一种基于磁共振成像的活体示踪大脑神经连接的方法及其应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于磁共振成像的活体示踪大脑神经连接的方法，同时还涉及该方法在神经结构环路示踪及功能解析中的应用。

背景技术：

大脑神经网络在机体中行使着重要的功能，参与学习、记忆、认知和情绪等各项活动，而多种神经系统疾病与神经网络的异常密切相关。解析大脑神经结构网络对于理解大脑的功能、工作机制、发育、退化以及神经疾病的发生发展有着重要的作用。近年来，嗜神经病毒，如狂犬病毒、水疱性口炎病毒、单纯疱疹病毒、伪狂犬病毒等，已被广泛用于神经网络解析，基于嗜神经病毒的神经环路示踪方法为神经网络解析提供了大量信息。然而，因为目前嗜神经病毒携带的报告基因多为荧光蛋白，此方法通常需要在嗜神经病毒感染神经元一段时间后将动物牺牲，对离体组织切片进行荧光成像观察，无法实现嗜神经病毒在活体中的观察，也就不适用于慢性的、长时程的、需要处理前后自身对比的实验。

磁共振成像是一种综合了非侵入性、高穿透性、适用于软组织和较高的时空分辨等多种优势的成像方法，已被广泛运用于临床诊断与科学研究。近年来，基于磁共振成像检测大脑神经网络结构及功能的方法得到了迅速发展和广泛应用，其中扩散张量成像(dti)与锰离子增强磁共振成像(memri)可用于大脑神经网络解剖结构的预测和示踪。然而，dti方法基于数学模型预测纤维束的走向，其结果不能被直接认定为脑区之间的连接，并且其无法预测纤维束的投射方向，因此无法获得神经连接中的上下游关系。memri的神经网络示踪结果常被解读为顺向跨多级突触神经连接，但其示踪剂锰离子可通过脑脊液和血管扩散，造成示踪结果的复杂性与非特异性。另外高于一定浓度的重金属锰离子对机体有较强的毒性，影响动物正常生理功能甚至直接造成动物死亡。

ferritin是在多种生物体中高度保守存在的蛋白，是体内储存铁的主要形式之一。铁蛋白由24个亚基组成一个球形外壳，外壳中间的空腔可装载铁离子并形成顺磁性的氧化铁晶体，从而影响mri信号。因此ferritin的基因被认为是一种理想的磁共振成像报告基因。已有报道证明，携带ferritin的腺病毒能感染神经元，并造成注射位点局部脑区的t2加权和t2*加权像的暗信号。然而由于腺病毒只能感染注射位点局部神经元，无法跨突触在神经元与神经之间传播，故无法显示出神经元之间的连接信息。

aav是一类单链dna病毒，作为基因载体，其具备免疫原性低、宿主细胞种类多和基因表达持久等优势，因此已被广泛应用于神经环路示踪以及基因治疗中。不同血清型的aav具有不完全相同的感染特性，2016年有研究组通过人工定向进化的方法获得了raav2-retro血清型，这一血清型的aav具有高效轴突末端吸收并经过逆向运输至投射神经元胞体的特性。因此raav2-retro血清型的aav载体可以用于显示从轴突末梢到神经元胞体的神经投射信息，也可用于针对投射到特定脑区的神经元的基因导入。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于磁共振成像的活体追踪大脑神经连接的方法，可实现在活体大脑中显示不同脑区间的神经连接。

本发明的另一个目的在于提供了一种基于磁共振成像的活体追踪大脑神经连接的方法在神经结构环路示踪及功能解析中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于磁共振成像的活体示踪大脑神经连接的方法，包括以下步骤：

(1)在raav2-retro载体的itr中间依次插入cag启动子、ferritin基因、wpre转录后调控元件以及polya序列，包装成重组腺相关病毒raav2-retro-cag-ferritin-wpre-pa；

(2)将上述重组病毒注射在大脑中，病毒感染神经元并在神经元内表达ferritin，通过磁共振成像t2加权成像观察活体大脑，在活体大脑中显示其他脑区与注射位点被感染神经元之间的神经连接。

上述方法在神经结构环路示踪或神经功能解析中的应用，应用对象包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、猴、鱼类、鸟类、兔或人。将重组病毒raav2-retro-cag-ferritin-wpre-pa注射在a脑区，经过一段时间后，t2加权mri成像显示b脑区有ferritin引起的暗信号，从而表明a脑区与b脑区存在神经连接，并且该神经连接方向与连接级数均已确定，亦即b脑区神经元对a脑区有直接轴突投射。由此所得的明确的神经结构连接信息为后续b脑区到a脑区的神经投射的功能解析提供了结构基础。

与现有方法相比，本发明具有以下优点：

1.本发明中采用的raav2-retro血清型重组病毒raav2-retro-cag-ferritin-wpre-pa可由轴突末梢进入神经元，并通过轴突运输逆向进入神经元胞体，可明确指示神经连接；

2.本发明中重组病毒raav2-retro-cag-ferritin-wpre-pa使用高效率的启动cag，保障了ferritin蛋白的高表达量，而高丰度的ferritin蛋白是产生mri造影效果的关键；

3.本发明中重组病毒raav2-retro-cag-ferritin-wpre-pa表达出的ferritin蛋白是一种mri-t2造影剂，此造影剂直接影响mri-t2加权成像的信号值，灵敏度高；

4.本发明提出的方法可在活体水平观察大脑神经连接，适用于长时程观察和处理前后自身对照实验等，对大脑神经结构网络研究具有重要意义；

5.本发明提出的方法得出的神经网络结构连接方向明确，即为逆向标记；

6.本发明提出的方法得出的神经网络结构连接级数明确，即为直接连接，而非跨多级突触连接；

7.本发明提出的方法既具有的嗜神经病毒基因载体的优势，也具有基于ferritin造影效果的mri报告及检测方法的优势。此方法可被灵活改变，如更换嗜神经病毒类型、更换mri报告基因类型等，以应用于不同需求的神经环路示踪与基因转导监测中。

附图说明

图1为携带ferritin基因表达框的raav2-retro血清型的重组aav基因组示意图。

图2为raav2-retro-cag-ferritin-wpre-pa在小鼠大脑中的mri观察与免疫组化检测结果。a为mri-t2加权成像结果，其中箭头指示的脑区mc、bla和hipp为明显t2暗信号脑区；b为ferritin特异性免疫组化染色结果，其中箭头指示的脑区mc、bla和hipp为ferritin聚集高表达脑区。

图3为raav2-retro-cag-ferritin-wpre-pa注射前后不同时间点的鼠脑mri观察结果。a为注射病毒之前的小鼠大脑的t2加权mri结果，b为注射病毒30天后的mri结果，c为注射病毒70天后的mri结果。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，所述试剂与材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。此处展示的具体实施例仅用于解释本发明，而不用于限定本发明。

实施例1：携带ferritin基因的raav2-retro血清型的重组aav的构建方案

raav2-retro-cag-ferritin-wpre-pa基因组示意图(图1)，在itr中间插入cag启动子(seqidno.1所示)、ferritin基因(seqidno.2所示)、wpre转录后调控元件(seqidno.3所示)以及polya序列(seqidno.4所示)。将此设计方案交由武汉枢密脑科学技术有限公司进行后续的raav2-retro血清型重组aav病毒构建，以得到重组病毒raav2-retro-cag-ferritin-wpre-pa。

实施例2：raav2-retro-cag-ferritin-wpre-pa注射在小鼠大脑后的免疫组化检测与mri观察

将raav2-retro-cag-ferritin-wpre-pa病毒(由武汉枢密脑科学技术有限公司构建)通过脑立体定位注射在小鼠的背侧纹状体脑区(cpu,坐标：ap-0.5mm；ml-2mm；dv-3.3mm)，其滴度为5.57×10¹²vg/ml，注射体积为2.8μl。

40天后，使用7.0t磁共振成像仪对动物大脑进行活体mri观察，其中用到的t2加权成像的序列为rare弛豫增强快速采集序列，参数为：tr＝3000ms，effte＝55ms，rarefactor＝4，序列总时长为28min。fov为1.75×1.75cm，分辨率为0.136×0.136mm，层厚为0.5mm。mri结果(图2a)表明病毒成功进入神经元，经轴突运输从cpu逆向进入神经元胞体(基体外侧杏仁核bla、海马hipp、运动皮层mc等脑区，图2a中箭头所示)并且表达出足够改变t2加权mri信号的铁蛋白。其中注射位点cpu脑区显示出t2加权高亮信号，可能是由于注射位点细胞病毒感染过量，引起的局部炎症造成。

mri实验后，麻醉小鼠，进行心脏灌流后取出鼠脑并做冰冻切片。随后使用兔来源的ferritin抗体对小鼠大脑切片进行免疫组化染色，以显示ferritin高表达的脑区。结果见图2b。其中cpu脑区注射核心区域显示出相对减弱的荧光信号，推测由细胞炎症引起，验证了mri的结果。

图2表明ferritin免疫组化展示的ferritin集中高表达区域与t2加权mri暗信号区域高度一致，即均为bla、hipp、mc等脑区(图2a&b中箭头所示)，这也证明了t2加权mri暗信号是由病毒携带的ferritin高表达引起的。

实施例3：raav2-retro-cag-ferritin-wpre-pa注射后不同时间点的鼠脑活体长时程mri观察

本发明提出的追踪神经连接方法的优势之一为可活体长时程观测大脑神经连接。故在此实施例中给出同一只小鼠在raav2-retro-cag-ferritin-wpre-pa病毒注射前、注射后30天及70天的大脑mri结果。在注射病毒之前，使用7.0t磁共振成像仪对动物大脑进行活体mri观察，其中用到的t2加权成像的序列为rare弛豫增强快速采集序列，参数为：tr＝3000ms，effte＝55ms，rarefactor＝4，序列总时长为28min。fov为1.75×1.75cm，分辨率为0.136×0.136mm，层厚为0.5mm。然后将raav2-retro-cag-ferritin-wpre-pa病毒通过脑立体定位方法注射在小鼠的背侧纹状体脑区(cpu，坐标：ap-0.5mm；ml-2mm；dv-3.3mm)，其滴度为5.57×1012vg/ml，注射体积为2.8μl。分别在注射后30天及70天，使用7.0t磁共振成像仪对动物大脑进行活体mri观察，mri方法同注射病毒前的扫描方法。mri结果见图3，其中3a为注射病毒之前的小鼠大脑的t2加权mri结果，3b为注射病毒30天后的mri结果，3c为注射病毒70天后的mri结果。不同时间点的mri结果表明，随着时间的增长，病毒中携带ferritin的表达量增加，mri造影效果增强。通过此实施例，我们获得了轴突投射到cpu的脑区包含bla、hipp、mc等，此在活体水平获得的结构神经连接的信息为研究生理或病理状态下大脑神经网络的功能提供了重要基础。

序列表

<110>中国科学院武汉物理与数学研究所

<120>一种基于磁共振成像的活体示踪大脑神经连接的方法及其应用

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