一种Ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法及应用与流程

本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及一种ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法及应用。

背景技术：

以胰岛β细胞受损为特征的糖尿病(diabetesmellitus,dm)是危害人类健康的慢性、终身性代谢疾病。糖尿病发生是由于体内胰岛素信号通路受损或是胰岛素靶点的敏感性降低，导致糖代谢异常从而引起血糖升高，糖尿病伴有心血管病变等并发症，如糖尿病肾病，神经慢性损害和视网膜病，随着糖尿病患病率不断提高，糖尿病及其相关的器官病变成为困扰人们生活的主要健康问题。

胰岛素水平较低或者血糖浓度较高是糖尿病患者最明显的指征，胰岛素起着降低血糖的作用，胰岛β细胞是唯一能合成并释放胰岛素的细胞，所以胰腺的发育状况对血糖调控至关重要。为方便研究糖尿病发病机制及降血糖药物开发，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法及应用以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

一种ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法，其包括如下步骤：

(1)构建转基因斑马鱼；

(2)采用药物对转基因斑马鱼进行造模；

在步骤(1)构建转基因斑马鱼的过程中，先构建表达载体，再将表达载体与tol2mrna混合，显微注射到斑马鱼胚胎中；表达载体包括pdx1基因启动子，编码荧光蛋白的基因和nsfb基因；

其中步骤(2)中所采用的药物为含有硝基基团的化合物。

本发明先构建转基因斑马鱼品系，再用药物对构建好的转基因斑马鱼进行造模，最终获得ⅱ型糖尿病斑马鱼模型。

在构建转基因斑马鱼的过程中，先进行表达载体的构建。表达载体中包括pdx1基因启动子，pdx1基因编码胰腺十二指肠同源框蛋白1(pancreasandduodenumhomeobox1,pdx1)也称胰岛素启动因子1，pdx1基因是一种与糖尿病相关的基因，特别是与ⅱ型糖尿病易感性增加有关，pdx1大多表达于胰岛内分泌胰岛素的β细胞和分泌生长抑素的δ细胞中，具有调节胰腺发育和分化的功能，其表达水平对维持正常血糖内稳态至关重要。老鼠中pdx1基因纯合突变致死，杂合突变表现为高血糖症；斑马鱼中敲除pdx1导致外分泌和内分泌腺细胞明显减少，敲除pdx1将引发胰腺发育缺陷，胰岛素分泌缺失从而导致糖尿病症状(wangx,2018；kellermp，2018；yoshidat,2010；gug,2002；brissovam,2002；linglingye,2017；ahlgrenu,1998)。本发明在载体中插入pdx1基因启动子可以保证构建的转基因斑马鱼可以在胰腺特异表达硝基还原酶和红色荧光蛋白，保证加入甲硝唑底物处理时可特异杀死胰腺组织从而诱导二型糖尿病。

nsfb基因编码的蛋白叫ntr，nsfb基因即硝基还原酶b(nitroreductaseb，nfsb)基因，其源自于大肠埃希菌(escherichiacolib)，硝基还原酶b基因编码的硝基还原酶(nitroreductase，ntr)蛋白能与含有硝基基团的化合物如甲硝唑(metronidazole，mtz)结合，把甲硝唑还原成甲胺唑，而甲胺唑对细胞具有毒性。该物质能有效结合于dna双链，抑制细胞核酸的合成，干扰细胞的生长，最终导致细胞死亡。本发明表达载体中设置nsfb基因片段，从而保证转基因品系能正常表达ntr蛋白，后续在甲硝唑的诱导下可有效、特异地杀死胰腺组织细胞。

其他硝基咪唑类化合物也能够和硝基还原酶发生化学反应，优选为mtz。

进一步地，表达载体还包括编码荧光蛋白的基因，编码荧光蛋白的基因能表达荧光蛋白，当药物诱导时，特异地杀死胰腺组织细胞，荧光减弱，并引起血糖增高、胰岛素分泌紊乱等糖尿病症状从而模拟斑马鱼ⅱ型糖尿病。利用该疾病模型，可广泛用于降血糖药物的筛选及开发应用，具有重要的意义。

tol2_mrna用于提高对外源表达载体插入基因组的转座效率。

在本发明应用较佳的实施例中，上述pdx1基因启动子序列如seqidno.6所示，nsfb基因的核苷酸序列如seqidno.2所示；nsfb基因编码的ntr蛋白序列如seqidno.8所示；编码荧光蛋白的基因为mcherry基因，编码橙色荧光蛋白的基因或编码黄色荧光蛋白的基因中的任意一种；

优选的，编码荧光蛋白的基因为mcherry基因，mcherry基因编码的蛋白序列如seqidno.7所示；mcherry基因的核苷酸序列如seqidno.3所示。

编码荧光蛋白的基因可以根据需要进行调整，优选为mcherry报告基因，mcherry报告基因能表达红色荧光蛋白，当药物诱导时，特异地杀死胰腺组织细胞，红色荧光减弱，并引起血糖增高、胰岛素分泌紊乱等糖尿病症状从而模拟斑马鱼ⅱ型糖尿病。利用该疾病模型，可广泛用于降血糖药物的筛选及开发应用，具有重要的意义。

在本发明应用较佳的实施例中，上述表达载体的核苷酸序列如seqidno.1所示。

在本发明应用较佳的实施例中，上述表达载体的构建方法包括如下步骤：先构建psteos-pdx1中间载体并扩增mcherry-ntr插入片段，再将psteos-pdx1中间载体和mcherry-ntr插入片段进行双酶切，回收后连接构建得到所述表达载体tol2-pdx1-mcherry-ntr。

psteos及mcherry-ntr模板质粒均由孟安明实验室惠赠。mcherry-ntr插入片段可采用扩增或酶切pst-mylz2-mcherry-ntr质粒的方式获得。pst-mylz2-mcherry-ntr质粒由孟安明实验室惠赠。

在本发明应用较佳的实施例中，上述将psteos-pdx1中间载体和mcherry-ntr片段进行双酶切所采用的酶为xbai和bamhi限制性内切酶。采用双酶切对psteos-pdx1中间载体进行酶切，获得两端带有酶切位点的pst-pdx1中间载体，采用双酶切对mcherry-ntr片段进行双酶切，再通过胶回收并将片段和载体进行连接获得最终的表达载体tol2-pdx1-mcherry-ntr。

在本发明应用较佳的实施例中，上述表达载体的构建方法还包括构建psteos-pdx1中间载体，构建psteos-pdx1中间载体包括如下步骤：以斑马鱼基因组为模板，采用第一引物和第二引物扩增pdx1启动子片段，再对扩增获得的pdx1启动子片段和psteos载体进行双酶切，酶切回收后，连接获得psteos-pdx1中间载体；

优选的，第一引物的核苷酸序列如seqidno.4所示，第二引物的核苷酸序列如seqidno.5所示；

优选的，对扩增获得的pdx1启动子片段和psteos载体进行双酶切所采用的酶为bglii和bamhi限制性内切酶。

在本发明应用较佳的实施例中，上述药物为甲硝唑，甲硝唑的作用浓度为8-10mm；

优选的，甲硝唑的作用浓度为8mm。

当甲硝唑的作用浓度为8mm时，红色荧光减弱明显，转基因斑马鱼生存状况良好。

在本发明应用较佳的实施例中，上述斑马鱼胚胎在单细胞时期进行注射，注射量为1-2nl，斑马鱼胚胎发育至72hpf时期观察荧光表达，共注射表达载体与tol2mrna获得转基因斑马鱼的成功率更高，注射量在1-2nl时，效果最佳。

一种由上述构建方法得到的ⅱ型糖尿病斑马鱼模型在筛选治疗ⅱ型糖尿病的药物中的应用。

在本发明应用较佳的实施例中，上述筛选治疗ⅱ型糖尿病的药物的方法包括以下步骤：

若施用药物后，与mtz诱导的ii型糖尿病模型组相比，实验组的红色荧光增强，血糖浓度降低，胰岛素浓度升高，则判断该药物具有治疗ⅱ型糖尿病的功效；

若施用药物后，与mtz诱导的ii型糖尿病模型组相比，实验组的红色荧光保持不变，血糖浓度和胰岛素浓度无明显变化，则判断该药物不具有治疗ⅱ型糖尿病的功效。

优选的，新药为治疗ⅱ型糖尿病的新型药物；

优选的，新药为促进胰腺组织再生类药物。利用本发明提供的斑马鱼模型的构建方法可以构建斑马鱼ⅱ型糖尿病模型，可以用于降血糖药物的筛选及开发应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法，该方法以斑马鱼为模式动物，将pdx1基因启动子连接编码荧光蛋白的基因和nsfb基因，构建转基因斑马鱼，pdx1启动子片段可以保证构建的转基因斑马鱼可以在胰腺组织特异表达荧光蛋白和ntr，在含有硝基基团的化合物的诱导下可有效、特异地杀死胰腺组织细胞，体现为荧光减弱，并引起血糖增高、胰岛素分泌紊乱等糖尿病症状从而模拟斑马鱼ⅱ型糖尿病。利用该方法构建ⅱ型糖尿病斑马鱼模型，可用于降血糖药物的筛选及开发应用，具有重要的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为tol2-pdx1-mcherry-ntr载体图(a图)、tg(pdx1:mcherry-ntr)转基因斑马鱼品系筛选图谱(b图)、转基因鱼不同家系荧光表达及原位杂交共定位结果(c图)；

图2为转基因斑马鱼加入mtz后胰腺荧光变化图(tg(pdx1:mcherry-ntr)在72hpf时期对照组(b)和8mmmtz处理组(c)处理48h后观察120hpf时期的红色荧光蛋白表达示意图；b1-c1图分别为b-c图的局部放大图，d为相对荧光强度统计分析数据；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)；

图3为(pdx1-mcherry-ntr)转基因斑马鱼体内葡萄糖浓度和胰岛素浓度示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法。其包括如下步骤：

(1)构建转基因斑马鱼品系。

先进行tol2-pdx1-mcherry-ntr质粒的构建，以斑马鱼基因组为模板，通过pcr扩增出pdx1基因启动子2596bp片段。第一引物即表1中的pdx1promoter-f-bglii，第二引物即表1中的pdx1promoter-r-bamhi，分别用bglii和bamhi限制性内切酶对pdx1基因启动子片段和psteos载体进行双酶切，采用dna回收试剂盒(购自天根)进行酶切回收，通过连接构建psteos-pdx1中间载体。再分别用xbai和bamhi限制性内切酶对psteos-pdx1中间载体和pst-mylz2-mcherry-ntr质粒(孟安明实验室惠赠)进行双酶切，然后酶切回收，通过连接构建tol2-pdx1-mcherry-ntr表达载体并测序验证(引物序列参照表1所示)。tol2-pdx1-mcherry-ntr表达载体的载体图参照图1中的a图所示。

表1pdx1启动子引物序列

在进行显微注射前采用分光光度计测定tol2-pdx1-mcherry-ntr质粒及tol2转座酶mrna的浓度，分别调整为75ng/μl和150ng/μl，等体积混合，显微注射至单细胞期斑马鱼胚胎，注射部位在卵黄囊与胚体交汇处，每个胚胎注射约为1-2nl。

注射tol2-pdx1-mcherry-ntr质粒的胚胎孵化的斑马鱼记为f0代，待f0代发育至72h在荧光显微镜(尼康)下挑选出胰腺组织有红色荧光的胚胎，饲养至性成熟斑马鱼，与tg(ins:egfp)斑马鱼测交。tg斑马鱼为转egfp斑马鱼，f1胚胎发育至72h，在荧光显微镜下挑选出胰腺特异红色荧光的胚胎继续培育。f1代已经能够稳定遗传，性成熟后产生的胚胎可用于实验研究。培养的f1代可自交或与所需品系侧交，筛选具有相应红色荧光的f2代并培养长大。

本实施例中及下面各实施例中的斑马鱼均养于循环水养殖系统中，成年斑马鱼水温控制在26℃-28℃，ph值保持在6.8～7.4，光照严格控制为14小时光周期和10小时暗周期。成鱼定时投喂丰年虾，每日三次。幼鱼发育至受精后5天(5dpf)时喂食草履虫，受精后15天(15dpf)开始喂食丰年虾。

(2)采用药物对转基因斑马鱼进行造模。

以培养皿为实验容器，将f1代性成熟产生的胚胎发育12h后置于含0.03g/lptu的holfreter水中培养，发育至72hpf(受精后72h)时挑出胰腺组织表达红色荧光的幼鱼，加入浓度为8mm的mtz溶液(甲硝唑溶液，货号m1547)处理，每12h观察红色荧光变化情况及幼鱼组织液葡萄糖和胰岛素浓度，即完成ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建。

实验例1

本实验例进行了稳定遗传的转基因品系tg(pdx1:mcherry-ntr)的筛选实验。

tg(pdx1:mcherry-ntr)转基因斑马鱼在72hpf胰腺组织初步形成，开始表达红色荧光，根据荧光表达的部位和荧光强度了解胰腺组织的发育情况，利用荧光显微镜筛选得到胰腺组织特异表达红色荧光的转基因斑马鱼，具体筛选结果如下。

将tg(pdx1:mcherry-ntr)f0代斑马鱼逐条与斑马鱼品系tg(ins:egfp)杂交得到如图1中的c图所示荧光表达强度不一致的f1代，由此分出不同的家系并进行编号，由不同的f0家系侧交繁殖得到的后代为f1代。本实验例共筛得tg(pdx1:mcherry-ntr)1#f1、tg(pdx1:mcherry-ntr)2#f1、tg(pdx1:mcherry-ntr)3#f1、tg(pdx1:mcherry-ntr)5#f1、tg(pdx1:mcherry-ntr)7#f1共5个家系。

将1#、7#的f1代进行自交，筛选获得纯合f2代。

培养的3#f1和5#f1与斑马鱼品系tg(ins:egfp)侧交，筛选既有红色荧光又有绿色荧光的f2代并培养长大。

实验例2

本实验例对实验例1中的5个家系转基因鱼进行荧光表达检测及原位杂交共定位实验。具体包括将各tg(pdx1:mcherry-ntr)f0代转基因斑马鱼逐条和野生型品系侧交，次日清晨在其受精后10min收集胚胎，挑选出发育正常的胚胎，洗净后在holfreter水中养，待胚胎发育至72h使用荧光显微镜挑出胰腺组织表达红色荧光的胚胎拍照，并用原位杂交技术检测pdx1基因时空表达情况。通过整胚原位杂交技术检测斑马鱼pdx1基因mrna的时空表达，定位胰腺组织的位置，原位杂交的具体步骤见参考文献[hwanggt.molecules,2018；dobrzyckit，biologyopen,2018]的方法进行。

实验结果参照图1中的c图所示，不同家系胰腺组织表达的荧光强度有所差别，表达部位都很特异。其中5#、7#家系转基因斑马鱼的荧光强度最强，3#家系的荧光强度次之，2#家系荧光强度较弱，1#家系荧光强度最弱。观察原位杂交结果，可发现pdx1基因在胰腺组织部位表达，原位杂交染色部位与荧光显微镜观察到的胰腺组织红色荧光表达部位一致。

实验例3

本实验例给出了最佳mtz溶液浓度的实验例。具体的，以培养皿为实验容器，将f1代性成熟产生的胚胎发育12h后置于含0.03g/lptu的holfreter水中培养，发育至72hpf(受精后72h)时挑出胰腺组织表达红色荧光的幼鱼，随机分成五组，每组2个平行，分别加入梯度浓度为0mm、5mm、8mm、10mm、12mm的mtz溶液(甲硝唑溶液，货号m1547)处理，对照组为含2‰dmso的holfreter水，每12h观察红色荧光变化情况，挑走死亡的胚胎，更换药物并混匀，以确保活性成分分布均匀。幼鱼置于28℃恒温培养箱培养，48h后在荧光显微镜下拍照并统计荧光减弱数量，确定mtz体内诱导tg(pdx1:mcherry-ntr)转基因斑马鱼构建ii型糖尿病模型的最佳作用浓度。

实验结果参照表2所示，由表2可知，幼鱼加药处理48h后，与对照组的荧光相比，暴露于12mmmtz组幼鱼胰腺荧光减弱比例最高，高达100％，而暴露于8mmmtz组的减弱比例次之，为93.56％，10mmmtz组的减弱比例为82.59％，5mmmtz组减弱比例为32％。在给药期间12mmmtz组幼鱼死亡速度最快，持续给药48h死亡率达到100％，无法进行下一步实验。10mmmtz组处理24h后幼鱼开始大量死亡。8mmmtz组存活状况良好，由此可见，8mm是mtz诱导tg(pdx1-mcherry-ntr)转基因斑马鱼构建ⅱ型糖尿病模型的最佳浓度。

表2不同浓度mtz处理斑马鱼构建糖尿病模型

实验例4

在荧光显微镜下挑出72hpf带有胰腺红色荧光的胚胎，设置对照组和8mmmtz组，培养至120hpf时观察荧光情况，结果如图2所示，tg(pdx1-mcherry-ntr)转基因幼鱼的红色荧光表达于胰腺部位，对照组幼鱼胰腺荧光表达较强(图2中的b图，b1图)，经8mmol/l的mtz诱导后幼鱼胰腺荧光表达减弱(图2中的c图，c1图)。利用软件对荧光表达强度进行相对定量比较，mtz组荧光表达强度显著低于对照组。即本发明提供的ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法能够在mtz的诱导下，杀死转基因斑马鱼的胰腺组织细胞，从而使得荧光减弱。

本实验例的结果表明经8mmmtz处理48h后斑马鱼胰腺组织红色荧光表达特异减弱，幼鱼组织液和成鱼血液葡萄糖浓度显著升高、胰岛素浓度显著降低，表明斑马鱼ⅱ型糖尿病模型构建成功，并成功筛选获得不同转基因斑马鱼家系，为后续筛选和研究治疗ⅱ型糖尿病新型药物提供了更多途径。

实验例5

本实验例采用双抗体一步夹心酶联免疫吸附法(elisa)检测实验例1中各组幼鱼组织液葡萄糖、胰岛素及成鱼血液胰岛素浓度。成鱼血糖浓度采取眼窝取血方法用血糖血酮仪检测。胰岛素含量测定方法与组织液葡萄糖浓度测定操作步骤基本相同，不同主要在于选用的板条和酶联试剂，葡萄糖elisa检测板条微孔中预先包被有葡萄糖(glucose)抗体，胰岛素elisa检测板条微孔中预先包被有胰岛素(ins)抗体。幼鱼组织液葡萄糖的浓度采用鱼葡萄糖elisa检测试剂盒检测(货号6141071221)，幼鱼组织液胰岛素浓度及成鱼血液胰岛素浓度采用鱼胰岛素elisa检测试剂盒(货号6141091419)检测。

elisa具体操作方法如下：

(1)f1代转基因品系斑马鱼胚胎受精后72h用mtz造模，后采用与上述相同的分组和给药策略(参照图3中的a图所示)，待加药处理至120h时，每个处理组收集十条幼鱼到1.5mlep管中，每组2个平行样，用holfreter水洗两遍后用pbs溶液洗两遍，将管内溶液吸走，迅速使用液氮固定幼鱼，放置-80℃保存待用。

(2)从-80℃冰箱中取出待测幼鱼，往ep管中加入无菌100ulpbs溶液，使用电动组织研磨器将幼鱼捣碎，操作应将幼鱼放在冰上进行，防止高温使蛋白变性，震荡10s，停10s，反复多次，使胚胎充分裂解，直至无肉眼可见组织团块。将裂解液置于3000r/min离心10min，取上清液保存于-20℃待用。

(3)鱼胰岛素和鱼葡萄糖elisa试剂盒保存于4℃，使用前需室温平衡20分钟。浓缩洗涤液有结晶时，可水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

(4)设置标准品孔和样本孔，浓度为0的s0号标准品即可视为阴性对照，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl。

(5)样本孔先加待测样本10μl，后加样本稀释液40μl。

(6)标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的检测抗体100μl，用封板膜封住孔口，放置37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

(7)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗涤5遍。

(8)每孔加入底物a、b各50μl，用封板膜封住孔口，37℃避光孵育15min。

(9)每孔加入终止液50μl，15min内，用酶标仪在450nm波长、25℃下测定各孔吸光度值(od值)。

(10)在excel中，以标准品浓度为横坐标，对应的od值为纵坐标，绘制标准品线性回归曲线，其r值大于0.9900时才可按曲线方程计算各样品浓度值。

检测结果参照图3所示，由图3可知，相比于对照组，加8mmmtz处理48h后斑马鱼幼鱼组织液(图3中b图)、成鱼血液葡萄糖(图3中的d图)浓度有极显著升高，而相应胰岛素浓度有极显著降低(图3中的c图和e图)，表明本发明实施例1中tg(pdx1-mcherry-ntr)转基因斑马鱼可用来构建斑马鱼ⅱ型糖尿病模型。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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<110>闽南师范大学

<120>一种ⅱ型糖尿病斑马鱼模型的构建方法及应用

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thrglnaspserserleuglnaspglyglupheiletyrlysvallys

115120125

leuargglythrasnpheproseraspglyprovalmetglnlyslys

130135140

thrmetglytrpglualasersergluargmettyrprogluaspgly

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hisasngluasptyrthrilevalgluglntyrgluargalaglugly

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225230235

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354045

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505560

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859095

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100105110

alalysalaalaasnasplysglyarglysphephealaaspmethis

115120125

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130135140

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165170175

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180185190

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195200205

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210215