烟草NtYcf45-like蛋白及其应用的制作方法

本发明属于烟草基因工程领域，具体涉及一个烟草ntycf45-like蛋白及其应用专利申请。

背景技术：

人们通常所吸食的烟草属双子叶植物纲管花目茄科烟草属植物，烟草属(nicotiana)有60多个种，而用于制备吸食的主要为两个栽培种，分别为普通烟草(又称红花烟草，nicotianatabacum)和黄花烟草(nicotianarustica)，其中前者占据主要栽培面积。栽培烟草按烟叶品质特点、生物学性状和栽培调制方法等特点，可分为烤烟、晒烟、晾烟、白肋烟、香料烟和黄花烟六个类型，其中烤烟是我国栽培最广的普通烟草。

作为一种叶用经济作物，烤烟的栽培技术有别于其它大田作物，不仅要求有一定的烟叶产量，而且更注重烟叶品质。烟叶品质决定烟叶的可用性，直接影响卷烟商品的色、香、味和商品价值，也关系到烟农的经济效益，是烟草行业的生命和出发点。也因此，为满足国内外卷烟企业对优质烟叶不断增长的需求，必须不断提高烟叶品质和安全性。

有机酸是烟草化学组成中一个重要的组成部分。烟草中的有机酸主要是指除氨基酸以外的有机酸,其种类繁多,含量差异大,总含量一般为12%~16%，且大部分以与碱金属或有机碱合成盐或以酯类的形式存在。烟草中有机酸通常分为挥发酸、半挥发酸和非挥发酸。已有研究，普遍认为有机酸不仅在烟草生长发育过程中起着重要的作用,而且对烟叶和卷烟的质量有着重要的影响。一般而言，有机酸可以增加烟气酸性,醇和烟气,并使烟味变得甜润舒适。尤其是挥发性有机酸,尽管其含量很低（最多达0.1%~0.2%,有的甚至只有0.01%~0.05%）,但其对烟叶感官质量的影响却远远大于多元酸和高级脂肪酸。

总之，随着烟草基因工程深入，结合有机酸类物质组分对于烟叶品质的重要影响，对于与烟草中有机酸类物质相关编码基因的深入研究和开发，可为烟草品质调控奠定良好的技术基础。

技术实现要素：

基于烟草甘油酸物质含量调控基因的研究，本发明目的在于提供一个烟草ntycf45-like蛋白基因及其在烟草甘油酸物质含量调节方面的应用，从而为烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

烟草ntycf45-like蛋白的编码基因ntycf45-like，包括1968个碱基，具体碱基序列如seqidno.1所示。

所述ntycf45-like基因在叶片中甘油酸物质含量调控中的应用，利用基因沉默技术、或者基因超表达方法，通过调节ntycf45-like基因表达量，来调节控制叶片中甘油酸物质含量高低。

所述ntycf45-like基因的pcr扩增制备方法，包括如下步骤：

（1）提取（具体例如以烟草k326叶片为样品）基因组，并反转录为cdna备用；

（2）设计pcr扩增用引物，并进行pcr扩增，具体引物序列设计如下：

ntycf45-like-f：5’-ttatcagggacatagccagg-3’，

ntycf45-like-r：5’-caaccagcatctctaaagca-3’。

烟草ntycf45-like蛋白，由655个氨基酸残基组成，具体氨基酸序列如seqidno.2所示。

所述烟草ntycf45-like蛋白在叶片甘油酸物质含量调控中的应用，该蛋白与植物叶片中甘油酸物质含量相关，降低该蛋白表达后，叶片中甘油酸物质含量明显降低。

利用所述编码基因ntycf45-like的烟草新品种培育方法，通过转基因技术、瞬时表达技术或基因组编辑技术，构建含有ntycf45-like基因的病毒诱导沉默载体、rnai干涉载体、超表达载体或基因组编辑载体，转化烟草，筛选获得甘油酸含量变化的烟草新品种；

具体例如：利用病毒诱导的基因沉默（vigs）的技术，干扰ntycf45-like基因的表达使其沉默，ntycf45-like基因沉默植株中甘油酸物质含量显著下降，进而获得甘油酸含量下降的植物新品种。

换言之，一种培育低甘油酸含量烟草新品种培育方法，利用病毒诱导的基因沉默（vigs）的技术，干扰ntycf45-like基因的表达使其沉默，ntycf45-like基因沉默的新烟草品种植株中甘油酸物质含量显著下降。

一般而言，挥发性酸由于其挥发性在卷烟抽吸过程中可直接进入烟气,对吃味和香气有良好的作用，因此作为挥发性的脂肪酸甘油酸对烟草的品质有重要影响。基于甘油酸的重要作用，对烟草甘油酸物质调控基因进行深入研究，利用基因工程构建新的烟草品种，可为改善烟草品种奠定良好应用基础。本申请中，发明人基于相关烟草基因工程研究进展，通过对特定烟草ntycf45-like蛋白的初步研究，发现其与烟草甘油酸物质含量高度相关，在将该基因沉默后，烟草中甘油酸物质含量发生了明显降低。基于这一特性，可为烟叶品质调控、烟草新品种培育奠定一定技术基础。

附图说明

图1为与对照植株相比，ntycf45-like基因沉默植株中该基因的相对表达量；

图2为病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的甘油酸含量比较。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中具体实验背景资料情况简要介绍如下。

生物材料：

本氏烟草，一种常用烟草材料，下述实施例中烟草种植于郑州烟草院种植基地，育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵（10cm×10cm）中，22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等栽培管理；

下述实施例中所采用的vigs载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体（tobaccorattlevirus，trv)，所具体利用的trv2（一种常用载体）带有卡那霉素筛选标记和35s启动子，同时trv2带有ecori和bamhi等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因；

实验试剂：

lb液体培养基，1l含量中含有：10g细菌蛋白胨（bacteriologicalpeptone）；10g氯化钠（nacl）；5g酵母抽提物（yeastextract），高温高压灭菌；

yeb液体培养基，1l含量中含有：5g牛肉浸膏（beefextract）；5g细菌蛋白胨（bacteriologicalpeptone）；5g蔗糖（sucrose）；1g酵母抽提物（yeastextract）；2ml1m硫酸镁（mgso4），高温高压灭菌；

1m2-(n-吗啉)乙磺酸（mes）储备液：ddh2o溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用；

200mm乙酰丁香酮（acetosyringone，as）储备液：二甲基亚砜（dsmo）溶解，-20℃储存备用。

实施例1

本实施例就烟草ntycf45-like基因克隆及沉默载体的构建过程简要介绍如下。

（1）烟草ntycf45-like基因克隆

根据前期对于烟草基因组及相关ntycf45-like基因研究，选择特异编码序列为目标片段，设计pcr扩增用引物序列如下：

ntycf45-like-f：5’-ttatcagggacatagccagg-3’，

ntycf45-like-r：5’-caaccagcatctctaaagca-3’；

以烟草k326叶片（先提取基因组，再反转录为cdna）的cdna为模板，进行pcr扩增获得ntycf45-like基因；

pcr扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃彻底延伸5min；

对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收电泳产物备用。

（2）构建重组trv2-ntycf45-like载体

将步骤（1）中的pcr扩增产物进行ecori、bamhi双酶切，同时对空载体trv2进行ecori、bamhi双酶切，分别回收酶切产物，利用t4dna连接酶进行连接；

将连接产物转化大肠杆菌感受态dh5α，转化操作结束后将转化产物涂布在含50mg/lkan的lb固体培养基上，37℃过培养夜；

挑选阳性单菌落扩增后进一步进行pcr鉴定，并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体trv2-ntycf45-like。

需要说明的是，

烟草ntycf45-like基因，包括1968个碱基，碱基序列如seqidno.1所示，具体碱基序列为：

atgctctcttttgctttactccattcctcttcttcaccaaaaccacaattccattttcactacaaaaatcaaatccccaaactcccatttcaatccctccatttttcaccctttacggtattacccataaaattacagagcaaaccctcgttcttgagcttatcatcatgttttccatcttctacttctttgattggtgacgagtttgaggtggaattgggccgattactgacgctattaccggaggagatgcggcggagcgttagcgaacatccagagttttgctacttaattgaagtggttatggacttgggtcgtaagccacttgctcgcttcccctccggcgattttatcttgtccgatcatccaataaccctagatgatcttcaacatgctatatccaaggttggtgactttgcagttgataatagagctggcattagcagaactttacaccgaattagtgctattagaaaccggaaaggtgcaattattggattaacttgtcgagttggtcgtgcactatctggaagtgccaacgcattgcgagatctagttaaagatggtgcttctctgttgctcattggtcctcctggagttggaaaaacaactattatcagggacatagccaggatgcttgcaaatgattatgggaagcgcgtaatgattgttgacacatctaatgaaattggcggggatggtgatatacctcatgcagggataggtaatgctcgccggatgcaagttccacactctgatgtgcaacacaaggtgctgatagaagcagtggaaaatcatatgccacaagtgattgtaatcgatgagattggtactaaccttgaggcaatggctgctagcaccattgcacaacgaggaattcagttagttgcaactgctcatggagtaacaatagataatttagtgatgaatcctgctttagagatgctggttggaggagtacagagtgtaacacttggcgatgaagaggcaagcaggagaggtgttcagaaaagtgtgctggagaggaagggtccatcagcttttagctgtggggttgagataatctccaaggcagaactgagagttcaccctgatttagaagcaacagtagatgcaattcttgcaggccgttacccaagatatgaaacccgcaagataaatccaggatcacaagatgaaacaagggaaagttcatccacccaagcaccatttgatgagaggaatgaagttttggttgaagatattatccagatgaatggaggtgtacctggttctaccgagctcatctcggaaacagatccaagcattgaaggagggtctggtgaaagtgagaatgccctttgcatttttctttatgggatctcagaggcgagtgtgatacaagggataaaacagttaaacatcgatgatgccattgagtttactgataatatcagcgaagcagatgtgttacttgctctgcagtccaagcttaagaaaaactctcggattcaagcagctgcaaaatctcacggcattccgatttatatgacaaagacaagctcctcaacgcagttggcaaaggctatagaggcattaatggatgattttgctgatggctttgagtttctcgaatctgaagctaagacgaatgagtctgaaaagattgatgcgttggaggaggctagaataggcatggagcgtgtagtaattccaaaaggggaacctgttgagctactccctcggccttcaaatattatattgcttcagaaggatcttattaggaagtacaagctaaaatcagagcgaattggaacaggaacggatgtaaggcttcgaattctccctttctccggtgcacctgatgaagacagtcaggatagtgaaggagttgatgatgagagcgaagttgatgaattattcagcccgaatgctgaatcaaatggatctgccttcagggtggatagattacctctactacctgagtag。

烟草ntycf45-like蛋白，包括655个氨基酸，氨基酸序列如seqidno.2所示，具体氨基酸序列为：

mlsfallhsssspkpqfhfhyknqipklpfqslhfspftvlpiklqskpsflslsscfpsstsligdefevelgrlltllpeemrrsvsehpefcylievvmdlgrkplarfpsgdfilsdhpitlddlqhaiskvgdfavdnragisrtlhrisairnrkgaiigltcrvgralsgsanalrdlvkdgasllligppgvgkttiirdiarmlandygkrvmivdtsneiggdgdiphagignarrmqvphsdvqhkvlieavenhmpqvivideigtnleamaastiaqrgiqlvatahgvtidnlvmnpalemlvggvqsvtlgdeeasrrgvqksvlerkgpsafscgveiiskaelrvhpdleatvdailagrypryetrkinpgsqdetressstqapfdernevlvediiqmnggvpgstelisetdpsieggsgesenalciflygiseasviqgikqlniddaieftdniseadvllalqsklkknsriqaaakshgipiymtktssstqlakaiealmddfadgfefleseaktnesekidaleearigmervvipkgepvellprpsniillqkdlirkyklkserigtgtdvrlrilpfsgapdedsqdsegvddesevdelfspnaesngsafrvdrlpllpe。

实施例2

在实施例1基础上，利用农杆菌介导的vigs技术，发明人进一步将所构建的重组trv2-ntycf45-like载体转化了烟草植株，并就相关植物表型变化情况做了验证分析，具体实验过程简介如下。

（1）转化农杆菌

需要说明的是，参考实施例1操作及现有技术，发明人同时制备了trv2-gfp重组载体作为对照，具体转化过程为：

将trv2-gfp（载体对照）及trv2-ntycf45-like的阳性克隆质粒，分别通过电击转化方式转化进入农杆菌gv3101感受态细胞中，利用含50mg/lkan和50mg/lrif的yeb平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2d后，利用菌落pcr筛选带有目的基因的农杆菌。

（2）制备转染用菌液

将步骤（1）中筛选所得阳性农杆菌克隆在5ml的yeb液体培养基（含50mg/lkan和50mg/lrif）中，28℃、250rpm条件下培养过夜；

取50ul过夜培养物接种至50ml的yeb液体培养基（含50mg/lkan）中，培养至od600=1.0~1.5左右，然后4000g离心5min，收集菌体，再用mma重悬，调节od600=1.0左右；

最后室温放置3h左右后，作为转染用菌液。

（3）瞬时转化

以3~4w（周）苗龄的本氏烟草叶片为实验材料，利用1ml规格注射器，将步骤（2）中所制备转染用菌液注射至烟草叶片中，注射后的烟草继续在人工培养箱内培养，观察表型变化。

进一步通过qrt-pcr对ntycf45-like基因表达情况进行了检测，结果如图1所示，可以看出，trv2-ntycf45-like的侵染植株中，ntycf45-like的表达量显著降低。

进一步地，发明人对实验组（trv2-ntycf45-like浸染植株）和对照组（trv2-gfp浸染植株）中的植物甘油酸含量情况进行了检测（检测方法参照《基于气质和液质联用技术的烟草鲜烟叶代谢组学分析流程》（郑庆霞等，烟草科技，2019）），结果如图2所示。

从图2结果可以看出，实验组中甘油酸含量与对照组相比有显著下降，下降百分比可达60.17%。这进一步表明，通过沉默ntycf45-like基因，可对烟草叶片中植物甘油酸的含量进行调控，进而可为烟叶品质调控奠定一定技术基础。

sequencelisting

<110>中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120>烟草ntycf45-like蛋白及其应用

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