一种靶向EpCAM的嵌合抗原受体及其应用的制作方法

本发明涉及细胞免疫治疗技术领域，尤其涉及一种靶向epcam的嵌合抗原受体及其应用。

背景技术：

上皮细胞黏附分子(epthelialcelladhesionmolecule，epcam),又称为cd326，是一种40kd的跨膜糖蛋白。其在多种肿瘤组织中特异性表达，而在正常组织中，其表达仅限于上皮细胞的基底侧，从而其顶侧是不可接触的。epcam在多种上皮细胞来源的肿瘤中高表达，包括多种腺癌，例如结肠、胃、胰腺、肺、卵巢、乳腺等。epcam作为信号传导分子，其下游激活wnt信号通路，从而调控膜内蛋白的裂解，进而导致肿瘤的发生。在肿瘤组织中，epcam的表达从基底层改变为在细胞膜表面均匀表达，从而使其更容易在细胞或者抗体疗法中作为靶点。

最近，epcam被鉴定为循环肿瘤细胞(ctc)和癌症干细胞(csc)的表面标志物。ctc被认为是原代肿瘤细胞转移至其它位置的潜在前体细胞，其可以入侵到血液循环系统，从而转移到其它组织。基于epcam阳性细胞的ctc捕获技术已经在多种肿瘤类型中应用，尤其是乳腺癌。而csc细胞由于维持癌症细胞的干性和表型的多样性，被认为是清除癌症的关键靶细胞。epcam在多种癌症的干细胞上表达，包括乳腺癌，结肠癌，胰腺癌和前列腺癌等。csc对于化疗和放疗均高度抵抗，从而使得epcam靶向疗法在肿瘤治疗中成为热点。而通过靶向epcamcar-t治疗在恶性实体瘤领域中更是具有更好的疗效和更广阔的应用前景，但目前关于靶向epcam的car分子及car-t细胞的报道确较为罕见。

技术实现要素：

基于现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种epcam特异性嵌合抗原受体(car)，这种car分子含有人源化的单链抗体序列，其优势如下：一方面其减小靶向epcam抗原的car分子中scfv序列的免疫原性，延长car-t细胞在体内的存活时间，减小发生过敏的风险；另外一方面，该car分子的本底激活水平更低，从而其在体内应用过程中安全性更高，存活能力更强。本发明还验证了其在实体瘤治疗中的潜在应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种靶向epcam的嵌合抗原受体，包括胞外识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号区，所述胞外识别区为抗-epcam抗体。

为了进一步优化上述嵌合抗原受体，本发明所采取的技术措施还包括：

进一步地，所述抗-epcam抗体为人源化抗体mocf，具体为：识别epcam的人源化单链可变区抗体mocf；其中，所述抗-epcam人源化抗体mocf通过将本领域已知epcam抗体序列moc31(seqidno.1)经过人源化改造而来。更进一步地，所述mocf的氨基酸序列如seqidno.3所示。

进一步地，所述铰链区为cd8hinge区域。更进一步地，所述cd8hinge区域的氨基酸序列如seqidno.4所示。

进一步地，所述跨膜区选自cd8跨膜区、cd28跨膜区、icos跨膜区中的任一个。更进一步地，所述cd8跨膜区的氨基酸序列如seqidno.5所示，所述cd28跨膜区的氨基酸序列如seqidno.6所示，所述icos跨膜区的氨基酸序列如seqidno.7所示。

进一步地，所述胞内信号区包含cd28、4-1bb、icos、cd3ζ中的至少一个。更进一步地，所述cd28的氨基酸序列如seqidno.8所示，所述4-1bb的氨基酸序列如seqidno.9所示，所述icos的氨基酸序列如seqidno.10所示，所述cd3ζ的氨基酸序列如seqidno.11所示。

进一步地，基于以上epcam特异性car分子的结构，所述epcam嵌合抗原受体为mocf-icosbbz，其胞外识别区为mocf，铰链区为cd8hinge区域，跨膜区为icos，胞内信号区为icos/4-1bb/cd3ζ。更进一步地，所述mocf-icosbbz的氨基酸序列如seqidno.13所示。

可以理解的是，也可根据本领域适用的其他结构来组成epcam嵌合抗原受体。进一步地，在不同的car分子中，其跨膜区可相同，也可不同；其胞内信号区可相同，也可不同。

本发明的第二个目的是提供一种编码任一上述的epcam特异性嵌合抗原受体的核酸。

进一步地，编码所述mocf-icosbbz的核酸序列如seqidno.15所示。

本发明还涉及mocbscfv做为参照抗体序列，所述mocbscfv的氨基酸序列如seqidno.2所示，由其构建的mocb-icosbbz嵌合抗原受体的氨基酸序列如seqidno.12所示，编码mocb-icosbbz嵌合抗原受体的核酸序列如seqidno.14所示。

上述car分子的氨基酸序列及其编码核酸序列如下表所示：

本发明的第三个目的是提供一种含有上述核酸的重组表达载体。

进一步地，所述重组表达载体包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或质粒等；更进一步地，原始重组表达载体为慢病毒。在一具体实施方式中，所使用的载体为慢病毒载体。car慢病毒载体质粒在辅助包装质粒pspax2和vsv-g包膜质粒pmd2.g存在的情况下，共转染hek293t细胞，即可包装为带有car分子的慢病毒。

本发明的第四个目的是提供一种含有上述重组表达载体的宿主细胞。

进一步地，所述宿主细胞为t细胞、nk细胞、nkt细胞或含有t细胞、nk细胞、nkt细胞的细胞群。

本发明的第五个目的是提供一种上述宿主细胞的构建方法，其包括重组表达载体的构建步骤、重组表达载体的包装步骤以及将重组表达载体转导至宿主细胞的步骤。

本发明的第六个目的是提供上述epcam特异性嵌合抗原受体，上述核酸，上述重组表达载体以及上述宿主细胞在制备人类实体瘤治疗药物中的应用。

进一步地，所述人类实体瘤主要包括结直肠癌、食管癌、胆管癌、胰腺癌等。

进一步地，所述应用为一种epcam特异性的car-t细胞，其通过慢病毒介导的转导使得t细胞带有epcam特异性car，从而赋予了t细胞识别epcam分子的能力，并靶向epcam阳性的人类肿瘤。

在一个具体实施方式中，将epcamcar-t细胞与高表达epcam的肿瘤细胞系h1650及低表达epcam的肿瘤细胞系a549共孵育，结果显示epcamcar-t细胞能够在靶细胞的刺激下大量的产生ifn-γ及il2；但是却不能在与epcam低表达的细胞系a549共孵育时产生ifn-γ及il2；同时t细胞不能够大量产生ifn-γ及il2。该实施例说明了该epcamcar-t细胞具有良好的特异性靶向性，能够在epcam刺激下将t细胞杀伤功能激活，且mocf-icosbbz体外杀伤epcam阳性肿瘤细胞的活性优于mocb-icosbbz；而mocf-icosbbz在非杀伤靶细胞的静息状态下，其本底水平的细胞因子产生低于mocb-icosbbz，说明其在临床应用中具有更好的安全性和体内存活能力。

在另一个具体实施方式中，证明了在一定的效靶比(car-t细胞：靶细胞)下，epcamcar-t细胞能够有效的杀伤epcam阳性的肿瘤细胞；但是t细胞不能够有效杀伤靶细胞。该实施例说明了epcamcar-t能够在体外能够有效的裂解epcam阳性的肿瘤细胞。

在另一个具体实施方式中，基于epcam阳性肺癌细胞系h1650构建了nod-scid免疫缺陷鼠皮下移植肿瘤模型。使用上述epcamcar-t细胞mocf-icosbbz治疗该荷瘤小鼠，结果说明mocf-icosbbz细胞可以有效清除epcam阳性肿瘤细胞，但是对照t细胞组中肿瘤不断长大。

与现有技术相比，本发明所述的技术方案具有以下有益效果：

本发明采用人源化抗体，其相比传统的鼠源的scfv具有更低的免疫原性，以此为基础制备的car-t细胞在体内产生hama效应的可能性更小，其在体内存留时间可能更长；采用上述人源化抗体制备的car-t细胞mocf-icosbbz相较于之前发表的mocb-icosbbz，其本底水平细胞因子释放更低，临床应用中安全性会更好；通过靶向肿瘤细胞表面的epcam蛋白并激活t细胞下游的信号通路，赋予t细胞杀伤带有epcam靶点肿瘤细胞的能力，可高效特异的治疗epcam阳性肿瘤。

附图说明

图1为本发明一实施例中epcam特异性嵌合抗原受体(car)分子结构的说明示意图；

图2为本发明一实施例中流式细胞术检测mocf/mocb-car转导t细胞转导效率的结果示意图；

图3为本发明一实施例中不同肿瘤细胞系中epcam表达水平的示意图；

图4为本发明一实施例中epcamcar-t细胞杀伤epcam靶细胞后ifn-γ及il2分泌情况的示意图；

图5为本发明一实施例中epcamcar-t细胞体外杀伤epcam靶细胞的结果示意图；

图6为本发明一实施例中epcamcar-t细胞在小鼠体内增殖的结果示意图。

图7为本发明一实施例中epcamcar-t细胞小鼠体内杀伤epcam阳性移植肿瘤后的生存曲线示意图。

具体实施方式

本发明涉及一种靶向epcam的嵌合抗原受体，包括识别区，铰链区，跨膜区，胞内信号区，所述胞外识别区序列为识别epcam的人源化单链可变区抗体mocf，其氨基酸序列如seqidno.3所示；具体地，所述嵌合抗原受体包括如seqidno.13所示的氨基酸序列。本发明还涉及编码上述嵌合抗原受体的相关应用及其制备方法。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例一

本实施例为靶向epcam的嵌合抗原受体分子的构建，其包括以下步骤：

首先基于靶向epcam的单克隆抗体moc31，进行人源化改造。人源化改造通过本领域的常规cdr区移植方法进行，参见文献(jonespt,dearph,footej,etal.replacingthecomplementarity-determiningregionsinahumanantibodywiththosefromamouse.nature.1986may29-jun4；321(6069):522-5.；sandhujs.arapidprocedureforthehumanizationofmonoclonalantibodies.gene.1994dec15；150(2):409-10.)。通过将moc31的cdr区移植进入同源性较高的人源可变区的框架区中，得到人源化抗体命名为mocf。并将其序列改造为单链可变区序列mocfscfv；同时使用来源于论文中的epcam单链可变区序列mocbscfv做为参照抗体序列(angwx,liz,chiz,etal.intraperitonealimmunotherapywithtcellsstablyandtransientlyexpressinganti-epcamcarinxenograftmodelsofperitonealcarcinomatosis.oncotarget.2017feb21；8(8):13545-13559.doi:10.18632/oncotarget.14592.)。之后基于mocf或者mocb构建了靶向epcam的car分子，其结构为第三代car结构，其依次由cd8的信号肽，mocf或者mocbscfv，cd8铰链区，icos跨膜区和icos胞内区，4-1bb胞内区，cd3ζ胞内区依次串联组成，其结构示意图如图1所示。分别称为mocf-icosbbz或者mocb-icosbbz。将mocf-icosbbz或者mocb-icosbbz分子构建在慢病毒载体phage-ef1a-mcs上，克隆位点为noti/clai，构建为克隆phage-ef1a-mocf-icosbbz或者phage-ef1a-mocb-icosbbz。

实施例二

本实施例为mocf/mocb-icosbbzcar-t细胞的构建，其包括以下步骤：

car慢病毒的包装：首先使用qiagen无内毒素大提质粒试剂盒分别提取构建的慢病毒质粒phage-ef1a-mocf-icosbbz、phage-ef1a-mocf-icosbbz及慢病毒系统辅助包装质粒pmd2.g和pspax2。在转染前一天将1.8×10e7293t铺至t175培养瓶中。转染前1小时将293t细胞培养基换为30ml无血清培养基。使用磷酸钙沉淀法将质粒共转染到293t细胞中，转染后24小时将细胞培养基换为60ml完全培养基dmem+10％fbs。转染后48小时收取细胞上清，并加入60ml新鲜完全培养基。72小时再次收取细胞上清，弃去细胞。将收取的细胞上清5000g离心3min以去除杂质，之后使用0.45um滤膜过滤，随后40000g离心4小时，沉淀病毒，使用0.1mlpbs重悬病毒，检测病毒滴度。放置-80℃冻存备用。

t细胞转导：提前一天包被retronectin、抗人cd3及cd28抗体在6孔板中，4℃过夜，用前pbs洗两次备用。采用常规方法采血并分离pbmc，使用stemcellt细胞分选试剂盒分选t细胞，计数，将获得t细胞按1×10e6/ml密度重悬在含有5％人ab血清和100iu/ml白细胞介素-2的x-vivo15培养基中，置入包被的培养板培养。开始培养以后24小时，加入5ug/ml的polybrene并按moi3加入相应慢病毒(mocf-icosbbz，mocb-icosbbz)，混匀，37℃感染24小时。然后离心收集细胞沉淀，更换为5％人ab血清和100iu/ml白细胞介素-2的x-vivo15培养基培养。后续培养通过补加培养基将细胞保持在1×10e6/ml密度，72小时后利用流式细胞术检测scfv表达以检测car分子转导效率。car-t-mocf-icosbbz及car-t-mocb-icosbbz使用proteinl/pe-sa检测。如图2所示，观察到car-t-mocf-icosbbz及car-t-mocb-icosbbz的阳性率大约在55％-75％，t细胞作为对照细胞。

实施例三

本实施例为epcam靶细胞鉴定及epcamcar-t细胞活性的测定。

epcam靶细胞的鉴定：为了检测epcamcar-t是否能够有效杀伤肿瘤细胞，首先鉴定了不同肿瘤细胞表面epcam的表达，结果显示，肺癌细胞系h1650高表达epcam，而肺癌细胞系a549表面不表达epcam，结果如图3所示。

ifn-γ及il2分泌实验：在96孔板中将mocf-icosbbz、mocb-icosbbz两种car-t细胞及对照t细胞三种效应细胞与靶细胞h1650及对照靶细胞a549以5:1效靶比混合。在37℃培养24小时，之后使用标准elisa方法检测上清中ifn-γ及il2的表达。结果如图4所示，当mocf-icosbbz及mocb-icosbbz两种效应细胞与h1650靶细胞共培养时，car-t细胞会大量分泌ifn-γ及il2，并且二者的分泌量相当，但mocf-icosbbz本底释放量只有mocb-icosbbz本底释放量的三分之一或更低，说明本发明所构建的mocf-icosbbzcar-t细胞在体内应用过程中具有更高的安全性，存活能力更强；当效应细胞与a549对照靶细胞共培养时，mocf-icosbbzcar-t细胞只分泌少量ifn-γ及il2，说明本发明所构建car-t细胞具有良好的靶向特异性。

实施例四

本实施例验证epcamcar-t细胞体外杀伤epcam靶细胞的能力。

在96孔板中将实施例二中的car-t细胞及t细胞与epcam阳性的靶细胞h1650及对照靶细胞a549以1:1，5:1，10:1的效靶比混合共培养，同时设置培养基空白对照组及靶细胞对照组。在37℃培养24小时，之后使用cck8方法od450吸光值。结果见图5。mocf-icosbbzcar-t及mocb-icosbbzcar-t细胞能够有效杀伤epcam阳性靶细胞h1650，mocf-icosbbzcar-t细胞的杀伤活性优于mocb-icosbbzcar-t细胞，二者都不能有效杀伤epcam阴性对照靶细胞a549细胞，对照t细胞不能有效杀伤h1650及a549细胞。

本实施例说明mocf-icosbbz及mocb-icosbbz两种car分子构建的car-t细胞能够有效杀伤epcam阳性的癌细胞并且具有良好的epcam靶向性，另外mocf-icosbbz的体外杀伤活性优于mocb-icosbbz。

实施例五

本实施例验证car-t细胞在小鼠皮下瘤模型中抑制epcam阳性肿瘤生长的能力。

使用6周龄nod-scid免疫缺陷鼠，皮下注射3×10e6个h1650细胞系，允许肿瘤生长7-15天，用测径器测量肿瘤大小，以肿瘤最长长度乘最长长度垂直方向的长度除以2得到一mm3为单位的肿瘤大小。当肿瘤大小达到20-50mm3时，通过静脉注射5×10e6个对照t细胞或5×10e6个car阳性的mocf-icosbbzcar-t细胞，在整个研究期间未发现明显的car-t导致的毒副作用。在回输1周之后采集尾静脉血，检测在小鼠血液car-t细胞水平并测量肿瘤大小。

采集小鼠尾静脉血20ul至20ul肝素钠抗凝剂中，每个样本加入1ul抗人cd45抗体，室温孵育10分钟，加入500ul红细胞裂解液裂红5分钟左右，离心收集细胞沉淀，pbs洗一次，流式细胞仪检测。结果如图6所示，car-t细胞及t细胞都可在小鼠血液中出现增殖。从图7可以看出，注射mocf-icosbbzcar-t细胞12天之后肿瘤开始变小，到23天已经基本完全清除肿瘤，对照t细胞不能够使肿瘤细胞减小。

本实施例说明，本发明的靶向epcam的car-t细胞能够有效清除小鼠epcam阳性皮下移植瘤模型中的肿瘤细胞。mocf-icosbbzcar-t组(6只)小鼠的肿瘤全部被清除，达到cr的标准，有效率100％。综上所述，mocf-icosbbzcar-t细胞能够在动物体内安全有效的清除epcam阳性肿瘤。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何根据本发明原理进行修改和替代也可以达到同样效果。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110>上海科棋药业科技有限公司

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