一种提高铜绿假单胞菌检测准确性方法与流程

本发明属于化妆品微生物检测领域，具体涉及一种提高铜绿假单胞菌检测准确性的pma-qpcr检测方法及试剂盒。
背景技术：
：铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)是一种革兰阴性的条件致病菌，广泛分布于自然界的空气、水和土壤中，化妆品营养丰富，在生产和使用过程中很容易受到污染，不仅使产品质量下降，更严重的是损害消费者的健康，因此，对化妆品中铜绿假单胞菌的检测至关重要。但是，该菌与大多数非芽孢细菌一样，在外界不良环境的刺激下(如低温、消毒剂或防腐剂)，可进入一种活的非可培养状态(viablebutnon-culturable，vbnc)，该种状态的细菌在传统培养基上丧失繁殖能力，常规平板培养法无法检出，但其致病力和毒力仍然存在，同时，vbnc细菌仍有呼吸、转录和蛋白合成等代谢活性，一旦条件允许，其可重新繁殖生长，从而引起不可预测的微生物安全风险，威胁消费者的健康。因此，建立铜绿假单胞菌vbnc状态菌的有效监测方法，对化妆品微生物安全具有重要的意义。目前，随着分子生物学的快速发展，pcr技术已广泛应用于各行业的微生物安全监测中，其具有耗时短、特异性强、灵敏度高的优点，但是常规pcr技术是检测样品中所有的细菌数，包括活细菌、死菌或受损菌。技术实现要素：本发明的目的是提供一种能够检测铜绿假单胞菌vbnc状态细菌的提高铜绿假单胞菌检测准确性的方法。本发明采用低温使铜绿假单胞菌进入vbnc状态，采用热处死的方法使铜绿假单胞菌活死菌同时存在的状态，采用pma-qpcr技术来选择性检测铜绿假单胞菌的数量，并与传统方法比较，建立一种提高铜绿假单胞菌检测准确性的pma-qpcr检测方法，从而实现了本发明的目的。本发明的提高铜绿假单胞菌检测准确性的方法，其特征在于，包括以下步骤：配制样品备检溶液、向样品备检溶液中加入叠氮溴化丙锭进行反应，反应完毕后提取细菌总dna，再用实时荧光定量pcr检测铜绿假单胞菌。所述的用实时荧光定量pcr检测铜绿假单胞菌是针对铜绿假单胞菌oprl基因进行实时荧光pcr检测。所述的向样品备检溶液中加入叠氮溴化丙锭进行反应优选为加入叠氮溴化丙锭的终浓度为5.0～15.0mg/l，混匀后25℃避光反应15min，取出置于冰上，500～750w的卤素灯照射15min，光照距离为20～30cm；光照反应结束后，收集菌体。所述的样品备检溶液是按每取10g化妆品样品加入10g灭菌吐温-80和80ml灭菌生理盐水，震荡混匀，制成1:10的样品备检溶液。所述的针对铜绿假单胞菌oprl基因进行实时荧光pcr检测，其在实时荧光pcr检测中的引物对为：oprl-f：5’-agcagccactccaaagaaacc-3’，具体核苷酸序列如seqidno.1所示；oprl-r：5’-ccagagcttcgtcagccttg-3’，具体核苷酸序列如seqidno.2所示；优选，所述的实时荧光pcr检测的反应体系包括：premixextaq10μl，10μmol/l的上、下游引物各0.3μl，50×dye0.4μl，dna模板1μl，ddh2o8μl。优选，所述的实时荧光pcr检测的反应程序为：94℃30s,94℃5s,60℃30s，40个循环，于60℃进行荧光信号检测。本发明的第二个目的是提供一种检测铜绿假单胞菌的检测引物对：oprl-f：5’-agcagccactccaaagaaacc-3’，具体核苷酸序列如seqidno.1所示；oprl-r：5’-ccagagcttcgtcagccttg-3’，具体核苷酸序列如seqidno.2所示。本发明的第三个目的是提供一种检测检测铜绿假单胞菌的检测试剂盒，其包括上述检测铜绿假单胞菌的检测引物对。本发明的第四个目的是提供上述方法在化妆品中铜绿假单胞菌检验中的应用。本发明具有以下优点：(1)准确性好。本发明采用铜绿假单胞菌pcr技术+pma可检出传统方法无法检出的vbnc细菌，同时加入pma可有效避免死菌和受损菌dna扩增，由于vbnc细菌丧失了在平板培养基上的繁殖能力，传统平板培养法无法检出，而本发明是通过扩增细菌dna的方法检测细菌数量，无需细菌具有繁殖能力，因此，本发明比传统方法检测准确性高。(2)特异性强、灵敏度高、稳定性好。本发明的实时荧光pcr引物组是针对铜绿假单胞菌的基因oprl设计的，可特异性扩增铜绿假单胞菌；其检测灵敏度也较高，检测限(lod)为25cfu/ml，标准曲线线型回归系数r2为0.997；重复实验结果表明相对标准偏差(rsd)在0％-2％之间，提示实验重复性好，结果稳定、可靠。附图说明图1：铜绿假单胞菌实时荧光pcr特异性；图2：铜绿假单胞菌荧光定量pcr标准曲线；图3：铜绿假单胞菌活死菌混合状态的qpcr与pma-qpcr方法比较。具体实施方式下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施方式。这些实施方式是为了能够更好地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员，但并不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例1一、菌株铜绿假单胞菌pseudomonasaeruginosa(atcc9027，对应图1中的atcc9027)、大肠杆菌escherichiacoli(atcc8739，对应图1中的atcc8739)、2株污染铜绿假单胞菌(编号166和176，分别对应图1中的166和176)，洋葱伯克霍尔德氏菌(编号188，对应图1中的188)(burkholderiacepacia)均购于广东省微生物菌种保藏中心。二、方法1、特异性实验将5个菌株复苏后，培养至对数生长期，采用细菌基因组提取试剂盒分别提取5株细菌的总dna，以双蒸水为阴性对照，应用引物组oprl-f/oprl-r(表1)进行荧光定量pcr扩增。荧光定量pcr总反应体系为20μl，包括：qpcrsupermix10μl，正反向引物(10μmol/l)各0.3μl和dye(50×)0.4μl，模板dna1μl，ddh2o补足至20μl。扩增条件：94℃30s，94℃5s，60℃30s，40个循环，在60℃收集荧光信号，在反应的最后添加溶解曲线。表1铜绿假单胞菌oprl基因引物组引物名称引物序列(5’-3’)oprl-f5’-agcagccactccaaagaaacc-3’oprl-r5’-ccagagcttcgtcagccttg-3’2、灵敏度实验及标准曲线绘制将培养过夜的铜绿假单胞菌用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，用平板法检测菌液浓度，并提取细菌基因组dna，参照特异性实验中的引物组(oprl-f/oprl-r)、反应体系和反应条件进行qpcr检测，并根据结果绘制标准曲线。3、重复性实验为验证qpcr方法的稳定性，取10倍梯度稀释的铜绿假单胞菌菌悬液提取的dna作为模板，进行批内和批间的重复性qpcr实验(pcr引物、反应体系和反应条件参见特异性实验)。批内重复性实验为在同一实验中每个稀释度做3个重复对照，批间重复性实验为进行3次独立重复试验，并比较ct值，计算rsd值。4、铜绿假单胞菌活死菌混合状态的qpcr与pma-qpcr方法比较配制一定浓度的铜绿假单胞菌菌悬液，分装至三个离心管，编号为a、b、c，a管在80℃下水浴2min，b管在80℃下水浴1min，c管不处理，分别用无菌生理盐水对菌液进行10倍梯度稀释，取稀释后的样品1ml，加入灭菌平皿中，倒入55℃的tsa培养基，轻轻摇匀，待冷却后，置于37℃培养箱培养24h后计数，每个梯度做三个平行对照，并设置生理盐水空白对照。pma反应：取990μl的a、b、c管菌悬液，每管做四个平行对照，分别加入10μl浓度为1.0g/ml的pma溶液，使pma终浓度为10mg/l，充分混匀后，25℃避光反应15min，取出置于冰上，500w卤素灯照射15min，光照距离为20cm；光照反应结束后，10000rpm离心5min，收集菌体。细菌基因组dna提取：严格按照细菌基因组dna提取试剂盒进行。实时荧光pcr检测：参照特异性实验中的引物组、反应体系和反应条件进行实时荧光pcr检测。数据处理：采用统计软件进行单因素方差分析pma处理前后ct值的差异。5、vbnc状态铜绿假单胞菌的诱导与检测将铜绿假单胞菌接种至tsa培养基上培养过夜后配制铜绿假单胞菌菌悬液，测od600在0.1左右，取1ml用平板计数，将菌悬液置于4℃30天、60天、90天后采用平板培养法进行检测,每个冷藏时期做3个平行，并参照方法4中的pma-qpcr法进行检测。三、结果1、实时荧光pcr特异性用优化后的pcr方法，对标准铜绿假单胞菌，两株污染铜绿假单胞菌和其余参考菌(大肠杆菌、洋葱伯克霍尔德氏菌)进行检测，结果显示，仅有铜绿假单胞菌有特异性扩增曲线，其余参考菌株和阴性对照均没有荧光信号，结果表明，oprl基因引物组特异性良好，与其他菌株无交叉反应。(图1)2、实时荧光pcr灵敏度和标准曲线根据平板计数结果，铜绿假单胞菌过夜培养物的浓度为2.5×108cfu/ml，经实时荧光pcr检测后铜绿假单胞菌的稀释度依次从2.5×108cfu/ml～2.5×10cfu/ml，结果显示其检测限(lod)为25cfu/ml，以菌液浓度的对数值为横坐标，循环数ct值为纵坐标，建立标准曲线(图2)，标准曲线线型回归系数r2为0.997。3、实时荧光pcr重复性对铜绿假单胞菌的系列稀释度在同一次试验和3次不同试验间获得的ct值进行统计，批内相对标准偏差(rsd)在0％-2％之间，批间rsd在0％-3％之间，表明，所建立的实时荧光pcr试验具有良好的重复性。(表2)表2重复性试验结果4、铜绿假单胞菌活死菌混合状态的qpcr与pma-qpcr方法比较未经热处理的铜绿假单胞菌浓度为2.5×107cfu/ml；热处理1min后，平板计数铜绿假单胞菌浓度为3.0×103cfu/ml；热处理2min后，平板计数铜绿假单胞菌浓度为0。经过qpcr和pma-qpcr检测，未经pma处理的结果经方差分析得出p>0.05，经过pma处理后的结果经方差分析得出p<0.05，说明经过处理后的ct值差异有统计学意义，结果表明，pma-qpcr法可将活菌和死菌区分出来，因此，pma-qpcr法检测结果更加准确。(图3)5、vbnc状态铜绿假单胞菌的检测利用传统平板培养法和实时荧光pcr法对vbnc状态细菌进行检测，结果显示，铜绿假单胞菌在低温保存下90天后可进入vbnc状态，此项实验可证明pma-qpcr法可检出vbnc菌，优于传统平板法。(表3)表3不同冷藏时期铜绿假单胞菌的检测(cfu/ml)以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。序列表<110>广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）<120>一种提高铜绿假单胞菌检测准确性的方法<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1agcagccactccaaagaaacc21<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ccagagcttcgtcagccttg20当前第1页12