一种检测凡纳滨对虾的EHP病原的引物及试剂盒和方法与流程

本发明涉及一种ehp病原的检测方法，具体涉及一种检测凡纳滨对虾的ehp病原的引物及试剂盒和方法。

背景技术：

虾肝肠胞虫(enterocytozoonhepatopenaei,ehp)是一种高传染性的胞内寄生微孢子虫，主要感染包括凡纳滨对虾(litopenaeusvannamei)在内的主要对虾养殖品种，是世界对虾养殖业中最主要的病害之一。ehp主要感染对虾的肝胰腺组织，感染对虾后ehp在肝胰腺内产生成熟孢子，随粪便排出体外，进而继续感染其它对虾。感染ehp后的对虾主要表现出生长缓慢、大小规格参差不齐，并且感染ehp后的对虾对其它病原变的易感，发病严重的对虾最终死亡。因此，ehp感染给对虾养殖业带来巨大经济损失。

凡纳滨对虾是中国乃至全世界最主要的对虾养殖品种之一，仅仅凡纳滨对虾一个品种就占国内的海水养殖对虾产量80％以上。目前，针对凡纳滨对虾的ehp检测手段，包含病理学、免疫诊断、探针杂交、pcr技术等。其中pcr技术由于简便易操作、准确性较高的特点被认为是进行凡纳滨对虾ehp检测最佳方法之一，常规的pcr技术能够对病原进行定性检测，而荧光定量pcr技术，能够对病原进行定量检测。

但是，普通荧光定量pcr需要单独对内参和病原进行两次反应，这种操作一方面需要花费更长时间用于实验，另一方面，由于两次操作之间的差异，可能造成实验误差，对结果的准确性有一定影响。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测凡纳滨对虾的ehp病原的引物及试剂盒和方法，该方法解决了现有荧光定量pcr需要单独对内参和病原进行两次反应的问题，能够进行双重荧光定量pcr，将内参与待检测样品放入同一个反应中进行，去除了两次反应的不稳定因素，提高了结果的可靠性。

为了达到上述目的，本发明提供了一种扩增凡纳滨对虾的18srrna基因的引物，该引物包含：具有如sedidno.1所示核苷酸序列的上游引物，及具有如sedidno.2所示核苷酸序列的下游引物。

本发明还提供了一种荧光探针，该探针针对所述的扩增凡纳滨对虾的18srrna基因的引物，具有如sedidno.3所示的核苷酸序列。

优选地，该探针采用vic荧光基团和bhq1淬灭基团标记。

本发明还提供了一种扩增凡纳滨对虾的ehp病原swp基因的引物，该引物包含：具有如sedidno.4所示核苷酸序列的上游引物，及具有如sedidno.5所示核苷酸序列的下游引物。

本发明还提供了一种荧光探针，该探针针对所述的扩增凡纳滨对虾的ehp病原swp基因的引物，具有如sedidno.6所示的核苷酸序列。

优选地，该探针采用fam荧光基团和bhq1淬灭基团标记。

本发明还提供了一种定量检测凡纳滨对虾的ehp病原的试剂盒，该试剂盒包含：具有如sedidno.1所示核苷酸序列的上游引物、具有如sedidno.2所示核苷酸序列的下游引物、具有如sedidno.4所示核苷酸序列的上游引物、具有如sedidno.5所示核苷酸序列的下游引物、具有如sedidno.3所示核苷酸序列的探针一、及具有如sedidno.6所示核苷酸序列的探针二。

优选地，该试剂盒还包含：premixextaq(probeqpcr)(2×)、roxreferencedyeii(50×)。

本发明还提供了一种定量检测凡纳滨对虾的ehp病原的方法，该方法包含：

将提取的凡纳滨对虾组织dna作为待检测样品；

将pcr反应体系于pcr反应管中，放入荧光定量pcr仪内，设置反应时间，进行双重pcr反应；

所述pcr反应体系包含：具有如sedidno.1所示核苷酸序列的上游引物、具有如sedidno.2所示核苷酸序列的下游引物、具有如sedidno.4所示核苷酸序列的上游引物、具有如sedidno.5所示核苷酸序列的下游引物、具有如sedidno.3所示核苷酸序列的探针一、具有如sedidno.6所示核苷酸序列的探针二、premixextaq(probeqpcr)(2×)、roxreferencedyeii(50×)，以及样品。

所述样品为待检测样品、标准品、阴性对照或空白对照；所述标准品包括：已知浓度含凡纳滨对虾18srrna基因的质粒和含ehpswp基因的质粒，该标准品同时作为阳性对照；所述阴性对照包含：健康凡纳滨对虾组织提取的dna；所述空白对照包含：水。

其中，凡纳滨对虾18srrna基因作为内参。

当阳性对照和内参都有产物扩增，空白对照都无产物扩增，阴性对照只有凡纳滨对虾18srrna基因产物扩增、无ehpswp基因产物扩增时，表明pcr反应正常；若待检测样品有ehpswp基因产物扩增，表明检测结果为阳性，若待检测样品无ehpswp基因产物扩增，表明检测结果为阴性；根据标准曲线和产物对应ct值做线性回归，得到所述待检测样品中ehp病原含量。

优选地，所述凡纳滨对虾组织dna的提取包含：取待检测的凡纳滨对虾，取出肝胰腺组织，加入裂解液，将肝胰腺组织充分研磨，加入蛋白酶k，混匀后水浴，加入苯酚，以获得凡纳滨对虾组织dna。

本发明的检测凡纳滨对虾的ehp病原的引物及试剂盒和方法，解决了现有荧光定量pcr需要单独对内参和病原进行两次反应的问题，具有以下优点：

(1)本发明的方法避免了常规的荧光定量pcr方法把内参和待检测病原分为两个反应进行的情况，将内参与待检测样品放入同一个反应中进行，去除了两次反应的不稳定因素，使待检测样品与内参比对结果可靠性提高；

(2)本发明的方法避免了常规的荧光定量pcr方法把内参和待检测样品分为两个反应进行的情况，能够将内参与待检测样品在一个反应中完成，将原先的实验周期缩短一半；

(3)本发明的方法，其灵敏度较高，能检出的阳性样品最低浓度为1×10²copy/μl；

(4)本发明方法防污染能力强，与常规pcr相比，本发明在pcr扩增后无需将pcr反应管打开进行后续操作，避免pcr扩增后的阳性产物外泄造成污染。

附图说明

图1为根据标准品pcr扩增结果制作的标准曲线。

图2为双重pcr扩增曲线图。

图3标准品(阳性对照)、阴性对照、空白对照、阳性样品、阴性样品所对应的扩增曲线。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1检测凡纳滨对虾ehp实验

(1)dna提取

配置裂解液，其组分为：tris-hcl100mm(ph8.0)，edta50mm，sds(十二烷基硫酸钠)0.5％。

取待检测凡纳滨对虾的肝胰腺，研磨碎后，取100mg，加入400μl上述裂解液，将肝胰腺组织充分研磨，加入蛋白酶k80μg，充分混匀后55℃水浴1h，加入400μl苯酚，轻轻摇动10min，12000r/min离心10min，取上清，加入400μl苯酚-氯仿(1:1)混匀，12000r/min离心10min，取上层水相，加入400μl氯仿混匀，12000r/min离心10min，取上层水相，加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇混匀，12000r/min离心10min，保留沉淀，用400μl-20℃预冷的75％浓度乙醇洗涤沉淀2次，室温晾干后加入50μl超纯水，得到提取的dna。

(2)双重荧光定量pcr

将含有部分凡纳滨对虾18srrna基因的质粒和含有部分ehpswp基因的质粒统一稀释成1×10⁸copy/μl浓度，两种质粒混合，梯度稀释成1×10⁷copy/μl、1×10⁶copy/μl、1×10⁵copy/μl浓度，用于作为标准品，同时也是阳性对照。

配置荧光定量pcr反应体系，反应体系内包含：premixextaq(probeqpcr)(2×)10μl、引物18srrna-f(10μm)0.4μl、引物18srrna-r(10μm)0.4μl、引物ehp-f(10μm)0.4μl、引物ehp-r(10μm)0.4μl、探针18srrna-probe(10μm)0.4μl、探针ehp-probe(10μm)0.4μl、roxreferencedyeii(50×)0.2μl、待检测样本dna(200ng/μl)1μl或上述混合质粒(作为标准品和阳性对照)1μl或健康凡纳滨对虾组织提取的dna(200ng/μl)(作为阴性对照)1μl或超纯水(作为空白对照)1μl，超纯水补足至20μl。其中，premixextaq(probeqpcr)(2×)、roxreferencedyeii(50×)购自takara公司。

其中，各引物和探针的核苷酸序列具体如下：

引物18srrna-f(上游引物一)的核苷酸序列为：

agcaggctggtttttgctta(sedidno.1)；

引物18srrna-r(下游引物一)的核苷酸序列为：

gttccgaaaaaccgacaaaa(sedidno.2)；

探针18srrna-probe(探针一)的核苷酸序列为：

cccgaatggtcgtgcatgga(sedidno.3)；

引物ehp-f(上游引物二)的核苷酸序列为：

gcggcacaattctcaaacat(sedidno.4)；

引物ehp-r(下游引物二)的核苷酸序列为：

tcctacaaatgctgtgtctgtg(sedidno.5)；

探针ehp-probe(探针二)的核苷酸序列为：

tcaccattggtcaaatacaatttcaaaca(sedidno.6)。

上述探针18srrna-probe采用vic荧光基团和bhq1淬灭基团来标记，标记后的探针为：

vic-cccgaatggtcgtgcatgga-bhq1。

上述探针ehp-probe采用fam荧光基团和bhq1淬灭基团来标记，标记后的探针为：

fam-tcaccattggtcaaatacaatttcaaaca-bhq1。

荧光定量pcr仪器使用abi7500型，反应程序设置如下：95℃预变性30s，1个循环；95℃5s，60℃34s，40个循环。

荧光定量pcr反应结束后，阳性对照(混合质粒)和内参(待检测样品的凡纳滨对虾18srrna基因)都有pcr扩增产物，空白对照(超纯水)都无pcr扩增产物，阴性对照(健康凡纳滨对虾组织提取的dna)只有凡纳滨对虾18srrna基因的pcr扩增产物、无ehpswp基因的pcr扩增产物，可以证明实验操作无误。

扩增的标准品和阳性对照的18srrna基因片段序列(sedidno.7)为：

agcaggctggtttttgcttacagcccgaatggtcgtgcatggaatgatggaacaggacctcggttctattttgtcggtttttcggaac。

扩增的标准品和阳性对照的ehpswp基因片段序列(sedidno.8)为：

gcggcacaattctcaaacattttcaccattggtcaaatacaatttcaaacactgtaaaccttaaagcattaaaaagagacgatatttacacagacacagcatttgtagga。

待检测样品有ehpswp基因产物扩增，说明检测结果阳性，根据标准曲线和产物对应ct值(每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)做线性回归可得待检测样品中ehp病原含量。

待检测样品无ehpswp基因产物扩增，说明检测结果阴性。

如图1所示，为根据标准品pcr扩增结果制作的标准曲线(上方曲线为凡纳滨对虾18srrna基因对应的标准曲线，下方曲线为ehpswp基因对应的标准曲线，c0是标准品的浓度)。

如图2所示，为同一个样本的双重pcr扩增曲线图(图中，上部峰为凡纳滨对虾18srrna基因的扩增曲线(作为内参)；下部峰为ehpswp基因的扩增曲线(阳性)，rn为荧光信号强度)。

如图3所示，为标准品(即阳性对照)、阴性对照、空白对照、阳性样品和阴性样品所对应的扩增曲线，其中，阳性样品检测结果为阳性，阴性样品检测结果为阴性。

本发明的方法的灵敏度较高，能检出的阳性样品最低浓度为1×10²copy/μl，且将原先的实验周期缩短一半。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。