(4-氯苯基)-5-(4-氯苯基)-4h-1,2,4-三氮唑-3-胺及其可用盐，用于有效治疗肺癌。

本发明的第二个目的是提供含有4-(4-氯苯基)-5-(4-氯苯基)-4h-1,2,4-三氮唑-3-胺及其可用盐的药物组合物。

本发明的第三个目的是提供4-(4-氯苯基)-5-(4-氯苯基)-4h-1,2,4-三氮唑-3-胺及其可用盐在制备治疗肺癌药物中的应用。

本发明是以如下方式实现：本发明提供了由下列化合物（i）表示的4-(4-氯苯基)-5-(4-氯苯基)-4h-1,2,4-三氮唑-3-胺及其可用盐：

（i）。

本发明的化合物为由化合物（i）表示的化合物及其可药用酸的加成盐。

上述的酸包括：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、抗坏血酸、甲磺酸、樟脑酸、草酸。

本发明的化合物是通过以下步骤制备的：

1、结构式ii为起始物质：

(ii)

2、化合物ii在乙醇溶液中与4-氯苯胺反应，得到化合物iii：

（iii）

3、化合物iii的在四氢呋喃中与五硫化二磷反应，得到化合物iv：

(iv)

4、在四氢呋喃中，化合物iv与1.2倍量的水合肼，回流反应1.5h；反应结束后，将反应液倒入冷水中，将白色析出过滤，得化合物v：

(v)

5、在四氢呋喃中，化合物v与溴化氰反应，反应完成后经柱层析分离，得到由结构式i表示的化合物。

反应路线如下：

路线1.(a)edci,dmap,naoh,c2h5oh,refluxing;(b)p2s5,thf,refluxing;(c)n2h4·h2o,thf,refluxing;(d):naoh,brcn,thf,60^oc。

本发明的4-(4-氯苯基)-5-(4-氯苯基)-4h-1,2,4-三氮唑-3-胺及其可用盐作为有效成分，和常规药用载体可制成常规制剂，制备成适合口服、非肠道（静脉或皮下）和鼻内途径给药的片剂或糖衣片剂、舌下片剂、胶囊剂、明胶胶囊、栓剂、霜剂、软膏剂、皮肤用凝胶剂、可注射制剂或可使用悬浮剂等剂型。

本发明的4-(4-氯苯基)-5-(4-氯苯基)-4h-1,2,4-三氮唑-3-胺及其可用盐可用于制备治疗肺癌的药物。

采用上述技术方案的积极效果：本发明的4-(4-氯苯基)-5-(4-氯苯基)-4h-1,2,4-三氮唑-3-胺及其可用盐，具有抑制癌细胞生长活性（抗癌活性），从而使得它们可用作治疗恶性肿瘤。通过对比试验表明，化合物bcta对正常细胞的毒性低于对照药物5-氟尿嘧啶（5-fu），同时能够诱导人肺a549细胞的凋亡的作用，而且其诱导凋亡作用要明显的好于5-fu。因此，该化合物可用于制备治疗肺癌的药物，为抗癌药物的研发提供了新的思路。

附图说明

图1为荧光显微镜观察细胞凋亡与坏死情况图；

图2为图1的定量分析图；

图3为流式细胞术检测细胞凋亡情况图；

图4为图3的定量分析图；

图5为化合物bcta对a549、nci-h460、nci-h23和imr-90的ic50。

具体实施方法

下面通过实施例和试验例，结合反应路线对本发明的技术方案做进一步说明，但不应理解为对本发明的限制，其中，实施例用于说明化合物的制备以及治疗肺癌药物的制备，试验例用于说明本发明的化合物的药理作用及相对于其他治疗肺癌药物的优越性。

实施例1：n-(4-氯苯基)(4-氯)苯甲酰胺（iii）的制备：

将4-氯苯胺（6.35g,50mmol）、4-氯苯甲酸（7.8g,50mmol）、n,n-二甲基吡啶（6.1g,50mmol）和氢氧化钠（2g,50mmol）溶于乙醇（95%,100ml），搅拌，加热回流，反应约1h。其中4-氯苯胺、4-氯苯甲酸、n,n-二甲基吡啶和氢氧化钠的摩尔比为1:1:1:1；将反应液倾入冷水中，反应液与冷水的比例为2:1，有白色物质析出，静置，抽滤得到白色粉末，即为酰胺类化合物（iii），收率86%。

实施例2：n-(4-氯苯基)硫代(4-氯)苯甲酰胺（iv）的制备：

将制备例1制得的n-(4-氯苯基)(4-氯)苯甲酰胺（5.3g,20mmol）和五硫化二磷（2.66g,12mmol）溶于四氢呋喃（50ml）中，加热回流5h后，反应液经减压蒸除溶剂（40^oc）。将反应残渣溶于水（30ml），以二氯甲烷萃取（2×30ml），合并收集有机层，以适量无水硫酸钠干燥30min，减压蒸除溶剂得黄色固体，即为n-(4-氯苯基)硫代(4-氯)苯甲酰胺（iv），收率53%。

实施例3：n-(4-氯苯基)-n’-(4-氯苯基)苯甲咪（v）的制备：

将制备例2制得的n-(4-氯苯基)硫代(4-氯)苯甲酰胺（1.41g,5mmol）溶于四氢呋喃（30ml），加入水合肼（85%，0.35g,6mmol）（中间体v与水合肼的摩尔比为1:1.2，为避免副产物，应在中间体v完全溶解后，加入水合肼），搅拌并缓慢加热至回流，反应约1.5h，停止加热，将反应液倾入冷水中（30ml），经减压抽滤得到白色固体，即为-(4-氯苯基)-n’-(4-氯苯基)苯甲咪（v），收率85%。

实施例4：4-(4-氯苯基)-5-(4-氯苯基)-4h-1,2,4-三氮唑-3-胺（i）的制备：

将制备例3制得的n-(4-氯苯基)-n’-(4-氯苯基)苯甲咪（0.56g,2mmol）和氢氧化钠（0.08g,2mmol）溶于四氢呋喃（30ml），再加入溴化氰（1.2g,2mmol）搅拌均匀，60^oc反应16h，反应完成后减压蒸除溶剂（40^oc），所得固体混合物经硅胶柱层析分离（硅胶200-300目，展开剂用乙酸乙酯），得4-(4-氯苯基)-5-(4-氯苯基)-4h-1,2,4-三氮唑-3-胺（i），收率71%。

m.p.247-248^oc;¹h-nmr(300mhz,cdcl3),δ:4.76(s,2h,-nh2),7.21-7.53(m,8h,ar-h),¹³c-nmr(300mhz,cdcl3),δ:125.38,128.58,128.85,128.88,130.86,132.14,135.53,136.20,148.95,154.80.esi-msm/z307(m+2),308(m+3)。

试验例1：抗肺癌细胞药理实验（mtt）

将结构i所代表的化合物bcta、阳性对药物5-fu进行细胞毒性检测。

接种细胞：选用对数生长期细胞，经胰酶消化后用含有10%胎牛血清dmem培养基调整细胞浓度至5×10⁴/ml，按照每孔100µl细胞悬液接种在96孔培养板中，37^oc,5%co2培养24h。

药物处理：弃掉旧的培养基，加入199µl1%的培养基饥饿处理2h，每孔加入1µl药物，处理24h(终浓度：化合物为30µmol/ml，10µmol/ml，3µmol/ml，1µmol/ml，0.3µmol/ml。阳性药物以相同浓度梯度的5-fu进行处理；对照孔加入含等体积溶媒的培养基，37^oc，5%co2培养24h。

染色反应：每孔加入5mg/ml的mtt溶液15µl，37^oc培养箱中染色4h。

显色反应：弃染液，加入100µl，dmso溶解，37^oc微型振荡10min。酶标仪测定od490nm值，计算化合物半数抑制浓度(ic50)。ic50值越小表明药物对肿癌细胞的抑制活性越高。

化合物bcta、5-fu对三种肺癌细胞a549、nci-h460、nci-h23和正常肺细胞imr-90的抑制试验结果如表1所示。其中a549为人非小细胞肺癌细胞系，nci-h460为大细胞肺癌细胞株，nci-h23为人非小细胞肺癌细胞，imr-90为人胚肺成纤维细胞。

如图5所示，利用本发明的制备方法合成的化合物bcta，对a549、nci-h460和nci-h23的半数抑制浓度（ic50）分别1.09，2.01和3.28μm，ic50值越小表明药物对肿癌细胞的抑制活性越高。药理结果表明，化合物bcta对三种肺癌细胞的抑制活性要明显好于对照药5-fu。同时，5-fu对正常肺细胞imr-90的ic50值为135.47μm，而化合物bcta对正常肺细胞imr-90的ic50值大于200μm，表明化合物bcta对正常细胞的毒性低于对照药物5-fu。

试验例2：hoechst/pi染色，荧光显微镜下观察bcta对肺癌细胞a549的凋亡作用

接种细胞：选用对数生长期细胞，经胰酶消化后用含有10%胎牛血清dmem培养基，调整细胞浓度至1×10⁴/ml每孔接种在12孔培养板中，37^oc,5%co2培养24h；

药物处理：加入制备的化合物bcta或对照药物5-fu，用1µm的浓度处理人肺癌a549细胞0，3，6，12，24h;

以上经bcta或5-fu处理后的细胞，用pbs洗涤2次，加入195µlhoechst/pi结合液，再加入5µlhoechst轻轻混匀；

加入10µl碘化丙啶(propidiumiodide,pi)染色液，轻轻混匀；

室温(20-25℃)避光孵育15min；

在荧光显微镜下观察细胞的形态及颜色的改变，蓝色荧光为hoechst染色阳性细胞，红色荧光为pi阳性细胞。仅被蓝色荧光染色，且体积较小的细胞为凋亡细胞；被红色或蓝色和红色双染，且体积较大的细胞为坏死细胞；未被染色的细胞为正常细胞。随机观察200个细胞，求得各种细胞所占的百分比，每个样本计数3次取平均。

如图1所示，细胞经5-fu处理，观察pi染色结果，在3h和6h，细胞未出现明显死亡；在12h和24h，出现大面积的细胞死亡。观察hoechst的染色结果，在0-12h间变化不大，在24h时，蓝色区明显变小，表明细胞大量的死亡，和pi染色结果一致。细胞经bcta处理，观察pi染色结果，在3h和6h，出现少量细胞凋亡或死亡；在12h和24h，逐渐出现大面积的细胞凋亡或死亡。观察hoechst的染色结果，在3h、6h和12h，变化不明显；在24h，蓝色区明显变亮变大，说明凋亡细胞细胞膜的完整性被破坏，因此进入凋亡细胞中的hoechst比正常细胞的多；此外，凋亡细胞的染色体dna的结构发生了改变，从而使hoechst能更有效地与dna结合，以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将hoechst排出到细胞外，使之在细胞内积累增加。以上的结果表明，bcta能够诱导人肺a549细胞的凋亡。

如图2所示，在3h和6h，5-fu和bcta对肿瘤细胞的损伤没有明显的区别；而在12h和24h，bcta对肿瘤细胞的损伤作用要明显好于5-fu。

试验例3：annexin-v/pi流式细胞仪检测化合物bcta对肺癌细胞a549的凋亡作用

接种细胞：选对数生长期细胞，经胰酶消化后用含有10%胎牛血清dmem培养基，调整细胞浓度至1×10⁴/ml每孔接种在12孔培养板中，37^oc,5%co2培养24h；

药物处理：加入制备的化合物bcta或对照药物5-fu，用1µm的浓度处理人肺癌a549细胞0，3，6，12，24h;

以上经bcta或5-fu处理后的细胞，用pbs洗涤2次，加入195µlannexinv/pi结合液，再加入5µlannexinv轻轻混匀；

加入10µl碘化丙啶(propidiumiodide,pi)染色液，轻轻混匀；

室温(20-25℃)避光孵育15分钟；

利用流式细胞仪检测bcta对人肺癌细胞a549的凋亡诱导作用。

对肺癌a549细胞进行annexin-v/pi染色后，通过流式细胞仪检测，结果如图3所示，上左区一般认为是死亡细胞，上右区认为是晚期凋亡细胞，下左区为正常细胞，下右区为早期凋亡细胞。图3和4表明，5-fu和bcta诱导肺癌细胞凋亡的作用呈剂量依赖性；比较同一时间点两者之间的差异，bcta引起的细胞凋亡数要明显的多于5-fu，说明bcta对肿瘤细胞的诱导凋亡作用要明显的好于5-fu，和mtt实验数据结果一致。

本发明涉及医药技术领域，特别是一种4-(4-氯苯基)-5-(4-氯苯基)-4h-1,2,4-三氮唑-3-胺及其应用。本发明提供了由下列化合物（i）表示的4-(4-氯苯基)-5-(4-氯苯基)-4h-1,2,4-三氮唑-3-胺及其可用盐：

（i）。

本发明的4-(4-氯苯基)-5-(4-氯苯基)-4h-1,2,4-三氮唑-3-胺及其可用盐可用于制备治疗肺癌的药物。本发明的4-(4-氯苯基)-5-(4-氯苯基)-4h-1,2,4-三氮唑-3-胺及其可用盐，具有抑制癌细胞生长活性（抗癌活性），从而使得它们可用作治疗恶性肿瘤。通过对比试验表明，化合物bcta对正常细胞的毒性低于对照药物5-氟尿嘧啶（5-fu），同时能够诱导人肺a549细胞的凋亡的作用，而且其诱导凋亡作用要明显的好于5-fu。