对花粉竞争力基因STK1;2的表达调控及在提高扩繁植物核雄性不育系效率中的应用的制作方法

本发明属于植物遗传育种及种子生产领域，具体涉及调控花粉受精竞争力基因stk1和stk2的表达调控及在提高扩繁植物核雄性不育系效率中的应用。

背景技术：

由于杂种优势的存在，使得杂交种的生物量、抗病虫能力、耐胁迫(干旱、高温、低温、盐碱等)能力较其双亲有相当的提升，如杂交玉米、杂交水稻的产量远远高于纯合的双亲。生产杂交种通常采用的方法为：将雌性亲本和雄性亲本种在一起，将雌性亲本的雄穗去除，而保留雄性亲本的雄穗，雌性亲本收获的种子即为杂交种。

自然界中的植物存在自花授粉、异花授粉及常异花授粉三种类型，自花授粉指一株植物的花粉，对同一个体的雌蕊进行授粉的现象。在两性花的植物中，又可分为同一花的雄蕊与雌蕊间进行授粉的同花授粉(菜豆属)和在一个花序(个体)中不同花间进行授粉的邻花授粉，以及同株不同花间进行授粉的同株异花授粉。有的植物雄蕊和雌蕊不长在同一朵花里，甚至不长在同一棵植株上，无法自花授粉，它们的雌蕊只能得到其他花的花粉，这叫做异花授粉。将天然杂交率高于50％且自交衰退的一类作物归为常异花授粉作物，如玉米。

玉米为雌雄同株，并且雌雄花位于植株的不同部位，玉米既可通过自花授粉也可通过异花授粉繁衍后代，自然条件下，当风将花粉从雄穗吹到雌穗的花丝上时即完成了天然授粉。

在玉米育种中首先应开发出纯合的玉米自交系，然后将两个自交系进行杂交，对杂交的后代进行产量、抗逆性等进行评估，以确定其是否具有商业化潜力。其中每个自交系都可能具有另一个自交系所缺乏的一种或多种优良性状，或补充另一个自交系的一种或多种不良性状。两个自交系杂交的第一代种子为f1代种子，f1代的种子发芽后获得f1代植株，f1代植株较两个自交系亲本(父母本)在生长势和抗逆性等方面均有很强优势，同时拥有更多的生物量。

可以通过对母本人工去雄来生产杂交种，即将未散粉的母本(其可与父本在田间间隔播种，如播种5行母本，一行父本)雄穗去除，保留父本雄穗。随后，只要对外来玉米花粉进行隔离，母本雌穗只能接受父本的花粉，得到的种子即为杂交种(f1)，该杂交种即可用于农业生产。

在生产杂交种的过程中由于环境的变化可能导致去雄完成后植株又雄穗化，或去雄不完全，以上两种情况均能导致母本自交授粉，致使生产的杂交种中混杂了母本自交系的种子，母本自交系的产量远低于杂交种的产量，这样的种子为不合格产品，即会影响农民收入又会影响制种公司信誉，严重的将导致制种公司承担相应的赔偿责任。

也可采用机器对母本进行去雄，机器去雄和手工去雄的可靠性基本相同，但更快并且成本更低。然而，较之手工去雄，大多数去雄机器会对植株造成更大的破坏，因此，目前没有令人完全满意的去雄手段，人们仍在寻找成本更低，去雄更彻底的替换方法。

稳定的雄性不育系统提供了简单高效的手段，通过使用核-质互作雄性不育(cms)自交系，可以在一些基因型中得以避免繁重的去雄工作。该手段包括三个主要材料，即不育系：雄性不育材料，保持系：可以为不育系提供花粉，使不育系的后代仍为不育系，恢复系：可以恢复不育系的育性。不育系与恢复系杂交产生f1，即用于农业生产的杂交种。更具体的说，核-质互作不育型，表现为核-质互作遗传。不但需要细胞质有不育基因s，而且需要细胞核里有纯合的不育基因(rfrf)，二者同时存在，方能使植株表现为雄性不育。如胞质基因为可育n，则不论核基因是可育(rfrf)还是不育(rfrf)，都表现为雄性可育。同样，如核里具有可育基因(rfrf)或(rfrf)，则不论胞质基因是可育n还是不育s，也都表现为雄性可育。这种由核-质互作形成的雄性不育系，其遗传组成为s(rfrf)，不能产生正常的花粉，但可作为杂交母本。由于能找到保持系n(rfrf)[用它与不育系杂交，所产生的f1仍能保持雄性不育，即：s(rfrf)(♀)×n(rfrf)→s(rfrf)(不育)]并能接受恢复系s(rfrf)或n(rfrf)[用它们与不育系杂交，所产生的f1都是可育的，即：s(rfrf)(♀)×s(rfrf)→s(rfrf)(f1)(可育)，或s(rfrf)(♀)×n(rfrf)→s(rfrf)(f1)(可育)]的花粉，使f1恢复为雄性可育，f1植株自交产生f2，所以在农业生产上可以广泛应用。雄性不育系可以免除人工去雄，节约人力，降低种子成本，还可保证种子的纯度。目前水稻、玉米、高粱、洋葱、蓖麻、甜菜和油菜等作物已经利用核质互作雄性不育进行杂交种子的生产；对其他作物的核-质互作雄性不育系，也正在进行广泛的研究。

cms也有它的缺陷，一是观察到个别cms材料容易感病，二是恢复系比较难寻找，这些问题阻碍了cms系统在制种中的广泛应用。

braretal的美国专利4654465和4727219中公开了一种类型的遗传不育性。但是，这种类型的遗传不育需要在基因组内的多个不同位点保持相应的基因型，需要每代对这些位点进行分子标记跟踪检测。patterson还描述了一种可能有用的染色体易位基因系统，但该系统更为复杂(见美国专利no.3861709和3710511)。

人们一直在尝试对雄性不育系统进行优化，例如，fabijanski,etal.开发了使植物雄性不育的方法(epo89/3010153.8公开号329308和作为wo90/08828公开的pct申请pct/ca90/00037)。主要是通过以下两种途径抑制植株的雄花育性，一种方法是将雄性组织特意表达的启动子与细胞毒素基因相连转入植株中，使雄花不能正常散粉同时不影响其他性状；另一种是通过基因干扰手段，将已经克隆的控制植株雄花育性的基因通过转基因的手段将其干扰，从而使其不能正常行使功能。还有通过一些基因调控元件来抑制基因表达，从而影响植株育性的手段(wo90/08829)。

在多数情况下，只有控制雄性不育的核基因隐性纯合(msms)植株才会表现为雄性不育，由于雄性不育植株无法自交，因此只能通过杂合植株(msms)与其杂交，才会得到雄性不育植株(msms)。并且在同一果穗上雄性不育籽粒(msms)与可育的杂合籽粒(msms)同时存在，通过籽粒无法分辨哪些是不育籽粒，哪些是可育籽粒，只能通过播种后，植株散粉时才可分辨。

近年来，也有利用转基因的手段来保持雄性不育植株的不育性(us6743968)。该方法将花粉致死基因与雄性生育能力恢复基因构建在一个载体中，导入雄性不育植株中，转基因后代表现为可育，但只能产生不含恢复基因的花粉。当这样的植株与雄性不育植株杂交，便保持了隐性不育植株的纯合隐性状态。其首先构建一个转基因载体，该载体含有一个花粉细胞致死基因，同时该载体还含有一个恢复植株育性的显性基因。将该载体转入雄性不育植株，并且该载体在转基因植株中以杂合状态存在，由于恢复育性基因的存在使得植株可育，当其与雄性不育植株杂交，由于含有恢复基因的花粉(msms)同时含有致死基因，使得花粉败育，因此只有不含恢复基因的花粉(ms)才能与雄性不育植株雌配子(ms)进行杂交，后代均为隐性纯合个体(msms)。

如前文所述，采用雄性不育系统制种的很多工作的一个重要问题在于如何利用雄性不育基因及如何分辨雄性不育种子、植株及可育种子、植株，同时还需要考虑如何将不育个体的不育性保持下来。

在玉米中已经鉴定了多种雄性不育突变体(skibbeetal.2005)，具体见下表:

表1由核基因引起的雄性不育突变体

以上这些基因已经陆续被克隆，如ms45(albertsenetal.1993)和ms26(ptc/us2006/024273)，同时，水稻中也有一些雄性不育基因被陆续克隆，如dpw(jingshietal.2011)以及拟南芥中鉴定到的一些雄性不育基因，如(aarts,etal.1993)。

技术实现要素：

本发明的目的是提升不育系的生产效率。

本发明提供的方法，用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态，所述方法包括：

(a)提供第一植株，其包含使植物雄性不育的纯合隐性等位基因(实施例中纯合隐性等位基因具体为ms45ms45)；

(b)提供第二植株，该植株包含同所述第一植株相同使植物雄性不育的纯合隐性等位基因，并且含有下述构建体，所述构建体(在实施例为转基因元件ms45-rnai)在所述第二植株中以杂合状态存在(杂合ms45-rnai/-插入片段仅存在于一条染色单体中，其姊妹染色单体不含有转基因元件)，所述构建体包含：

i.第一核苷酸序列，当其在所述第一植株中表达时将恢复所述第一植株雄性生育力；

ii.第二核苷酸序列，当其以杂合状态存在时即可影响花粉受精竞争力；

所述第一核苷酸序列(实施例中为序列1所示的ms45基因表达元件)与所述第二核苷酸序列(实施例中为stk1和stk2基因的干扰片段)紧密连锁，这两个核苷酸序列在植株中同时存在(在本发明的实施例中称之为转基因元件ms45-rnai)；

(c)用所述第二植株的雄性配子与所述第一植株的雌性配子受精，以产生保持了所述第一植株纯合隐性状态的后代。

上述方法为扩繁植物雄性不育系的方法；

和/或，所述植物、所述第一植株和所述第二植株均为双子叶植物或者单子叶植物；

和/或，所述植物、所述第一植株和所述第二植株均不仅可为玉米(zeamays)，同样可为水稻(oryzasativa)、高粱(sorghumbicolor)、小麦(triticumaestivum)、大豆(glycinemax)、棉花(gossypiumhirsutum)、向日葵(helianthusannuus)等作物。

上述方法中，所述第一核苷酸序列包括控制雄性生育能力的基因，如表1中的ms45的野生型等位基因ms45，这个控制雄性生育能力的基因不限于表1中列出的基因，玉米中或其他物种中控制雄性生育能力的基因也可达到本发明的目的，因此也在本发明的保护范围内。

上述方法中，在本发明的实施例中，所述第一植株为玉米雄性不育突变体ms45，具体为ms45纯合隐性自交系郑58(郑58(ms45ms45))，其源自ms45纯合隐性突变体(maizegeneticscooperationstockcenter，905i；突变位点在表1中记载ms45)和郑58(zheng58)的回交后代。

所述第一核苷酸序列在本发明的实施例中为ms45基因表达元件，所述ms45基因表达元件在所述第一植株中表达蛋白质ms45。

所述蛋白质ms45为如下a)或b)：

a)序列2所示的氨基酸残基组成的蛋白；

b)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的蛋白质。

上述方法中，所述ms45基因表达元件包括ms45基因启动子、ms45基因5’utr、ms45基因外显子、ms45基因内含子、ms45基因3’utr和ms45基因终止子；

所述ms45基因表达元件为如下1)或2)或3)所示的dna分子：

1)编码区包括序列1的dna分子或编码区包括序列3自5’端第4762-8265位的反向互补序列的dna分子；

2)编码区为序列1的dna分子或编码区为序列3自5’端第4762-8265位的反向互补序列的dna分子；

3)将1)或2)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与1)或2)具有相同功能的dna分子。

上述方法中，所述第二核苷酸序列在所述第二植株中以杂合状态存在时降低花粉受精竞争力，但不影响花粉育性。

上述方法中，所述第二核苷酸序列包括特定基因的干扰片段；所述特定基因为能够调控花粉受精竞争力的基因。该基因的表达量降低不影响相应花粉的育性(不同于花粉致死)，花粉能够发育正常，只是改变该转基因表达的花粉和野生型的花粉在受精竞争力上有明显区别，与野生型花粉混合条件下，转基因的花粉参与受精的竞争力大大下降。但是转基因的花粉能够完成正常的授粉受精，在全部为转基因花粉(没有竞争)的情况下授粉，能够正常结实，并达到很高的结实率。

本发明的一个实施例中，所述第二核苷酸序列包括stk1和stk2基因的干扰片段；所述干扰片段的反向互补序列如序列表的序列3中自5’端第11282-11875位所示。第二核苷酸序列即所述干扰片段的完整表达元件的反向互补序列如序列表的第序列3中自5’端第10982-13578位所示。

本发明涉及控制雄性生育能力及植株花粉竞争力的核苷酸序列，及利用这些核苷酸序列和转基因技术开发的扩繁植物雄性不育的方法。

本发明另一个目的是提供一种dna构建物。

本发明提供的构建物如上述方法中所述的构建体(实施例中为序列表的序列3所示的环状质粒)。

上述dna构建物可以恢复雄性不育突变体的育性同时改变植株的花粉竞争力。

本发明第3个目的是提供如下任一种的物质。

本发明提供的如下物质：

1)一种植物，该植物如上述方法中所述的第二植株；

2)由1)所述的植物产生的再生细胞的组织培养物；

3)由2)所述的组织培养物产生的原生质体；

4)一种植物，所述植物是利用上述方法产生的纯合隐性的雄性不育植株。

上述第二植株可以保持雄性不育植株的不育性。

利用上述方法产生的纯合隐性雄性不育植株在生产杂交种中的用途也是本发明保护的范围。

本发明的关键是将雄性恢复基因ms45和控制植株花粉竞争力的元件构建在一个载体中，该载体可以恢复雄性不育突变体ms45的育性，同时，含有转基因元件的植株花粉竞争力下降，因此，在不育系的培育过程中，含有转基因元件的植株(可育个体)比例下降，不育个体(不育系)比例上升，从而实现不育个体(不育系)的扩繁。

本发明的一个实施例中，发明人首先构建了一个植物转化载体，该载体中包含恢复雄性生育能力基因的表达元件和玉米花粉受精竞争力调控基因stk1和stk2基因的干扰片段，将该载体转入hiiia×hiiib玉米杂交种中，然后利用雄性不育植株对获得的转基因植株进行回交，从而将控制植物雄性生育能力ms45恢复基因和玉米花粉受精竞争力调控基因stk1和stk2基因的干扰片段导入雄性不育植株ms45中。由于存在恢复基因ms45，转基因植株表现为可育。当转基因杂合体植株(msmsms)与雄性不育植株(msms)杂交时，会产生以下两种后代，一种为不含有转基因序列的雄性不育个体(不育系，基因型为msms)，该不育系可以被任意一种野生型植株恢复育性，在制种过程中可作为不育系；另一种为含有转基因元件的可育籽粒(保持系，基因型为msmsms)，该保持系在控制雄性生育能力位点为隐性纯合，由于含有可以互补的转基因序列，该植株表现为可育，由于同时含有玉米花粉受精竞争力调控基因stk1和stk2基因的干扰片段，该植株花粉竞争力降低，保持系相对于不育系所占比例下降，不育系所占比例上升，实现不育系的扩繁。

本发明的其他目的在下文说明书和权利要求书中将是显而易见的。

本发明与现有扩繁植物核雄性不育系方法(例如本专利发明人申请的专利“

形态标记法扩繁植物核雄性不育系”)相比，具有一个突出优点，即获得的不育系比例显著提高(本发明获得的不育率比例提高到约80％，现有方法获得的不育率比例仅为50％左右)。

本发明通过在rna水平上降低花粉受精竞争力调控基因stk1和stk2(serinethreoninekinase1；2)表达水平，降低玉米花粉参与受精的竞争力，将其与转基因技术扩繁植物雄性不育系技术系统进行结合，提升不育系的生产效率。

附图说明

图1为雄性生育力突变体ms45(a)及野生型ms45(b)的雄花表型。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本文所用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义，除非特殊说明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公认的标准技术，材料，方法和例子仅作阐述，不加以限制。

细胞核雄性不育是由于小孢子形成过程中的关键基因被突变、抑制或受到其他影响的结果，这些基因被统称为雄性不育基因。花粉发育途径中受到很多基因的控制，因此很多基因的突变最终都会导致雄性不育，目前在玉米中鉴定了大量的雄性不育突变体(如表1所示)，每个雄性不育基因都有其特定的恢复基因，即每种雄性不育突变体，只能被其野生型等位基因恢复。

本发明以表1中的一个雄性不育突变体为例，如ms45，突变体雄花不能正常散粉(图1所示，a为雄性不育突变体，b为野生型)，该突变体育性可以被野生型植株中的ms45基因恢复。本发明中野生型恢复基因ms45来源于自交系b73，其序列见序列1，该序列包含ms45基因完整表达元件，即包含启动子、5’utr，外显子，内含子，3’utr和终止子。将序列1所示的核苷酸转入ms45雄性不育突变体后，突变体植株变现为可育。序列1所示的ms45基因表达元件编码序列2所示的ms45蛋白质。

本发明在扩繁植物核雄性不育系的过程中引入了功能元件，所述功能元件包括启动子、玉米花粉受精竞争力调控基因stk1和stk2基因的干扰片段和终止子。功能元件的表达能够导致花粉授粉的竞争力下降。

stk1基因在maizegdb的登录号为zm00001d045056。

stk2基因在maizegdb的登录号为zm00001d003377。

下文通过说明和阐述提供了更为详细的描述，这并非意欲对本发明的范围加以限制。

实施例1、构建包含雄性生育力基因ms45和功能元件及选择标记基因的植物转化载体

本发明以表1中的ms45雄性不育突变体为例，具体阐述实施方案。

将上述ms45基因完整表达元件和功能元件构建到载体中，得到本法发明构建的转化载体(序列表的序列3所示的环状质粒)。所述转化载体包含雄性生育力基因ms45、功能元件及选择标记基因bar。

序列表的序列3中，自5’端第4762-8265位为ms45基因完整表达元件的反向互补序列(在构建载体扩增时，序列3中自5’第5664位发生突变，与序列1产生1个碱基的差异，但未导致编码的氨基酸序列变化，不影响蛋白功能，其余碱基没有变化)，第10982-13578位为所述功能元件的反向互补序列(包含玉米花粉受精竞争力调控基因stk1和stk2基因的干扰片段的完整表达元件；其中，干扰片段的反向互补序列如第11282-11875位所示，启动子的反向互补序列如第11876-13578位所示，终止子的反向互补序列如第10986-11238位所示)，第13899-15353为选择标记基因bar的完整表达元件(其中，第13899-14576位编码启动子，第14621-15172位编码选择标记基因bar，第15179-15353位编码终止子)。所述雄性生育力基因ms45、功能元件及选择标记基因bar位于同一t-dna上。

实施例2、植物转化载体转化玉米获得转基因玉米

(一)植物转化载体转化玉米

本发明通过农杆菌侵染玉米幼胚的方法获得转基因植株。将实施例1的植物转化载体转化农杆菌eha105，得到重组农杆菌，再用重组农杆菌侵染玉米幼胚，具体如下：

将实施例1的植物转化载体转化农杆菌eha105，得到重组农杆菌。

实验室在转基因过程中所用受体为自交系hiiia和hiiib的杂交f1代。玉米自交系hiiia和hiiib(armstrongcl,greenceandphillipsrl.developmentandavailabilityofgermplasmwithhightypeiicultureformationresponse.maizegeneticscooperationnewsletter,1991,65:92-93)。

首先在田间种植玉米自交系hiiia和hiiib，到自交系散粉时分别套袋；然后准备授粉，有两种授粉方式：hiiia作母本，hiiib作父本；hiiia作父本，hiiib作母本，授粉后9-11天，取授粉果穗籽粒上的未成熟杂交幼胚；然后在室内进行根癌农杆菌eha105侵染，将被根癌农杆菌eha105侵袭的幼胚放在选择培养基上进行多次筛选，获得抗性愈伤组织，将抗性愈伤组织再生成苗，得到转基因t0代植株。获得转基因t0代以后，用t0代转基因植株的花粉对一些制种母本及ms45雄性不育材料进行杂交，并观察表型。

采用根癌农杆菌eha105侵染法将实施例1的植物转化载体导入受体植株的幼胚，经除草剂双丙胺磷筛选后获得转基因植株。具体方法为：

具体方法为：

一、剥离幼胚

1、去除苞叶。切除hiiia和hiiib的杂交f1代果穗顶端约1cm左右，用镊子从顶端插入果穗，这样可以以镊子当作把手，有利于操作，然后把果穗放入含有消毒液的烧杯里，根据实际需要，可以在同一个烧杯里放4-6个果穗。

2、向烧杯里加约700ml的消毒液(50％的漂白剂或5.25％的次氯酸钠，并加入一滴tween20)用来浸泡果穗，在消毒20分钟过程当中，不时的旋转果穗同时轻轻拍打烧杯以驱除籽粒表面的气泡，从而达到最佳的消毒效果，消毒结束后，取出果穗并放入盛满灭菌水的烧杯里，在水里洗3次，然后准备剥胚。

3、把消毒过果穗的一端放在一个大的培养皿上，用大的手术刀削掉籽粒的顶部(1.5-1.8mm)，在这过程当中，要勤消毒所用的工具，如：手术刀片、培养皿、剥胚刀等。

4、用剥胚刀的刀尖插在胚和胚乳之间,然后轻轻向上撬出幼胚,用小的手术刀尖轻轻托起幼胚,确保幼胚不受到任何的损伤,把幼胚的胚轴面紧贴放有滤纸的n6e培养基,胚的密度大约是2x2cm(30个/皿)。

5、用封口膜封住培养皿，28度暗培养2-3天。

二、农杆菌浸染

1、重组农杆菌要在yep(含kana33mg/l和str100mg/l抗生素)培养基上提前一周培养，并在4度冰箱保存一个月左右，长期保存要在-80度甘油保存

2、重组农杆菌要在yep培养基上在19℃培养3天，同时加kana(33mg/l),str(50mg/l)。

3、3天以后，挑取重组农杆菌放入含有5ml浸染培养基的50ml离心管中,同时加100umas(inf+as),在室温(25度)转速75rpm摇菌2-4个小时。

4、浸染幼胚，把刚剥离的幼胚放入含有inf+as液体培养基(2ml)的离心管中，每管约20-100个幼胚，用这样的培养基洗涤2次，然后加入1-1.5ml特定浓度(od550＝0.3-0.4)的农杆菌，轻轻颠倒离心管20次，然后直立放置在暗箱里5分钟，确保幼胚全部浸泡在农杆菌液体里，整个过程避免旋涡振荡。

三、共培养

1、浸染以后，把浸染过的幼胚转移到共培养培养基(溶质如表2，溶剂为水),使幼胚的胚轴接触培养基表面，同时驱除培养基表面多余的农杆菌；

2、用封口膜封住培养皿，在20度条件下暗培养3天。

四、静息培养

1、共培养3天后，把幼胚转移到静息培养基(溶质如表2，溶剂为水)上面，同时用封口膜封住培养皿，放在28度条件下暗培养7天。

五、选择

1、7天后，把所有的幼胚转移到选择培养基(溶质如表2，溶剂为水)上面(35个幼胚/每皿)，培养两周，选择培养基含有双丙胺磷1.5mg/l,两周后再进行亚培养双丙胺磷的浓度可以上升到3mg/l。

2、浸染大约5周左右，含有转化子的细胞会长成可以看见的ⅱ型愈伤组织。

六、转基因植株的再生

1、在再生培养基i(溶质如表2，溶剂为水)上面长3周，然后在再生培养基ii(溶质如表2，溶剂为水)上面发芽(在光照培养室)，得到t0代转基因玉米。

2、待再生苗生长出3-4片叶时，将其转移到温室，待其生长至吐丝散粉期时，对其进行授粉。

表2培养基的溶质及含量

表2中，ms盐购自phytotechnologylaboratories公司，货号为m524。

(二)、分析获得的转基因植株

将(一)得到的t0代转基因玉米与ms45纯合隐性突变体(ms45雄性不育材料，maizegeneticscooperationstockcenter，905i)杂交，得到杂交后代。

1、检测杂交后代的基因型

通过bar基因的检测确定是否含有转基因元件ms45-rnai；bar基因检测方法：用如下引物bar669f和bar669r:对杂交后代进行pcr扩增，若含有大小669bp目的片段，则杂交后代为含有转基因元件ms45-rnai的杂交后代，若不含有大小669bp目的片段，则杂交后代为不含有转基因元件ms45-rnai的杂交后代。

上述引物bar669f和bar669r序列如下：

bar669f:5'tctcggtgacgggcaggac3'

bar669r:5'tgacgcacaatcccactatcctt3'

部分杂交后代杂交果穗上含有表达元件的籽粒比例统计如表3所示。

表3

结果显示，共有三个转基因株系杂交果穗上含有表达元件的籽粒比例低于20％，这是由于含有转基因元件的植株花粉授粉的竞争力下降，转基因植株与雄性不育突变体ms45杂交产生的后代中，含有转基因元件的籽粒比例低。

将stk-68、stk-111和stk-125用于后续实验。

实施例3、使用雄性不育保持系对ms45雄性不育自交系进行大规模扩繁

可采用实施例中制备转基因植株经对ms45雄性不育自交系进行扩繁，具体如下：

(一)ms45ms45野生型自交系转变为第一植株ms45ms45纯合隐性自交系

以ms45纯合隐性突变体(maizegeneticscooperationstockcenter，905i，为母本，与自交系(如郑58(zheng58))杂交，获得的f1继续与玉米自交系郑58(河南省农科院粮作所)回交，对获得的bc1群体进行基因型分析，筛选ms45位点为杂合的植株继续与郑58回交，如此回交5-6代后，利用分子标记筛选ms45位点为杂合，农艺性状表型与郑58接近的单株进行自交，从而获得ms45纯合隐性自交系郑58(郑58(ms45ms45))，该自交系即可作为不育系，将其称为第一植株；

上述筛选ms45位点的基因型的方法如下：用如下引物ms45f和ms45r进行pcr扩增，ms45目的片段大小：859bp,ms45目的片段大小：811bp。若同时得到859bp和811bp目的片段，则为ms45位点为杂合ms45/ms45，若无811bp片段，则ms45位点为ms45/ms45显性纯合；若无859bp目的片段，则为ms45/ms45隐性纯合。

ms45f:5'-cttgagcgacagcgggaact-3',

ms45r：5'-tgttgtttcttggcaaaggtcag-3'。

(二)、制备第二植株

制备第二植株ms45-rnai杂合且ms45纯合

将(一)得到的ms45纯合隐性自交系郑58(郑58(ms45ms45))(第一植株，母本)与实施例2得到的t0代转ms45-rnai玉米(父本)杂交，然后再以ms45纯合隐性自交系郑58(郑58(ms45ms45))(第一植株)为轮回亲本进行多代回交，将来自实施例2的t0代转ms45-rnai玉米转变为含有ms45-rnai杂合且ms45位点为纯合隐性的自交系，该自交系即为ms45-rnai杂合且ms45纯合的第二植株，又名郑58(ms45-lc杂合且ms45纯合隐性)。

具体方法如下：

自交系郑58(郑58(ms45ms45))杂交，从杂交后代中挑选含有转基因元件的籽粒(通过检测bar基因确定是否转基因元件，下同)播种到田间后将实施例2中的t0代转ms45-rnai玉米(父本)与(一)得到的ms45纯合隐性喷施200mm的双丙胺磷，对存活的植株继续与郑58(ms45ms45)回交，如此回交5-6代后，由于回交过程中一直选择含有转基因元件的籽粒或植株与第一植株杂交，含有转基因元件的籽粒或植株含有转基因位点(ms45-rnai)，因此得到的后代中含有转基因元件的籽粒或植株转基因位点(ms45-rnai)均为杂合。利用含有转基因元件的籽粒或植株的花粉给第一植株授粉，得到的不含有转基因元件的籽粒或正常植株若均为不育，则提供花粉的植株转基因位点ms45-rnai为杂合且ms45位点为隐形纯合，即为第二植株。

(三)保持系的获得

将(二)得到郑58(ms45-rnai杂合且ms45纯合)第二植株为父本，与(一)得到的ms45纯合隐性自交系郑58(郑58(ms45ms45))(母本)杂交，产生的后代不但有郑58(ms45ms45)，而且还有雄性不育郑58的保持系郑58(ms45-rnai杂合ms45ms45)。郑58(ms45ms45)的籽粒为不含有转基因元件的籽粒，而其保持系郑58(ms45-rnai杂合ms45ms45)籽粒为含有转基因元件的籽粒。

(四)、使用雄性不育保持系对ms45雄性不育自交系进行大规模扩繁

以郑58自交系为例，将(一)得到的第一植株雄性不育系郑58(ms45ms45)和(三)得到的雄性不育保持系郑58(ms45-rnai杂合ms45ms45)播种到田间，两个材料相隔播种，每播种1行保持系相应的播种5行不育系，确保繁种周边300米内无其他玉米播种，让不育系与保持系田间自然授粉。保持系只能接受自己的花粉，产生的后代中由于含有纯合的转基因成分的籽粒与杂合的籽粒无法辨别，这些籽粒予以丢弃，而不含有转基因元件的籽粒可以作为不育系。不育系材料接受了保持系的花粉，其后代中不含有转基因元件的为不育系，而含有转基因元件的为保持系。保持系全部用于下一年扩繁不育系和保持系，而不育系中大部分用于生产商品种，剩余的小部分用于下一年扩繁不育系和保持系。由于含有转基因元件ms45-rnai的植株花粉授粉的竞争力下降，所以保持系所占比例远远小于不育系(保持系约占20％，不育系约占80％)，由此实现不育系扩繁系数的提高，降低成本。

实施例4、利用实施例3中的雄性不育系大规模生产杂交种

在实施例3中生产的不育系为细胞核控制的隐性纯合不育系，该不育系可以被任意的野生型植株(ms45ms45)恢复育性。

因此只要选择一个与雄性不育(ms45ms45)自交系,如雄性不育郑58(ms45ms45)配合力高的自交系，如昌7-2进行杂交，便可以生产出农艺性状优良的杂交种。为了达到以上目的，将雄性不育自交系与野生型自交系隔行播种于田间，确保繁种周边300米内无其他玉米播种，不育系的果穗只能接受野生型自交系的花粉，而野生型自交系只能自交。这样不育系果穗上所产生的种子为杂交种。

序列表

<110>中国农业大学

<120>对花粉竞争力基因stk1;2的表达调控及在提高扩繁植物核雄性不育系效率中的应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3504

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tgctgagttctccttgggttatccatggtgtctctatgaaaaagatgagtacaatgtgtc60

tatatccgttttcttagggtcccttcttctgccttattactgactgaatcggggttacaa120

aaaaacttccacgggtgcatgatctccatgttccacttctcccacctcgcgttgcacatt180

tcttggatgtcggtggttcccatctgaccgaggcccatcagacacctttcgggacaccca240

tcaagggcctttcggatggcccacgagacgtatcgggtcgtggtgatccaggggatatat300

gtcccccacaatcgtcacctatattattattctttagatattatttaatttttggaaaaa360

taacaaacttatacttttgtgtagggcctcagcatagattttcgcttagggcccagaaat420

gcgaggaccagccatgtctagtgtccactattggcactacccagaacaagatttaaaaaa480

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tacaaacatctaagagcgacaaattatatcgaaaggtaagctatgacgttcagatttttc660

tttttcattcttgttattttgttattgtttttatatacattttcttctcttacaatagag720

tgattttcttccgattttataaaatgactataaagtcatttttatataagagcacgcatg780

tcgtagattctcgttcaaaaatctttctgatttttttaagagctagtttggcaaccctgt840

ttctttcaaagaattttgattttttcaaaaaaaattagtttattttctctttataaaata900

gaaaacacttagaaaaatagagttgccagactagccctagaatgttttcccaataaatta960

caatcactgtgtataattatttggccagccccataaattatttaaaccgaaactgaaatc1020

gagcgaaaccaaatctgagctatttctctagattagtaaaaagggagagagagaggaaga1080

aatcagttttaagtcattgtccctgagatgtgcggtttggcaacgatagccaccgtaatc1140

atagctcataggtgcctacgtcaggttcggcagctctcgtgtcatctcacatggcatact1200

acatgcttgttcaaccgttcgtcttgttccatcgtccaagccttgcctattctgaaccaa1260

gaggatacctactcccaaacaatccatcttactcatgcaacttccatgcaaacacgcaca1320

tatgtttcctgaaccaatccattaaagatcacaacagctagcgttctcccgctagcttcc1380

ctctctcctctgccgatctttttcgtccaccagcatggagaagaggaacctgcagtggcg1440

gcgagggcgtgatggcatcgtgcagtaccctcacctcttcttcgcggccctggcgctggc1500

cctcctagtcgcggacccgttcggcctcagtccgctggccgaggtcgactaccggccggt1560

gaagcacgagctcgcgccgtacggggaggtcatgggcagctggcccagagacaatgccag1620

ccggctcaggcgcgggaggctggagttcgtcggcgaggtgttcgggccggagtctatcga1680

gttcgatctccagggccgcgggccgtacgccggcctcgccgacggccgcgtcgtgcggtg1740

gatgggcgaggaggccgggtgggagacgttcgccgtcatgaatcctgactggtaagtgct1800

cgatatcgctccggcgtccactcgttacatgctataatatagtagtactaagatattttg1860

atctgattttttgcattcttgggagaaacgtcatgcaaaatttgttgtttcttggcaaag1920

gtcagaagaagtctgtgccaatggagtgaactcaacgacgaggaagcagcacgagaagga1980

ggagttctgcggccggccgctcggcctgaggttccacggggagaccggcgagctctacgt2040

cgccgacgcgtactacggtctcatggtcgttggccagagcggcggcgtggcgtcctccgt2100

cgcgagggaagccgacggggaccccatccggttcgcgaacgacctcgatgtgcacaggaa2160

tggatccgtattcttcactgacacgagcatgagatacagcagaaagtgagcaaagcgacg2220

taacaatccggcttctcattttcaaacgcctctgtattctctgctgaaagagtagctcac2280

cagacaagagctgaatttgcagggaccatctgaacatcctgttagaaggagaaggcaccg2340

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caaactgcaggtaacaaaaatactatctgacgatgctcatgattctaccgtatccatagt2520

catgaacacaaaccacacgaatctggccttgaccaggataatgaggtactggctggaagg2580

cccaagagcgggcgaggtagaggtgttcgcgaacctgccgggcttccccgacaacgtgcg2640

ctccaacggcaggggccagttctgggtggcgatcgactgctgccggacgccggcgcagga2700

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tgtacgtctataaatgtctaatgcagtcactggttgtaatcttgtttgtgtttggcaaat3060

tggcataataatggacagattcaatgggcattggtgctgtagtcgcatcacactaattga3120

atgggatcatgttgagctctcactttgctacaatttgctccagcttgtacggttgtaccc3180

tcttgctcgtctatagtaagggccatctaaaaaaaactcaaattagatctgcaatacaag3240

tatgattgggccgaatttggattgtcacgggtccgcgaccgcgaattgggctcggtttga3300

tttagccgacatagtagtgaccgacccgagccggcggcgagccaaaccgagcggacgccg3360

ccatggatcgcgagtggggctccaagcccggcagcggcggcgccgcctccgcgcagaatg3420

aggccatcgaccggcgggagcgcctccgccgcctggccctcgagaccatcgacctcgcca3480

aggacccctatttcatgcgcaacc3504

<210>2

<211>412

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

metglulysargasnleuglntrpargargglyargaspglyileval

151015

glntyrprohisleuphephealaalaleualaleualaleuleuval

202530

alaasppropheglyleuserproleualagluvalasptyrargpro

354045

vallyshisgluleualaprotyrglygluvalmetglysertrppro

505560

argaspasnalaserargleuargargglyargleugluphevalgly

65707580

gluvalpheglyprogluserileglupheaspleuglnglyarggly

859095

protyralaglyleualaaspglyargvalvalargtrpmetglyglu

100105110

glualaglytrpgluthrphealavalmetasnproasptrpserglu

115120125

gluvalcysalaasnglyvalasnserthrthrarglysglnhisglu

130135140

lysglugluphecysglyargproleuglyleuargphehisglyglu

145150155160

thrglygluleutyrvalalaaspalatyrtyrglyleumetvalval

165170175

glyglnserglyglyvalalaserservalalaargglualaaspgly

180185190

aspproileargphealaasnaspleuaspvalhisargasnglyser

195200205

valphephethraspthrsermetargtyrserarglysasphisleu

210215220

asnileleuleugluglygluglythrglyargleuleuargtyrasp

225230235240

progluthrserglyvalhisvalvalleulysglyleuvalphepro

245250255

asnglyvalglnilesergluasphisglnpheleuleupheserglu

260265270

thrthrasncysargilemetargtyrtrpleugluglyproargala

275280285

glygluvalgluvalphealaasnleuproglypheproaspasnval

290295300

argserasnglyargglyglnphetrpvalalaileaspcyscysarg

305310315320

thrproalaglngluvalphealalysargprotrpleuargthrleu

325330335

tyrphelyspheproleuserleulysvalleuthrtrplysalaala

340345350

argargmethisthrvalleualaleuleuaspglygluglyargval

355360365

valgluvalleugluaspargglyhisgluvalmetlysleuvalser

370375380

gluvalarggluvalglyarglysleutrpileglythrvalalahis

385390395400

asnhisilealathrileprotyrproleugluasp

405410

<210>3

<211>21708

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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caaaataatagtaaaatgtttagttttggataagttttgcttaattaccctctcatggaa1380

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