一种分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法与流程

本发明属于纤维素技术领域，具体涉及一种分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法。

背景技术：

随着人类对绿色、环保和可持续发展的追求，生物质材料及衍生物的制备与应用得到了极大的关注。纤维素作为地球上最丰富的可再生资源，每年预估产量可达到7.5×10¹⁰吨，但大多数被浪费或用于低附加值产品。纳米纤维素作为最为重要的衍生物，有着高的拉伸强度、良好的生物相容性、高比表面积、生物可降解性和低热膨胀系数等优点，在药物靶向传递、3d印刷、生态友好粘合、酶固定、环境修复等方面有着更突出的优势。

酶解法是近些年来出现的最有前景纳米纤维素制备方法，可以在温和的条件下实现，并且生物催化酶本身也是一种可再生物质。同时，纳米材料的纯度在市场价格、应用前景等有着至关重要的地位，因此分离提纯是酶解球形纳米纤维素生产的关键环节之一。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

一种分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法，包括如下步骤：

（1）打浆处理：取绝干30g桉木绝干浆板，浸泡4小时以上，疏解，撕成小块，平衡水分，加水配成300g浆，用pfi磨打浆；

（2）润涨处理：称取少量步骤（1）所得的桉木纤维浆，并加入溶胀剂,其中浆料绝干量与溶胀剂比例为1:50-1:100，对桉木纤维浆进行润胀预处理，然后采用3500-5000rpm转速离心5-10min，并弃去上清液，再加蒸馏水洗涤沉降的浆料，离心洗涤，洗涤过程重复2-3次，最后将沉降的纤维加入到烧杯中；

（3）复合酶解：将步骤（2）所得的纤维置于恒温振荡器，加入200-400ml总浓度为200u/ml-500u/ml的复合酶溶液，在恒定温度、恒定振荡速率下酶解一定时间；

（4）絮凝：将步骤（3）所得样品加入稀盐酸，调节ph，使溶液体系ph为2-5,静置30-60min，然后在3500-5000rpm下离心5-10min。

（5）纯化：将步骤（4）离心后的沉淀，加ph2-5的稀酸、超声、然后离心，此过程重复2-5次。最后将所得沉淀分散到蒸馏水中，超声、离心，上清即为纯净的球形纳米纤维素。

上述方法中，步骤(1)中，所述桉木纤维浆是以pfi磨浆制得，打浆度70-90°sr。

上述方法中，步骤(2)中，所用桉木纤维绝干量2.0-4.0g；所述溶胀剂为丙三醇，总用量200-400ml。

上述方法中，步骤(2)中，所述润胀预处理的具体步骤为：在反应温度30-40℃，速率150-180rpm条件下振荡3.5-4.5h，此条件下预处理所得到的桉木纤维浆料溶胀率增加70-90%。

上述方法中，步骤(3)中，所述的复合酶溶液是纤维素酶和木聚糖酶，总酶活浓度在200-500u/ml，其中纤维素酶酶活占总酶活70%-90%。

上述方法中，步骤(3)中，所述酶解的温度是30-55℃，振荡速率为125-155rpm，反应时间5-10h，此条件下得到粗球形纳米纤维素。

上述方法中，步骤(5)中，离心时间为5-10min,转速为3500-5000rpm.超声时间为5-10min.

上述方法中，步骤(5)中，所述的加稀酸、超声和离心的方法，是使还原性糖和可溶性蛋白质与球形纳米纤维素分离，并通过重复2-5次，不断去除球形纳米纤维素中的可溶性杂质。最后加蒸馏水、超声和离心，取上清即为纯净的纳米纤维素，是除去纳米纤维素中不可溶蛋白质。此条件下得到的纯净球形纤维素直径范围为15-40nm，纯度在99.99%以上，热稳定性较好。

本发明相对于现有技术，具有如下优点：

（1）采用复合酶解法，通过控制原料和酶解条件，制备的球形纳米纤维素样品粒径较小且集中，在15-40nm。

（2）相对于之前的抽滤、透析等方法，稀酸絮凝和洗涤的纯化方法周期短，效率高。

（3）所得纳米纤维素的纯度高。

附图说明

图1是本发明一种分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法工艺流程图。

图2是本发明一种分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法sem图。

图3是本发明一种分离提纯酶解球形纳米纤维素的方法粒径分布图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步具体说明，但本发明的实施方式不限于此。

本发明流程如图1所示。

实施例1

（1）取绝干量2.0g，打浆度70°sr的桉木纤维浆料放入烧杯，加入200ml丙三醇溶液。

（2）将烧杯置于恒温振荡器，在水温30℃，速率150rpm条件下振荡3.5h；取出润胀后样品，3500转离心5min，弃去上清液，加入蒸馏水洗涤沉降样品，重复2次。

（3）将上述所得样品置于1l烧杯中，加入400ml，总酶活200u/ml的复合酶溶液，该复合酶溶液由纤维素酶（黑曲霉）和木聚糖酶（绿色木霉菌g）组成，其中纤维素酶活占90%（纤维素酶（黑曲霉）和木聚糖酶（绿色木霉菌g）都购自宁夏夏盛实业集团），在水温48℃，125rpm振荡速率条件下反应5h。

（4）将上述所得样品加入稀盐酸，调节ph，使溶液体系ph为3,静置30min，然后在4000rpm下离心。

（5）将上述所得离心后的沉淀，加ph2的稀酸、超声10min、然后4000rpm离心10min，此过程重复3次。最后将所得沉淀分散到200ml蒸馏水中，超声10min、4000rpm离心10min，上清即为纯净的球形纳米纤维素。将样品稀释后超声分散，通过sem观察，由图2可以得到较为均匀分散的球形纳米纤维素，直径主要在直径范围为15-40nm，结合图3的马尔文粒径分析仪，发现只有一个峰，说明粒径均匀，并且主要集中在30nm。

实施例2

（1）取绝干量4g，打浆度90°sr的桉木纤维浆料放入烧杯，加入400ml丙三醇溶液。

（2）将烧杯置于恒温振荡器，在水温40℃，速率180rpm条件下振荡4.5h；取出润胀后样品，5000转离心10min，弃去上清液，加入蒸馏水洗涤沉降样品，重复3次。

（3）将所得样品置于1l烧杯中，加入450ml，总酶活浓度300u/ml的复合酶溶液，该复合酶溶液由纤维素酶（黑曲霉）和木聚糖酶（绿色木霉菌g）组成，其中纤维素酶活占80%（纤维素酶和木聚糖酶都购自宁夏夏盛实业集团），在水温52℃，155rpm振荡速率条件下反应6h。

（4）将上述所得样品加入稀盐酸，调节ph，使溶液体系ph为2,静置40min，然后在3500rpm下离心。

（5）将上述所得离心后的沉淀，加ph3的稀酸、超声5min、然后3500rpm离心5min，此过程重复2次。最后将所得沉淀分散到200ml蒸馏水中，超声5min、3500rpm离心5min，上清即为纯净的球形纳米纤维素。

实施例3

（1）取绝干量2.8g，打浆度82°sr的桉木纤维浆料放入烧杯，加入300ml的丙三醇溶液。

（2）将烧杯置于恒温振荡器，在水温37℃，速率170rpm条件下振荡4.5h；取出润胀后样品，4000转离心10min，弃去上清液，加入蒸馏水洗涤沉降样品，重复2次。

（3）将所得样品置于1l烧杯中，加入400ml，总酶活浓度350u/ml的复合酶溶液，该复合酶溶液由纤维素酶（黑曲霉）和木聚糖酶（绿色木霉菌g）组成，其中纤维素酶活占85%（纤维素酶和木聚糖酶都购自宁夏夏盛实业集团），在水温50℃，145rpm振荡速率条件下反应5.5h。

（4）将上述所得样品加入稀盐酸，调节ph，使溶液体系ph为4,静置50min，然后在4500rpm下离心。

（5）将上述所得离心后的沉淀，加ph4的稀酸、超声8min、然后4500rpm离心8min，此过程重复3次。最后将所得沉淀分散到200ml蒸馏水中，超声8min、4500rpm离心8min，上清即为纯净的球形纳米纤维素。

实施例4

（1）取绝干量3g，打浆度75°sr的桉木纤维浆料放入烧杯，加入300ml的丙三醇溶液。

（2）将烧杯置于恒温振荡器，在水温35℃，速率155rpm条件下振荡3.5h；取出润胀后样品，4000转离心10min，弃去上清液，加入蒸馏水洗涤沉降样品，重复2次。

（3）将所得样品置于1l烧杯中，加入370ml，总酶活浓度400u/ml的复合酶溶液，该复合酶溶液由纤维素酶和木聚糖酶组成，其中纤维素酶活占70%（纤维素酶和木聚糖酶都购自宁夏夏盛实业集团），在水温48℃，155rpm振荡速率条件下反应4h。

（4）将上述所得样品加入稀盐酸，调节ph，使溶液体系ph为2,静置60min，然后在5000rpm下离心。

（5）将上述所得离心后的沉淀，加ph2的稀酸、超声6min、然后5000rpm离心6min，此过程重复4次。最后将所得沉淀分散到200ml蒸馏水中，超声6min、5000rpm离心6min，上清即为纯净的球形纳米纤维素。