本发明涉及生物多糖技术领域，具体涉及一种不同生物活性香菇多糖的制备方法。
背景技术：
过去的25年，新的天然药物已经被批准用于治疗人类疾病，在新药的研发过程中，天然产物扮演了一个十分重要的角色，数百年来，香菇提取物被当做药物使用，甚至在中国，日本，韩国和俄罗斯东部当做替代药。香菇中多种有效成分已经被证实能够抑制癌细胞的形成，其中被研究的最多是具有增强宿主免疫反应的多糖类物质，现代临床试验表明，香菇中含有多种有效的药用成分，特别是其中香菇多糖，能够抑制癌细胞，降血糖，抗氧化，抗肿瘤及预防感冒，提高人体免疫力。
目前香菇主要使用代料或者段木进行大规模种植，在适宜的管理条件下，香菇一般会出现4潮菇，每一潮香菇的生长发育期一般分为菇蕾期，未成熟期子实体，成熟期子实体和开伞期子实体四个时期。目前传统的多糖制备方法都采用成熟期的香菇子实体，并且在70%以上乙醇终浓度条件下进行醇沉获得香菇多糖，过高的乙醇浓度为破坏多糖的结构，影响其药用价值，而且利用的香菇多糖多为脱色、脱蛋白多糖。
在公开号为CN1153179的专利中公开了一种香菇多糖新的分离纯化方法，该专利中香菇多糖的得率很低约为0.1%，这样造成极大的香菇浪费，增加香菇多糖的生产成本。
由于香菇生长过程中基质内营养成分的流失、生长环境的变化以及人为因素等一系列原因，导致不同生长发育期香菇多糖品质出现一定的差异性，同时，采用不同乙醇终浓度获得的香菇多糖活性也有一定的差异性。现有技术中提取香菇多糖大多使用成熟期香菇子实体，其缺点是没有合理的利用香菇整个生长过程中所产生的生物多糖，因为在不同的生长期香菇内含有的香菇多糖的活性是不同的，所针对的医疗保健作用也有多差别，仅仅提取成熟期的香菇子实体中的香菇多糖会限制香菇多糖的多样性，没有充分利用香菇的医用保健价值。
现有技术中的生产工艺往往会对香菇多糖进行提纯得到单一多糖，或者进行脱色、脱蛋白处理，得到的产品的抗氧化性、保健性并不好。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供一种不同生物活性香菇多糖的制备方法，使用的乙醇浓度低，以不同生长期的香菇子实体为原料，能够获得不同生物活性、多糖含量不同、分子量不同的香菇多糖，多糖的得率高，充分提升香菇多糖的应用价值，同时有效降低了香菇多糖的制备成本。
本发明为一种不同生物活性香菇多糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）粉碎，将香菇子实体干燥，干燥的温度为40-60℃，干燥的时间为6-12h，
粉碎后过60-80目筛网，得到香菇粉末，香菇子实体为菇蕾期的子实体、未成熟期的子实体、成熟期的子实体、开伞期的子实体中的一种或多种；
原料使用不同时期的香菇子实体，菇蕾期的子实体，子实体未分化，菌盖直径约为0.5 cm-1.0 cm；未成熟期子实体的菌幕形成，菌盖直径约为 1.5 cm-2.0 cm）；成熟期（菌幕开裂）和开伞期（菌幕完全裂开，子实体完全开伞）。不同生长发育期的香菇子实体的香菇多糖品质存在一定的差异性，可根据对多糖不同活性的需要选择香菇子实体的种类，也可选用多种生长周期的香菇子实体混合的形式作为原料，生产出具备多种生物活性香菇多糖。香菇粉末的粒径大小会影响浸提的效果，香菇多糖是从优质香菇子实体中提取的有效活性成分，香菇多糖中的活性成分是具有分支的β- (1-3)-D-葡聚糖，主链由β-(1-3)-连接的葡萄糖基组成，沿主链随机分布着由β-(1-6)连接的葡萄糖基，呈梳状结构，香菇多糖大多为酸性多糖，溶于水、稀碱，尤其易溶于热水，所以在浸提的时候香菇多糖溶解到热水中，细化香菇粉末有利于提高其浸出效果。
干燥的温度较低在40-60℃，因为过高的温度会改变多糖的结构或化学性质，所以在较低温度范围内干燥，最大限度的保证香菇多糖的活性。
（2）浸提，取香菇粉末加入纯水得到混合液，所述香菇粉末、纯水的比
为1:(20-40) m/v，加热混合液在90-100℃第一次浸提，浸提的时间为2-3h；
香菇多糖易溶于热水，在90-100℃中香菇多糖会逐渐溶出，因为在浸提之前已经对香菇进行粉碎细化，可以提高浸提过程中的浸提效果，加上合适的浸提温度，有效提高香菇多糖的得率。
（3）过滤，过滤后得到第一浸提液，滤渣进行二次浸提，得到第二浸提液，
合并第一浸提液、第二浸提液，得到浸提滤液；；
可根据需要对滤渣多次浸提，提高浸提的效果，最终能够提高得率。
（4）分级醇沉，浸提滤液经减压浓缩后得到浓缩液，减压浓缩的浓缩比为
3-5:1 v / m，浓缩比为浸提滤液体积：香菇粉末质量。分多次加入乙醇，依次使最终的乙醇浓度为20-70% mL/mL，进行分级醇沉，得到多种不同组分含量的多糖沉淀，例如具体操作可以为：加入乙醇，首先使混合液中乙醇的浓度为20% mL/mL进行醇沉，离心收集沉淀A；然后取刚才离心剩下的上清液，向上清液中加入乙醇使乙醇的浓度为50% mL/mL进行醇沉，离心收集沉淀B；继续向上清液中加入乙醇使乙醇的浓度为70% mL/mL进行醇沉，离心收集沉淀C，得到三种醇沉多糖沉淀，A多糖沉淀、B多糖沉淀、C多糖沉淀的组成不同、生物活性也不相同。可以根据具体需要只加入一种浓度的乙醇进行香菇多糖的提取。
（5）多糖干燥，分别将多种所述多糖沉淀烘干，得到多种香菇多糖。
离心的转速为4000 -5000 r/min，离心时间为15-20 min，醇沉的温度为4-5℃ ，醇沉的时间为6-12h。
合理的浓缩比、醇沉的乙醇浓度、醇沉的温度、醇沉的时间可以提高香菇
多糖的得率和品质。
（5）多糖干燥，分别将多种所述多糖沉淀烘干，得到多种香菇多糖。烘干的温度为45-58℃。
本发明的香菇多糖的制备过程中未进行脱色、脱蛋白处理，没有进行多糖的柱分离纯化，得到的产品香菇多糖为分级醇沉的粗多糖。我们前期研究结果表明优化的脱色和脱蛋白工艺的香菇多糖损失率均在9%左右，多糖的柱分离纯化过程同样会损失部分多糖，为此，本专利制备的香菇多糖可以保证较高的多糖得率和多糖含量；另外我们的研究发现纯化前的香菇多糖样品表现出更好的抗氧化活性，说明其中蛋白质或者其他的活性物质与多糖的协同作用，使其具有更好的抗氧化能力，为此，对于香菇多糖的有效利用并不是越纯好，做保健品或食品添加剂的香菇多糖，采用粗多糖即可，其营养保健功能更优。
使用不同乙醇浓度，以不同生长期的香菇子实体为原料，能够获得不同生物活性的多糖，多糖的得率高，充分提升香菇多糖的应用价值，相同的香菇浸提液能够同时提出多种多糖沉淀，可以极大程度的简化生产工艺，提高对香菇原料中多糖的提取率，节约香菇原料的使用量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。
实施例1
本发明为一种不同生物活性香菇多糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）粉碎，将香菇子实体干燥，干燥的温度为40℃，干燥的时间为12h，粉碎后过60目筛网，得到香菇粉末，香菇子实体为菇蕾期的子实体；
（2）浸提，取香菇粉末加入纯水得到混合液，所述香菇粉末、纯水的比为1:40 m/v，加热混合液在90℃第一次浸提，浸提的时间为2h；
（3）过滤，过滤后得到第一浸提液，滤渣进行第二次浸提，得到第二浸提液，合并第一浸提液、第二浸提液后得到浸提滤液；
（4）醇沉，浸提滤液经减压浓缩后得到浓缩液，减压浓缩的浓缩比为3:1，
浓缩比为浸提滤液体积：香菇粉末质量，加入乙醇，首先使乙醇的浓度为20% mL/mL进行醇沉，离心收集沉淀A；然后继续向上清液中加入乙醇使乙醇的浓度为50% mL/mL进行醇沉，离心收集沉淀B；继续向上清液中加入乙醇使乙醇的浓度为70% mL/mL进行醇沉，离心收集沉淀C，离心的转速为4000r/min，离心时间为15min，醇沉的温度为4℃，醇沉的时间为12h，得到三种不同组分多糖沉淀；
（5）多糖干燥，分别将三种不同组分的多糖沉淀烘干后得到三种香菇多糖，A多糖、B多糖、C多糖，烘干的温度为58℃。
经测试，本实施例中A多糖、B多糖、C多糖的得率分别为10.99%、6.89%、1.18%，总的多糖得率为19.06%；A多糖、B多糖、C多糖中多糖含量分别为42.52%、61.18%、47.18%。
其中20%乙醇浓度醇沉多糖（A多糖）组分中的β-葡聚糖含量为15.20%、蛋白质含量为10.95%，粘均分子量为150.18 KDa，体外刺激巨噬细胞释放NO的产量为 58.41 μmol/mL，体外对肝癌细胞的抑制率为48.31%，DPPH清除能力为49.32%，羟自由基清除能力为14.73%，超氧离子清除能力为4.21%；
其中50%乙醇浓度醇沉多糖（B多糖）组分中的β-葡聚糖含量为30.14%、蛋白质含量为8.56%，粘均分子量为82.06 KDa，体外刺激巨噬细胞释放NO的产量为40.93μmol/mL，体外对肝癌细胞的抑制率为29.09%，DPPH清除能力为49.32%，羟自由基清除能力为5.90%，超氧离子清除能力为5.32%；
其中70%乙醇浓度醇沉的多糖（C多糖）组分中的β-葡聚糖含量为33.25%、蛋白质含量为8.65%，粘均分子量为82.06 KDa，体外刺激巨噬细胞释放NO的产量为 39.32μmol/mL，体外对肝癌细胞的抑制率为27.15%，DPPH清除能力为34.92%，羟自由基清除能力为13.28%，超氧离子清除能力为7.45%。
实施例2
本发明为一种不同生物活性香菇多糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）粉碎，将香菇子实体干燥，干燥的温度为60℃，干燥的时间为6h，粉碎后用80目筛网过滤，得到香菇粉末，香菇子实体为未成熟期的子实体；
（2）浸提，取香菇粉末加入纯水得到混合液，所述香菇粉末、纯水的比为1: 20 m/v，加热混合液在100℃第一次浸提，浸提的时间为3h；
（3）过滤，过滤后得到第一浸提液，滤渣进行第二次浸提，得到第二浸提液，合并第一浸提液、第二浸提液后得到浸提滤液；
（4）分级醇沉，浸提滤液经减压浓缩后得到浓缩液，减压浓缩的浓缩比为5:1，浓缩比为浸提滤液体积：香菇粉末质量，加入乙醇，首先使乙醇的浓度为20% mL/mL进行醇沉，离心收集沉淀A，然后继续向上清液中加入乙醇使乙醇的浓度为50% mL/mL进行醇沉，离心收集沉淀B，继续向上清液中加入乙醇使乙醇的浓度为70% mL/mL进行醇沉，离心收集沉淀C，离心的转速为5000 r/min，离心时间为20 min，醇沉的温度为5℃，醇沉的时间为6h，得到三种不同组分多糖沉淀；
（5）多糖干燥，分别将三种不同组分的多糖沉淀烘干后得到三种香菇多糖,A多糖、B多糖、C多糖,烘干的温度为45℃。
经测试，本实施例采用20%、50%、70%乙醇浓度分级醇沉所得三种香菇多糖组分的得率分别为14.60%、3.93%、1.35%，总的多糖得率为19.88%；A多糖、B多糖、C多糖中多糖含量分别为32.77%、62.70% 55.95%。
其中20%乙醇浓度醇沉多糖组分中的β-葡聚糖含量为13.66%、蛋白质含量为12.83%，粘均分子量为219.22 KDa，体外刺激巨噬细胞释放NO的产量为 70.21 μmol/mL，体外对肝癌细胞的抑制率为46.29%，DPPH清除能力为57.38%，羟自由基清除能力为24.01%，超氧离子清除能力为9.70%。
实施例3
本发明为一种不同生物活性香菇多糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）粉碎，将香菇子实体干燥，干燥的温度为55℃，干燥的时间为10h，粉碎后过70目筛网，得到香菇粉末，香菇子实体为成熟期的子实体；
（2）浸提，取香菇粉末加入纯水得到混合液，所述香菇粉末、纯水的比为1:30 m/v，加热混合液在95℃第一次浸提，浸提的时间为2.5h；
（3）过滤，过滤后得到第一浸提液，滤渣进行第二次浸提，得到第二浸提液，合并第一浸提液、第二浸提液后得到浸提滤液；
（4）分级醇沉，浸提滤液经减压浓缩后得到浓缩液，减压浓缩的浓缩比为4:1，浓缩比为浸提滤液体积：香菇粉末质量，加入乙醇，首先使乙醇的浓度为25% mL/mL进行醇沉，离心收集沉淀A，然后继续向上清液中加入乙醇使乙醇的浓度为45% mL/mL进行醇沉，离心收集沉淀B，继续向上清液中加入乙醇使乙醇的浓度为60% mL/mL进行醇沉，离心收集沉淀C，离心的转速为4500 r/min，离心时间为16 min，醇沉的温度为4.5℃，醇沉的时间为10h，得到三种不同组分多糖沉淀；
（5）多糖干燥，分别将三种不同组分的多糖沉淀烘干后得到三种香菇多糖,A多糖、B多糖、C多糖,烘干的温度为50℃。
经测试，本实施例采用25%、45%、60%乙醇浓度分级醇沉所得三种香菇多糖组分的得率分别为10.08%、1.50%、1.78%，总的多糖得率为13.36%；A多糖、B多糖、C多糖中多糖含量分别为29.49%、70.29%、60.99%。
其中45%乙醇浓度醇沉多糖组分中的β-葡聚糖含量为31.74%、蛋白质含量为9.34%，粘均分子量为84.85 KDa，体外刺激巨噬细胞释放NO的产量为41.29 μmol/mL，体外对肝癌细胞的抑制率为28.67%，DPPH清除能力为13.25%，羟自由基清除能力为12.55%，超氧离子清除能力为6.21%。
实施例4
本发明为一种不同生物活性香菇多糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）粉碎，将香菇子实体干燥，干燥的温度为60℃，干燥的时间为12h，粉碎后过60目筛网，得到香菇粉末，香菇子实体为开伞期的子实体；
（2）浸提，取香菇粉末加入纯水得到混合液，所述香菇粉末、纯水的比为1:25 m/v，加热混合液在95℃第一次浸提，浸提的时间为2h；
（3）过滤，过滤后得到第一浸提液，滤渣进行第二次浸提，得到第二浸提液，合并第一浸提液、第二浸提液后得到浸提滤液；
（4）分级醇沉，浸提滤液经减压浓缩后得到浓缩液，减压浓缩的浓缩比为3:1，浓缩比为浸提滤液体积：香菇粉末质量，加入乙醇，首先使乙醇的浓度为30% mL/mL进行醇沉，离心收集沉淀，然后继续向上清液中加入乙醇使乙醇的浓度为55% mL/mL进行醇沉，离心收集沉淀，继续向上清液中加入乙醇使乙醇的浓度为70% mL/mL进行醇沉，离心收集沉淀，离心的转速为4000r/min，离心时间为18 min，醇沉的温度为4℃，醇沉的时间为12h，得到三种不同组分多糖沉淀；
（5）多糖干燥，分别将三种不同组分的多糖沉淀烘干后得到三种香菇多糖,A多糖、B多糖、C多糖,烘干的温度为50℃。
经测试，本实施例采用30%、55%、70%乙醇浓度分级醇沉所得三种香菇多糖组分的得率分别，9.71%、3.58%、1.05%、总的多糖得率为14.34%；A多糖、B多糖、C多糖中多糖含量分别为28.39%、64.38%、52.77%。
其中70%乙醇浓度醇沉多糖组分中的β-葡聚糖含量为25.84%、蛋白质含量为7.38%，粘均分子量为93.32KDa，体外刺激巨噬细胞释放NO的产量为47.00 μmol/mL，体外对肝癌细胞的抑制率为19.39%，DPPH清除能力为28.34%，羟自由基清除能力为11.80%，超氧离子清除能力为7.08%。
实施例1至实施例4中以四个阶段的香菇子实体为原料进行香菇多糖的提取均有很高的收率。
实施例1至实施例4中香菇各多糖组分含有丰富的营养成分，其中各多糖组分的得率范围为1.05%-14.60%，20%乙醇醇沉多糖得率最高；各多糖组分的多糖含量范围为32.77%-70.29%，50%乙醇醇沉多糖含量最高；各多糖组分的蛋白质含量范围为7.38%-12.83%，20%乙醇醇沉多糖中蛋白质含量最高；β-葡聚糖70%乙醇醇沉多糖得率最高；粘均分子量20%乙醇醇沉多糖最高，所有多糖组分的分子量均在有效活性的分量范围之内；20%乙醇醇沉多糖的抗氧化活性和体外刺激巨噬细胞释放NO的产量最高；70%乙醇醇沉多糖的体外对肝癌细胞的抑制率最高。
使用不同乙醇浓度，以不同生长期的香菇子实体为原料，能够获得不同生物活性、多糖含量不同、分子量不同的香菇多糖，多糖的得率高，充分提升香菇多糖的应用价值，有利于香菇多糖的分类应用。相同的香菇浸提液能够同时提出多种多糖沉淀，不同浓度的乙醇提取出的香菇多糖的活性及组分不同，可以极大程度的简化生产工艺，提高对香菇原料中多糖的提取率，节约香菇原料的使用量。满足不同的食品、保健品的开发需求，充分提升香菇多糖的应用价值，同时有效降低了香菇多糖的制备成本。
本发明不局限于上述具体的实施方式，本发明可以有各种更改和变化。凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围。