本发明涉及生物科技技术领域，具体为提取引进奶牛粪便样本dna分析预测其健康和免疫力水平方法。
背景技术：
肠道正常菌群对维持牛的生长和健康至关重要，能帮助宿主抵抗致病微生物以及调节免疫应答等。肠道菌群组成受多种因素的影响，其中包括生存环境的改变，平衡一旦被打破，宿主机体可能会错误地攻击自身细胞和组织，导致免疫性疾病患病率增加，影响宿主健康。如因发现不及时或治疗不当，甚至会导致奶牛死亡，造成养殖业巨大经济损失。近些年来，肠道菌群成为研究的热点。
目前，肠道微生物检测方法主要有两种：16s扩增子以及宏基因组。16srdna编码基因序列共有10个保守区和9个高可变区，通过对9个高可变区测序分析，可做细菌多样性分析。宏基因组则将样本中所有微生物的基因全部测序，测序数据经过拼接后，与参考菌群数据库比对并注释，进而进行细菌多样性分析及代谢通路分析。
尽管肠道微生物对宿主患病风险已有诸多研究和文献报道，但绝大多数研究仍处在实验室层面，很难形成商业产品的转化。与实验室研究不同，商业产品需要解决用户在家便捷采样、样本稳定保存、缩短运输时间以及测序和数据分析时间及成本。其中，选择合适的肠道微生物检测方式就是挑战之一。虽然宏基因组检测方法可以捕捉到样本中所有可能存在的微生物，但是相比较16s扩增子来说，宏基因组物种注释信息仅在属水平上多于16s扩增子，而16s扩增子可在门、纲、目、科、属水平上获得更多信息。除此之外，宏基因组检测方法测序成本高、测序时间长、计算复杂等均导致该方法很难在商业中应用。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明的目的在于提供提取引进奶牛粪便样本dna在引进奶牛肠道微生态预测其健康和免疫力水平，为兼顾成本和检测精度，通过扩增16srdna高可变区，基于高通量二代测序检测粪便样本中16srdna，计算肠道菌群多样性及丰度，分析肠道菌群构成，实现预测其健康和免疫力水平。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
提取引进奶牛粪便样本dna预测其健康和免疫力水平，包括以下步骤：
s1：用户提出申请项目检测；
s2：对用户信息进行审核，并向用户寄送样本检测器；
s3：用户收到样本检测器，进行粪便样本采集、样本绑定和问卷填写；
所述的样本收集包括引进(不足半年)和早期引进(引进半年以上)的奶牛粪便样本，整个样本的采集在常温下进行；
s4：用户将粪便样本快递寄回公司的样本检测中心，运输过程采用干冰冷冻；
s5：公司样本检测中心进行dna提取，建立数据库；
所述的dna提取采用试剂盒纯化提基因组dna技术；
s6：利用测序平台illumimamiseq测序仪进行进行可变区测序，得到原始下机数据；
s7：采用qiime软件对原始下机数据进行分析，具体方法包括：
s701：原始数据预处理：去除样本接头序列，并将双端测序序列拼接成单条序列，根据barcode序列区分不同样本序列，过滤低质量序列；
s702：otu(操作分类单元)分类和统计：采用聚类方法，按照序列97％的相似性阈值将序列划分为不同otu，每个otu被视为一个微生物物种，并使用silva数据库进行物种注释，此外，对每个样本测序数量和otu数目进行统计；
s703：多样性分析：分析每个样本的alpha多样性(chaol，ace，shannon，simpson)；
s704：细菌群落结构及丰度：包括各分类水平上(门，纲，目，科，属，种)的细菌群落结构及丰度；
s8：肠道菌群多样性及丰度分析，并生成检测报告；
s9：将检测报告以电子版形式发送到用户手机端，便于查看报告。
所述报告内容包括引进奶牛肠道菌群多样性及丰度、菌群结构、菌群之间比例、功能预测，以及根据报告给出的引进奶牛饲喂建议。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明公开了提取引进奶牛粪便样本dna分析预测其健康和免疫力水平方法，首次提出通过肠道菌群多样性及丰度这一指标预测引进奶牛健康和免疫力水平，基于二代高通量测序技术，扩增粪便样本16srdna高可变区，计算肠道菌群多样性及丰度，分析肠道菌群构成，实现预测其健康和免疫力水平。其采样便捷、分析速度快、成本低，且评估结果与现有研究一致，使预测引进奶牛健康和免疫力水平成为可能。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
步骤一、样本收集：养殖场提出检测请求后，会收到相关的粪便样本采集器，每头牛一个，收集3头引进不足半年的奶牛的粪便样本，分别编号为xzjs1、xzjs2、xzjs3，3头引进半年以上的奶牛的粪便样本，分别编号为syjs1、syjs2、syjs3，并详细记录每头引起奶牛的引进月份信息，将粪便装入含有保存液的采集管中，快递方式寄回样本中心，整个样本的采集均在常温下进行，干冰运输。
步骤二、建立数据库与可变区测序：采用试剂盒dna纯化技术提取粪便中细菌dna，建立数据库；
测序片段：测序平台illumimamiseq测序仪对16s可变区进行测序，得到原始下机数据。
步骤三：测序数据分析：对原始下机数据采用qiimeⅱ(version1.8.0)软件进行分析；具体步骤包括：
(1)原始数据预处理：取原始下机数据利用重叠关系将双末端测序得到的成对reads组装成一条序列，得到拼接序列即原始tags数据(rawtags)；使用trimmomaticv0.33软件，对拼接得到的rawtags进行过滤，得到高质量的tags数据(cleantags)；使用uchimev4.2软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据(effectivetags)。
(2)otu(操作分类单元)分类和统计：采用聚类方法，使用qiime(version1.8.0)中的uclust软件对tags在97％的相似性阈值将序列划分为不同otu，每个otu被视为一个微生物物种，并使用silva(细菌)分类学数据库对otu进行物种注释，此外，对每个样本测序数量和otu数目进行统计。
(3)多样性分析：使用mothur(versionv.1.30)软件，对样品alpha多样性指数进行评估，分析每个样本的alpha多样性，alpha多样性(alphadiversity)是对单个样品中物种多样性的分析，能反映样品内细菌群落的丰富度和多样性包括chao指数、ace指数，shannon指数以及simpson指数。
对2组引进奶牛肠道微生物alpha多样性分析，发现2组间α多样性指数有所不同，根据microsoftexcel2017版软件数据分析进行方差分析显示2组间有显著差异，具体结果如表1所示。
表1样品alpha多样性指数
可以看出，xzjs肠道菌群的丰富度指数chao1指数和ace指数均显著性高于syjs(p<0.05)，且多样性指数shannon指数和simpson指数均显著性高于syjs(p<0.05)。由此可以看出，xzjs组肠道菌群alpha多样性高于syjs组，其丰度和多样性也均高于syjs组。
(4)细菌群落结构及丰度：利用qiime软件生成不同分类水平上(门，纲，目，科，属，种)的细菌的物种丰度表，再利用r语言工具绘制成样品各分类学水平下的群落结构图及组间物种差异分析图；
为了确定2组各肠道微生物物种组成及丰度，根据样品门分类水平物种分类表表2显示，在门水平上，syjs组肠道菌群优势菌门为厚壁菌门(firmicutes，48.4％)、拟杆菌门(bacteroidetes，33.1％)、变形菌门(proteobacteria，14.5％)、螺旋体门(spirochaetes，1.5％)和柔壁菌门(tenericutes，1.1％)，占相对丰度的98.7％；xzjs组肠道菌群优势菌门为厚壁菌门(firmicutes，56.8％)、拟杆菌门(bacteroidetes，37.6％)、柔壁菌门(tenericutes，1.2％)和螺旋体门(spirochaetes，1.0％)，占相对丰度的96.6％。厚壁菌门(firmicutes)和拟杆菌门(bacteroidetes)的比值被认为是肠道菌群组成的重要的指标，拟杆菌门具有降解碳水化合物以及蛋白质的功能，并且能够补充宿主基因组，参与降解具有抗性的纤维素，果胶，和木聚糖等食物，拟杆菌门的丰度还能反映肠道微生物的定植抗力。在xzjs和syjs的肠道菌群中，厚壁菌门(firmicutes)和拟杆菌门(bacteroidetes)均为优势菌门，syjs和xzjs中厚壁菌门(firmicutes)和拟杆菌门(bacteroidetes)的比值分别为1.46和1.51，以syjs为健康奶牛的标准，而xzjs的比值与标准值略有差异。
表2样品门分类水平物种分类表
为了确定2组间肠道微生物物种组成及丰度差异性，根据microsoftexcel2017版软件数据分析进行方差分析。
根据样品属分类水平物种分类表表3显示，在属水平上，syjs组肠道菌群丰度大于1％的菌属为琥珀酸弧菌属(succinivibrio，14.0％)、普雷沃菌属(prevotella，9.3％)、5-7n15(4.8％)、罗氏菌属(roseburia，4.5％)、cf231(3.8％)、梭菌属(clostridium，2.7％)、粪球菌属(coprococcus，1.8％)、考拉杆菌属(phascolarctobacterium，1.6％)、密螺旋体属(treponema，1.5％)、布劳特氏菌属(blautia，1.2％)、颤螺菌属(oscillospira，1.2％)；xzjs组肠道菌群丰度大于1％的菌属为cf231(5.2％)、颤螺菌属(oscillospira，4.1％)、梭菌属(clostridium，4.0％)、5-7n15(3.7％)、粪球菌属(coprococcus，1.4％)、瘤胃球菌属(ruminococcus，1.2％)、普雷沃菌属(prevotella，1.1％)、密螺旋体属(treponema，1.0％)。
表3样品门分类水平物种分类表
如表3所示，在属水平上，syjs组和xzjs组肠道菌群的结构组成和丰度有显著性差异，xzjs组与syjs组肠道菌群相比颤螺菌属(oscillospira)丰度显著升高(p＜0.05)，布劳特氏菌属(blautia)、罗氏菌属(roseburia)丰度极显著降低(p＜0.01)，考拉杆菌属(phascolarctobacterium)丰度显著降低(p＜0.05)。考拉杆菌属(phascolarctobacterium)产短链脂肪酸；罗氏菌属(roseburia)产丁酸盐；布劳特氏菌属(blautia)具有抗炎症的特性。机体免疫反应可通过免疫细胞(如treg细胞)和肠道菌群产生的短链脂肪酸(如醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐)来调节，免疫细胞的生成又可被短链脂肪酸调节，通过调节还可促进t细胞分化成treg细胞。xzjs组与syjs组肠道菌群相比考拉杆菌属(phascolarctobacterium)、罗氏菌属(roseburia)、布劳特氏菌属(blautia)丰度极显著降低，有益菌考拉杆菌属(phascolarctobacterium)和罗氏菌属(roseburia)丰度的降低导致肠道中短链脂肪酸产生量减少；布劳特氏菌属(blautia)丰度的降低影响到了肠道稳态、肠道损伤恢复以及肠道健康。胃肠道机能下降、机体出现炎症可能性升高，从而影响到机体健康水平和免疫力的下降，从而确定奶牛的健康状况。
步骤四、用户报告推送：根据上述的测序分析，整合分析引进奶牛肠道微生物数据，即可生成报告；报告内容包括xzjs组与syjs组两组引进奶牛肠道菌群多样性，检测到的菌属以及每种菌属的丰度、菌群结构、菌群之间比例、功能预测，重要菌属如何影响引进奶牛健康，蛋白质、脂质、碳水化合物代谢能力，以及根据报告给出的引进奶牛饲喂建议，得出检测报告后，将其以电子版形式发送到用户手机端或电子邮箱中。
综上所述：本发明提出通过肠道菌群预测引进奶牛健康和免疫力水平，肠道菌群对维持机体健康有重要作用，生存环境的改变导致肠道菌群的改变，可能会错误地攻击自身细胞和组织，导致免疫性疾病患病率增加，影响宿主健康。肠道菌群群落结构可反应引进奶牛的健康和免疫力水平，本发明经过实验研究和数据分析，采集引进(不足半年)和早期引进(引进半年以上)的奶牛粪便样本，基于高通量二代测序技术，通过扩增16srdna高可变区的方法，计算肠道菌群多样性及丰度，分析肠道菌群构成，实现预测其健康和免疫力水平。其采样便捷、分析速度快、成本低，且评估结果与现有研究一致，使消费级肠道微生物检测成为可能。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。