本发明属于医药技术领域，涉及沃卡帕烷(voucapane)型二萜衍生物及其制备方法和应用。
背景技术：
刺果苏木(caesalpiniabonduc(linn)roxb.)为豆科云实属植物，又名大托叶云实，在热带和亚热带地区均有分布，在我国主要分布于广东、广西和台湾等地。其主要药用部位为种子，具有抗疟、退热、解痉、祛风湿、祛痰、止咳等功效，多用于治疗痢疾、头痛、发热、肠胃不适、哮喘等症。研究表明，从刺果苏木及同属(云实属)植物中分离得到的二萜类化合物具有很好的抗疟(kalaunisk,awales,tezukay,etal.antimalarialactivityofcassane-andnorcassane-typediterpenesfromcaesalpiniacristaandtheirstructure-activityrelationship[j].biological&pharmaceuticalbulletin,2006,29(5):1050-1052.)、细胞毒(mag,yuanj,wuh,etal.caesalpinsa-h,bioactivecassane-typediterpenesfromtheseedsofcaesalpiniaminax.[j].journalofnaturalproducts,2013,76(6):1025-1031.)、抗菌(dicksonra,houghtonpj,hylandspj.antibacterialandantioxidantcassanediterpenoidsfromcaesalpiniabenthamiana[j].phytochemistry,2007,68(10):1436-1441.)和抗炎(o.yodsaoue,c.karalai,c.ponglimanont,etal.pulcherrinsd-r,potentialanti-inflammatoryditerpenoidsfromtherootsofcaesalpiniapulcherrima,tetrahedron67(2011)6838–6846.)等活性。
溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,uc)是炎症性肠病(inflammatoryboweldisease,ibd)的一种，其病程漫长，常反复发作，给患者的工作和生活带来很大的痛苦，并且长期的uc极易导致癌变。目前治疗uc的药物主要包括氨基水杨酸类药物、肾上腺糖皮质激素类药物和免疫抑制剂三类。其中氨基水杨酸类药物为治疗轻、中度uc的主要药物，但是毒副作用较大；肾上腺糖皮质激素是抑制急性活动性炎症的药物，但长期使用无维持作用；免疫抑制剂起效慢，且具有骨髓抑制的严重副作用。因此，寻找新的治疗uc且副作用小的药物迫在眉睫(王鹏程,赵珊,冯健,等.基于nf-κb信号通路的中药抗溃疡性结肠炎研究进展[j].中草药,2015,46(10).)。
技术实现要素：
本发明的目的是提供沃卡帕烷型二萜衍生物、制备方法及其在制备抗炎药物尤其是抗溃疡性结肠炎药物的应用。
本发明提供了沃卡帕烷型二萜衍生物及其药学上可接受的盐、异构体：
其中，a/b环反式骈合；c环为苯环；r1，r2，r3，r7和r8为h、oh、oac、＝o中的任何1个或多个，以及由相应位置的-oh衍生的酯类的一个或多个；r6为h或oh；r4，r5和r9为-ch3、-ch2oh、-cooh、-cho中的任何1个或多个，以及由相应位置的-ch2oh及-cooh衍生的酯类中的一个或多个。
本发明优选具有以下结构的沃卡帕烷型二萜及其药学上可接受的盐、异构体：
其中，c环为苯环。
本发明优选具有以下结构的沃卡帕烷型二萜及其药学上可接受的盐、异构体：
其中，c5位有羟基取代。
本发明优选具有以下结构的沃卡帕烷型二萜及其药学上可接受的盐、异构体：
其中，r1为oac，或r1、r2同时为oac，或r1、r2、r3同时为oac。
本发明提供了7种沃卡帕烷型二萜衍生物，其结构和名称如下：
化合物1-7分别为neocaesalpinah(1)；6-acetoxy-3-deacetoxycaesaldekarine(2)；caesaldekarine(3)；caesalpininmd(4)；2-acetoxycaesaldekarine(5)；caesallk/l(6/7)。
化合物1-7谱学数据如下：
化合物1neocaesalpinah
白色粉末(甲醇)，1h-nmr(400mhz,cdcl3)δh：1.19(3h,s,h-18)，1.24(3h,s,h-19)，1.46(3h,s,h-20)，1.96(3h,s,2-oac)，2.04(3h,s,1-oac)，2.37(3h,s,h-17)，5.51(1h,ddd,j＝13.1hz,4.6hz,2.8hz,h-2)，6.00(1h,d,j＝2.7hz,h-1)，6.71(1h,d,j＝2.2hz,h-15)，7.08(1h,s,h-17)，7.51(1h,d,j＝2.2hz,h-16)。13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ：74.5(c-1)，67.9(c-2)，35.9(c-3)，40.0(c-4)，75.6(c-5)，23.9(c-6)，23.8(c-7)，128.7(c-8)，139.4(c-9)，48.5(c-10)，104.3(c-11)，153.4(c-12)，125.8(c-13)，128.0(c-14)，104.9(c-15)，144.5(c-16)，16.0(c-17)，28.0(c-18)，25.7(c-19)，30.4(c-20)，21.1(1-oac)，169.6(1-oac)，21.1(2-oac)，170.6(2-oac).
化合物26-acetoxy-3-deacetoxycaesaldekarine
白色粉末(甲醇)，1h-nmr(400mhz,cdcl3)δh：1.18(3h,s,h-18)，1.32(3h,s,h-19)，1.41(3h,s,h-20)，1.95(3h,s,1-oac)，2.20(3h,s,6-oac)，2.36(3h,s,h-17)，3.06(1h,brs,5-oh)，5.66(1h,t,j＝3.2hz,h-1)，5.73(1h,t,j＝8.3hz,h-6),6.72(1h,d,j＝2.2hz,h-15)，7.03(1h,s,h-11)，7.53(1h,d,j＝2.2hz,h-16)。13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ：72.7(c-1)，30.1(c-2)，31.7(c-3)，38.5(c-4)，75.7(c-5)，76.9(c-6)，32.8(c-7)，126.9(c-8)，138.5(c-9)，49.3(c-10)，104.1(c-11)，153.7(c-12)，126.0(c-13)，128.5(c-14)，104.9(c-15)，144.6(c-16)，15.9(c-17)，22.6(c-18)，24.8(c-19)，31.7(c-20)，21.3(1-oac)，169.5(1-oac)，21.9(6-oac)，170.6(6-oac).
化合物3caesaldekarine
白色粉末(甲醇)，1h-nmr(400mhz,cdcl3)δh：1.10(6h,s,h-18,19)，1.40(3h,s,h-20)，1.92(3h,s,1-oac)，2.01(3h,s,3-oac)，2.39(3h,s,h-17)，5.05(1h,t,j＝3.1hz,h-1)，5.75(1h,t,j＝3.1hz,h-3)，6.72(1h,d,j＝2.0hz,h-15)，7.00(1h,s,h-11)，7.51(1h,d,j＝2.0hz,h-16)。13c-nmr(400mhz,cdcl3)δ：73.6(c-1)，27.0(c-2)，76.7(c-3)，41.7(c-4)，75.7(c-5)，24.5(c-6)，23.5(c-7)，127.7(c-8)，140.1(c-9)，46.8(c-10)，104.0(c-11)，153.5(c-12)，125.5(c-13)，128.4(c-14)，105.0(c-15)，144.2(c-16)，15.9(c-17)，23.1(c-18)，25.3(c-19)，31.2(c-20)，21.1(1-oac)，169.5(1-oac)，21.4(3-oac)，169.8(3-oac).
化合物4caesalpininmd
白色粉末(甲醇)，1h-nmr(400mhz,cdcl3)δh：1.26(3h,s,h-18)，1.39(3h,s,h-19)，1.52(3h,s,h-20)，1.97(3h,s,1-oac)，2.05(3h,s,2-oac)，2.20(3h,s,6-oac)，2.35(3h,s,h-17)，3.03(1h,brs,5-oh)，5.70(1h,t,j＝8.2hz,h-6)，5.45(1h,ddd,j＝13.1,4.4,2.6hz,h-2)，5.97(1h,d,j＝1.6hz,h-1)，6.72(1h,d,j＝2.2hz,h-15)，7.10(1h,s,h-11)，7.54(1h,d,j＝2.2hz,h-16)。13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ：74.5(c-1)，67.5(c-2)，37.8(c-3)，40.3(c-4)，76.4(c-5)，72.5(c-6)，31.8(c-7)，126.5(c-8)，137.8(c-9)，51.1(c-10)，104.2(c-11)，153.6(c-12)，126.3(c-13)，128.8(c-14)，104.8(c-15)，144.9(c-16)，16.0(c-17)，30.7(c-18)，25.5(c-19)，29.9(c-20)，21.0(1-oac)，169.4(1-oac)，21.0(2-oac)，170.4(2-oac)，21.8(6-oac)，170.6(6-oac).
化合物52-acetoxycaesaldekarine
白色粉末(甲醇)，1h-nmr(400mhz,cdcl3)δh：1.23(3h,s,h-18)，1.31(3h,s,h-19)，1.51(3h,s,h-20)，1.95(3h,s,1-oac)，2.04(3h,s,2-oac)，2.08(3h,s,3-oac)，2.38(3h,s,h-17)，5.26(1h,d,j＝3.6hz,h-3)，5.72(1h,t,j＝3.5hz,h-2)，6.05(1h,d,j＝3.2hz,h-1)，6.71(1h,d,j＝2.2hz,h-15)，7.04(1h,s,h-17)，7.51(1h,d,j＝2.2hz,h-16)。13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ：73.7(c-1)，66.4(c-2)，77.2(c-3)，43.0(c-4)，75.6(c-5)，24.4(c-6)，23.5(c-7)，127.4(c-8)，139.8(c-9)，48.6(c-10)，104.1(c-11)，153.4(c-12)，125.7(c-13)，128.6(c-14)，104.9(c-15)，144.4(c-16)，16.0(c-17)，23.1(c-18)，25.2(c-19)，31.2(c-20)，20.8(1-oac)，169.7(1-oac)，21.0(2-oac)，169.6(2-oac)，20.8(3-oac)，170.0(3-oac)。
化合物6caesallk
白色粉末(甲醇)，1h-nmr(400mhz,cdcl3)δh：1.17(3h,s,h-18)，1.20(3h,s,h-19)，1.41(3h,s,h-20)，2.12(3h,s,h-17)，1.99(3h,s,1-oac)，2.02(3h,s,2-oac)，5.47(1h,dd,j＝13.1,2.8hz,h-2)，5.87(1h,d,j＝2.7hz,h-1)，6.03(1h,dd,j＝6.5,2.1hz,h-16)，6.44(1h,s,h-11)。13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ：74.5(c-1)，68.0(c-2)，36.1(c-3)，40.0(c-4)，75.6(c-5)，24.0(c-6)，23.7(c-7)，126.8(c-8)，142.5(c-9)，48.4(c-10)，102.9(c-11)，156.0(c-12)，122.3(c-13)，133.4(c-14)，37.4(c-15)，100.7(c-16)，16.5(c-17)，28.0(c-18)，25.8(c-19)，30.3(c-20)，21.2(1-oac)，169.6(1-oac)，21.3(2-oac)，170.7(2-oac)。
化合物7caesalll
白色粉末(甲醇)，1h-nmr(400mhz,cdcl3)δh：1.17(3h,s,h-18)，1.20(3h,s,h-19)，1.41(3h,s,h-20)，2.12(3h,s,h-17)，1.98(3h,s,1-oac)，2.02(3h,s,2-oac)，5.46(1h,dd,j＝13.1,2.8hz,h-2)，5.86(1h,d,j＝2.7hz,h-1)，5.99(1h,dd,j＝6.5,2.0hz,h-16)，6.43(1h,s,h-11)。13c-nmr(100mhz,cdcl3)δ：74.5(c-1)，68.0(c-2)，36.1(c-3)，40.0(c-4)，75.6(c-5)，23.9(c-6)，23.6(c-7)，126.8(c-8)，142.4(c-9)，48.4(c-10)，102.8(c-11)，156.0(c-12)，122.2(c-13)，133.3(c-14)，37.4(c-15)，100.6(c-16)，16.5(c-17)，28.0(c-18)，25.7(c-19)，30.2(c-20)，21.2(1-oac)，169.7(1-oac)，21.2(2-oac)，170.7(2-oac)。
本发明还提供了所述的沃卡帕烷型二萜衍生物的制备方法，可以通过以下三种方法中任意一种制备。
方法一：
(1)粉碎药材，采用超声或溶剂加热提取法，以3～15倍量的30％～100％乙醇或甲醇回流提取，减压回收醇溶剂，用水混悬；
(2)混悬液依次用氯仿/二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，萃取次数1-5次，萃取溶剂与混悬液体积比1:1-3:1，回收溶剂，得到氯仿/二氯甲烷层浸膏、乙酸乙酯层浸膏和正丁醇层浸膏；
(3)氯仿/二氯甲烷层浸膏经硅胶柱色谱进行分离，采用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇等组成的不同溶剂系统进行洗脱；
(4)上述步骤(3)中含有二萜类成分的流份再次经硅胶柱色谱分离后，用制备型或半制备型hplc色谱分离，以甲醇/水或乙腈/水为流动相进行洗脱，得到二萜类化合物；
方法二：
(1)粉碎药材，采用溶剂加热提取法，以3～10倍量的氯仿/二氯甲烷回流提取，减压回收溶剂得浸膏；
(2)浸膏经硅胶柱色谱进行分离，采用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇等组成的不同溶剂系统进行洗脱；
(3)上述步骤(2)中含有二萜类化合物的流份再次经硅胶柱色谱分离后，用制备型或半制备型hplc色谱分离，以甲醇/水或乙腈/水为流动相进行洗脱，得到二萜类化合物；
方法三：
(1)粉碎药材，采用超声或溶剂加热提取法，以3～15倍量的30％～100％乙醇或甲醇回流提取，减压回收醇溶剂，用水混悬后离心取上清液；
(2)上清液用大孔树脂处理，以水-醇溶液梯度洗脱，收集30％～90％醇洗脱部分，得到二萜粗提物；
(3)上述步骤(2)中粗提物经硅胶柱色谱进行分离，采用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇等组成的不同溶剂系统进行洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得含有二萜类化合物的流份再次用硅胶柱色谱分离后，用制备型或半制备型hplc色谱分离，以甲醇/水或乙腈/水为流动相进行洗脱，得到二萜类化合物。
本发明提供的沃卡帕烷型二萜衍生物的制备方法(三)中，所提到的大孔树脂包括极性、非极性d-101、dm-301等。
本发明提供的用硅胶柱色谱分离方法(一)中氯仿(或二氯甲烷)萃取物浸膏，方法(二)中氯仿(或二氯甲烷)提取物浸膏和方法(三)中二萜粗提物，所提到的有机溶剂为石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、甲醇中的一种或二种混合溶剂，溶剂组成比例均为(100：0-1:1)，优选二氯甲烷-甲醇(100:0-1:1)和石油醚-乙酸乙酯(20:1-1:1)体系。
本发明提供的用制备型和半制备型hplc制备二萜衍生物的方法，流动相为甲醇-水或乙腈-水，混合比例为90:10-10:90，优选甲醇-水(70:30-45:55)体系。
本发明提供了一种药物组合物，包含所述的沃卡帕烷型二萜及其药学上可接受的盐、异构体中的一种或几种和药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明所述的沃卡帕烷型二萜及其药学上可接受的盐、异构体或其药物组合物具有免疫调节和抗炎作用，可以用于制备免疫调节剂或抗炎药物，尤其是抗溃疡性结肠炎药物。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明进行进一步详细说明，并不用于限定本发明。
实施例1
刺果苏木种子20.0kg，去皮得种仁9.0kg，用75％乙醇回流提取3次，料液比为1:8，每次2h，减压回收溶剂，浸膏用蒸馏水分散，依次用等体积的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，得氯仿层萃取物214.0g。
所得的氯仿层浸膏214.0g，采用硅胶开放柱色谱进行分离，流动相选用二氯甲烷：甲醇(100:0-1:1)梯度洗脱，所得流份经过硅胶薄层色谱分析，合并相同流份后得到10份洗脱物。
对二氯甲烷：甲醇＝100:2流份18.8g进行分离。采用硅胶柱色谱法，用石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱，在15:1处，对黄色固体采用制备型hplc分离，得化合物1，2；在5:1处，对黄色固体进行hplc分离，得化合物3，4。对二氯甲烷：甲醇＝100:4流份38.2g进行分离，采用硅胶柱色谱法，用石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱，在5:1处，对黄色固体采用hplc分离，得化合物5，6，7。
实施例2
沃卡帕烷型二萜衍生物体外抗炎活性筛选
(1)细胞培养
raw264.7细胞，在dmem培养基，5％fbs，37℃，5％co2条件下培养。
(2)活性测试
为检测受试药物的体外抗炎活性，将终浓度为10μm的化合物与lps刺激的raw264.7细胞共孵6h，然后用q-pcr检测炎性细胞因子il-1β，il-6和tnf-α的mrna水平。
实验结果如表1-3所示。
表1沃卡帕烷型二萜衍生物对lps诱导的raw264.7细胞致炎因子il-1βmrna表达的影响
表2沃卡帕烷型二萜衍生物对lps诱导的raw264.7细胞致炎因子il-6mrna表达的影响
表3沃卡帕烷型二萜衍生物对lps诱导的raw264.7细胞致炎因子tnf-αmrna表达的影响
结果表明，化合物1和3可显著降低炎症因子il-1β,il-6和tnf-αmrna水平，且化合物3的抑制活性更强。
实施例3
测试化合物3对葡聚糖硫酸钠(dextrasulfatesodium,dss)诱导的溃疡性结肠炎小鼠的影响。
(1)模型的建立
首先将6-8周的c57bl/6小鼠(20±2g)随机分为5组，每组5只，分别为：normal组、dss组、化合物3组(10mg/kg)和地塞米松组(dex)(1mg/kg)。以蒸馏水配制浓度为3％的dss，模型组及各给药组自由饮用7天，然后将模型组及各给药组换成蒸馏水自由饮用3天，normal组给予蒸馏水自由饮用10天，第10天处死小鼠。从造模第一天开始至第十天处死为止，化合物3溶液(化合物3先溶解于dmso中，然后悬浮于pbs中，其中dmso:pbs＝1：100)进行腹腔注射给药。dss组用dmso:pbs＝1:100溶液进行腹腔注射，以排除溶剂的影响。地塞米松磷酸钠注射液溶解于pbs中进行肌肉注射给药。
(2)结肠长度及形态
造模结束后摘眼球取血处死小鼠，取出结肠(肛门至盲肠)，测量长度，拍照。
结果表明，dss组(6.5±0.5cm)结肠长度明显比normal组(8.1±0.3cm)短，化合物3给药组(7.7±0.3cm)可以有效地改善结肠长度的变短，而地塞米松(dex)(6.0±0.2cm)没有改善结肠长度的变短。
(3)化合物3对结肠组织炎性细胞因子il-1β，il-6和tnf-α表达的影响
qpcr检测结肠组织中炎性细胞因子mrna水平，实验结果如表4所示。
表4化合物3对结肠组织炎性细胞因子il-1β，il-6和tnf-αmrna表达的影响
注：将dss组炎性细胞因子表达量定位为100％。
结果表明，化合物3能够显著抑制结肠组织炎性细胞因子il-1β，il-6和tnf-αmrna的表达，提示化合物3在动物体内没有明显的副作用，且具有较强的抗炎活性，在治疗溃疡性结肠炎方面具有很大的开发价值。