一种猪NLRP3炎症小体体外模型的构建方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪nlrp3炎症小体体外模型的构建方法。

背景技术：

nlrp3炎症小体是存在于细胞胞浆内的一种模式识别受体，是由多个蛋白组成的一种大分子蛋白质复合物，能感受机体体内外的各种刺激，活化下游信号通路，从而刺激炎性因子的活化和产生，引起炎症反应。

nlrp3炎症小体由nod样受体的一种——nlrp3(nlrfamily，pyrindomaincontaining3)蛋白、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosisassociatedspeck-likeproteincontainingacarddomain，asc)以及半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶1前体(pro-caspase-1)三个蛋白组成。其中，asc作为衔接蛋白，在病原刺激或机体处于危险状态时，其蛋白两端会分别与nlrp3、pro-caspase-1结合形成nlrp3-asc-pro-caspase-1蛋白复合体，即nlrp3炎症小体，进而使无活性的半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶1前体(pro-caspase-1)活化为有活性的caspase-1，活化的caspase-1会对无活性的pro-il-1β进行加工使其成为有活性的il-1β并分泌至细胞外，从而引起炎症的发生。

nlrp3炎症小体是目前研究较多的一种炎症复合体，它在免疫反应中发挥了重要的作用。在猪上，nlrp3炎症小体的研究也有着重要的意义。已有研究表明，猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、经典猪瘟病毒(csfv)、链球菌等病原体感染机体都会诱导nlrp3炎症小体的活化和组装，进而促进gsdmd和炎性因子如il-1β的活化和释放，导致细胞焦亡和炎症反应的发生，最终抑制病原体在机体内的增殖。因此，nlrp3炎症小体在机体抵抗prrsv、csfv、链球菌等病原体感染的先天性免疫反应中都起到了非常重要的作用。另一方面，nlrp3炎症小体的过度激活会引起“细胞因子风暴”，进而导致多器官功能衰竭及更为严重的全身性疾病，甚至导致死亡。

综上所述，对猪nlrp3炎症小体进行更为深入的研究对猪病的防治有着重要的意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种猪nlrp3炎症小体体外模型的构建方法，为后续nlrp3炎症小体激活机制的研究奠定基础，并为相关猪病的治疗和防控提供建议。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种猪nlrp3炎症小体体外模型的构建方法，包括：

构建重组质粒pcmv-n-myc-nlrp3、重组质粒pcmv-n-ha-caspase-1、重组质粒pcmv-n-ha-asc、重组质粒pcmv-n-myc-il-1β；

将上述4个重组质粒共转染至hek293t细胞内，经培养，得猪nlrp3炎症小体体外模型。

作为本发明的猪nlrp3炎症小体体外模型的构建方法的改进：

将上述4个重组质粒共转染至hek293t细胞内，转染剂量分别为pcmv-n-myc-nlrp3：200ng、pcmv-n-ha-asc：20ng、pcmv-n-ha-caspase-1：100ng、pcmv-n-myc-il-1β：800ng；于37℃、5％co2培养箱内培养，培养时间为(30±2)h，结束培养，得猪nlrp3炎症小体体外模型。

作为本发明的猪nlrp3炎症小体体外模型的构建方法的进一步改进：

以经lps刺激的猪肺泡巨噬细胞cdna为模板，pcr扩增nlrp3、asc、pro-caspase-1、pro-il-1β基因的相应片段，经酶切后与相应空载连接，nlrp3和pro-il-1β连接入pcmv-n-myc空载、asc和pro-caspase-1连接入pcmv-n-ha空载，从而构建重组质粒pcmv-n-myc-nlrp3、重组质粒pcmv-n-ha-caspase-1、重组质粒pcmv-n-ha-asc、重组质粒pcmv-n-myc-il-1β。

作为本发明的猪nlrp3炎症小体体外模型的构建方法的进一步改进：

pcr扩增相应目的片段所使用的引物分别为：

nlrp3：

上游：5'-acgcgtcgaccatgagcatggcaagcgtccgct-3'

下游：5'-ataagaatgcggccgcctactgggaaggctcaaag-3'

pro-caspase-1：

上游：5'-ggaggcccgaattcggtcgaccatggccgataaggtgctga-3'

下游：5'-catgtctggatccccgcggccgcttaatgtcctgggaagagataaaaag-3'

asc：

上游：5'-ccggaattcctatggggtgcacgcgtgac-3'

下游：5'-cggggtacctcagctctgctccaggt-3'

pro-il-1β：

上游：5'-acgcgtcgaccatggccatagtacctgaacccg-3'

下游：5'-aaggaaaaaagcggccgcttagggagagagg-3'。

本发明的猪nlrp3炎症小体体外模型的构建方法，具体包括以下步骤：

1)、真核表达质粒的构建：以经lps刺激的猪肺泡巨噬细胞cdna为模板，pcr扩增nlrp3、asc、pro-caspase-1、pro-il-1β基因的相应片段，经酶切后与相应空载连接(nlrp3和pro-il-1β连接入pcmv-n-myc空载、asc和pro-caspase-1连接入pcmv-n-ha空载)，连接产物转化入感受态细胞中涂板培养；待菌落长出后挑取单菌落进行摇菌培养并提取质粒进行酶切及测序，验证重组质粒是否构建成功；

2)、重组质粒表达验证：将酶切及测序验证无误的四个重组质粒分别转染至hek293t细胞内，收取细胞蛋白并用westernblot方法验证各蛋白的表达情况；

重组质粒表达验证所用转染量分别为：nlrp3：1.6μg、asc：0.8μg、pro-caspase-1：1.0μg、pro-il-1β：1.6μg。

3)重组质粒共转染：调整各质粒的转染浓度，按优化后的转染浓度将四个质粒共转染至hek293t细胞内，收集细胞上清，使用elisa方法检测上清中的il-1β的分泌情况。

进一步的具体步骤如下：

(1)真核表达质粒的构建：

以经lps刺激的猪肺泡巨噬细胞cdna为模板，pcr扩增nlrp3、asc、pro-caspase-1、pro-il-1β基因的相应片段。其中，pcr所用的引物分别为：nlrp3、pro-caspase-1、asc、pro-il-1β；

pcr产物经纯化回收后使用相应的限制性核酸内切酶酶切，再将酶切产物纯化回收后使用t4连接酶连接，随后将连接产物转化至感受态细胞中进行涂板培养，待菌落长出后挑取单菌落进行摇菌培养并提取质粒进行酶切及测序，验证重组质粒是否构建成功。

(2)重组质粒表达验证：将酶切及测序验证无误的四个重组质粒分别转染至hek293t细胞内，所用转染量分别为：nlrp3：1.6μg、asc：0.8μg、pro-caspase-1：1.0μg、pro-il-1β：1.6μg。收取细胞蛋白并用westernblot方法验证各蛋白的表达情况。

(3)重组质粒共转染：调整各质粒的转染浓度，按优化后的转染浓度将四个质粒共转染至hek293t细胞内，所用转染量分别为：nlrp3：200ng、asc：20ng、pro-caspase-1：100ng、pro-il-1β：800ng。收集细胞上清，使用elisa方法检测上清中的il-1β的分泌情况。

本发明相对于现有技术具有如下的技术优势：

1、目前尚无与本发明相似的技术。本发明首次使用重组质粒在hek293t细胞内体外构建猪的nlrp3炎症小体模型，具有方法简便、成本较低等优点。

2、本发明涉及的猪nlrp3炎症小体体外模型的构建，为后续其激活机制和调控机制的研究奠定了基础，有利于为相关猪病的防治提供新思路和新靶点。

综上所述，本发明公开一种猪nlrp3炎症小体的体外模型构建方法。通过体外构建nlrp3炎症小体四个组分蛋白(nlrp3、asc、pro-caspase-1、pro-il-1β)的真核表达质粒，经酶切及测序验证无误后，分别转染hek293t细胞，经westernblot验证各真核质粒的蛋白表达情况；之后优化各质粒转染浓度，将四个质粒按优化后浓度共转染到hek293t细胞内，通过elisa方法检测细胞上清中il-1β的分泌情况。由于hek293t细胞本身并不表达nlrp3炎症小体的四个组分蛋白(nlrp3、asc、pro-caspase-1、pro-il-1β)，因此体外构建该nlrp3炎症小体的反应平台为后续开展猪相关炎性疾病的研究提供了重要模型。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为pcr扩增nlrp3、pro-caspase-1、asc、pro-il-1β基因后的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为四种重组质粒的dna序列图谱。

图3为酶切验证重组质粒的琼脂糖凝胶电泳图。

图4为westernblot鉴定各融合蛋白的表达，即为各重组质粒转染hek293t细胞后westernblot验证融合蛋白表达的结果图。

图5为各重组质粒分别单独转染及共转染hek293t后il-1β的释放量的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

使用lps刺激猪肺泡巨噬细胞后提取细胞rna并反转录合成cdna，以cdna为模板pcr扩增nlrp3、pro-caspase-1、asc、pro-il-1β基因。

猪的肺泡巨噬细胞系3d4/21可从atcc购得，经500ng/ml浓度的lps刺激4小时后，用rna-quickpurificationkit试剂盒(购自esscience)提取细胞总rna，采用iscript^tmcdnasynthesiskit试剂盒(购自bio-rad)反转录合成cdna。

具体如下：

pcr所用的引物分别为：

nlrp3：

上游：5'-acgcgtcgaccatgagcatggcaagcgtccgct-3'

下游：5'-ataagaatgcggccgcctactgggaaggctcaaag-3'

pro-caspase-1：

上游：5'-ggaggcccgaattcggtcgaccatggccgataaggtgctga-3'

下游：5'-catgtctggatccccgcggccgcttaatgtcctgggaagagataaaaag-3'

asc：

上游：5'-ccggaattcctatggggtgcacgcgtgac-3'

下游：5'-cggggtacctcagctctgctccaggt-3'

pro-il-1β：

上游：5'-acgcgtcgaccatggccatagtacctgaacccg-3'

下游：5'-aaggaaaaaagcggccgcttagggagagagg-3'；

pcr扩增体系为：2×phantamaxmastermix25μl、上游引物(10μm)2μl、下游引物(10μm)2μl、cdna10μl、ddh2o补足至50μl。

pcr扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，退火15s(nlrp3为62℃、pro-caspase-1为66℃、asc为62℃、pro-il-1β为61℃)，72℃延伸3.5min，共30个循环，后72℃终延伸5min。

pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，其结果如图1所示。nlrp3基因大小为3111bp，pro-caspase-1基因大小为1215bp，asc基因大小为591bp，pro-il-1β基因大小为804bp。由电泳结果图比对可得，扩增条带大小与预期目的条带大小一致。因此，可得知：此pcr扩增获得了nlrp3、pro-caspase-1、asc、pro-il-1β基因片段。

实施例2、

pcr产物经纯化回收后使用相应的限制性核酸内切酶酶切，再将酶切产物纯化回收后使用t4连接酶连接，随后将连接产物转化至感受态细胞中进行涂板培养，待菌落长出后挑取单菌落进行摇菌培养并提取质粒进行酶切及测序，验证重组质粒是否构建成功。

具体如下：

将上述pcr产物经酶切后与相应空载连接，nlrp3和pro-il-1β连接入pcmv-n-myc空载、asc和pro-caspase-1连接入pcmv-n-ha空载，从而获得重组质粒pcmv-n-myc-nlrp3、重组质粒pcmv-n-ha-caspase-1、重组质粒pcmv-n-ha-asc、重组质粒pcmv-n-myc-il-1β。

重组质粒pcmv-n-myc-nlrp3使用hindiii进行单酶切，由于重组质粒序列中有两个hindiii酶切位点，因此重组质粒经酶切后大小分别为1176bp和5711bp；重组质粒pcmv-n-ha-caspase-1使用ecori和nhei进行双酶切，酶切后大小分别为1465bp和3514bp；重组质粒pcmv-n-ha-asc使用ecori和kpni进行双酶切，酶切后大小为603bp和3752bp；重组质粒pcmv-n-myc-il-1β使用ecori进行单酶切，而该重组质粒上有两个ecori酶切位点，因此酶切后大小为686bp和3894bp。所有重组质粒图谱见图2。

酶切过夜后进行琼脂糖凝胶电泳验证，其结果如图3所示，各重组质粒酶切后条带大小与预期相符，将质粒送测序，测序结果与ncbi公布的基因序列相一致；因此表明四个重组质粒均构建成功。

实施例3、重组质粒表达验证

将构建成功(酶切及测序验证均无误)的重组质粒pcmv-n-myc-nlrp3、pcmv-n-ha-caspase-1、pcmv-n-ha-asc、pcmv-n-myc-il-1β分别转染至hek293t细胞内。对应5×10⁵个hek293t细胞而言，上述4种重组质粒的所用转染量分别为：nlrp3：1.6μg、asc：0.8μg、pro-caspase-1：1.0μg、pro-il-1β：1.6μg。于37℃、5％co2细胞培养箱内培养24h后提取胞浆蛋白进行westernblot验证，即，收取细胞蛋白并用westernblot方法验证各蛋白的表达情况。

结果如下：

结果如图4所示。各重组质粒表达的融合蛋白的大小分别为：pcmv-n-myc-nlrp3：118.4kd；pcmv-n-ha-caspase-1：44.9kd；pcmv-n-ha-asc：21.9kd；pcmv-n-myc-il-1β：29.9kd；β-actin：42kd。由图4可见各组的β-actin均有明显且较为一致的条带，可得各组细胞均可正常表达。未转染组(空白对照组)无特异性条带，而各质粒转染组均在相应条带大小处有特异性条带。由此可得，各重组质粒均可在hek293t细胞中正常表达。

实施例4、重组质粒共转染

将重组质粒pcmv-n-myc-nlrp3、pcmv-n-ha-caspase-1、pcmv-n-ha-asc、pcmv-n-myc-il-1β共转染至hek293t细胞中。对应5×10⁵个hek293t细胞而言，上述4种重组质粒的所用转染量分别为：nlrp3：200ng、asc：20ng、pro-caspase-1：100ng、pro-il-1β：800ng。

于37℃、5％co2细胞培养箱内培养30h，即，转染30小时后收集上清，elisa检测上清中il-1β的分泌情况。如图5，从左至右的6列分别对应代表未转染组、转染重组质粒pcmv-n-myc-nlrp3组、转染重组质粒pcmv-n-ha-asc组、转染重组质粒pcmv-n-ha-caspase-1组、转染重组质粒pcmv-n-myc-il-1β组、四种重组质粒共转染组。

elisa结果显示，转染30小时后，共转染组上清中含有高浓度的il-1β，而单转染组及空白对照组上清中只能检测到微量的il-1β，说明本发明在hek293t细胞中成功构建了nlrp3炎症小体反应系统。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>浙江大学

<120>一种猪nlrp3炎症小体体外模型的构建方法

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>33

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

acgcgtcgaccatgagcatggcaagcgtccgct33

<210>2

<211>35

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ataagaatgcggccgcctactgggaaggctcaaag35

<210>3

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ggaggcccgaattcggtcgaccatggccgataaggtgctga41

<210>4

<211>49

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

catgtctggatccccgcggccgcttaatgtcctgggaagagataaaaag49

<210>5

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ccggaattcctatggggtgcacgcgtgac29

<210>6

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

cggggtacctcagctctgctccaggt26

<210>7

<211>33

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

acgcgtcgaccatggccatagtacctgaacccg33

<210>8

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

aaggaaaaaagcggccgcttagggagagagg31