一种SERPINA3-1基因CNV标记辅助检测黄牛生长性状的方法及其应用与流程

本发明属于遗传育种领域，具体涉及一种serpina3-1基因拷贝数变异(cnv)标记的检测方法及其在黄牛生长性状的分子育种中的应用。

背景技术：

随着基因组学和生物信息学等相关学科的迅猛发展，动物遗传育种的理论和技术也发生了重大的变化，即逐渐由传统的常规表型选育转向分子选育。目前，分子育种的研究主要集中在标记辅助选择(molecularmark-assistselection,mas)，该技术是通过dna分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对与生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的dna标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。

拷贝数变异(copynumbervariations,cnvs)，作为一种基因组亚显微水平结构变异类型，是指基因组中大于50bp到数mb之间的片段缺失或重复的重组的现象。cnvs可以通过剂量效应、位置效应、阻断功能基因、融合基因、暴露隐性等位基因和潜在的跃迁效应来影响基因的功能以及个体的表型。在检测已知cnv的各种方法中，通常是采用基于pcr技术和杂交技术的一些方法。例如qpcr、qmpsf、mlpa、fish、southernblotting和maph。其中，实时荧光定量pcr(qpcr)最为常用。该方法操作简单、敏感性高、速度快。通过对目的基因(具有拷贝数变异)及内参基因(无拷贝数变异)进行相对定量，然后利用2-^δδct的方法判定个体的拷贝数变异类型。

丝氨酸蛋白酶抑制剂(serineproteaseinhibitors，serpins)是高度保守的基因家族，其主要作为蛋白酶的抑制剂参与各种生物学过程，包括血液凝固、补体激活、纤维蛋白溶解、组织修复等，并且在多种生理过程中起关键性的调控作用。serpina3属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族a亚型，包含多个糖基化位点和一个具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的serpin结构域。serpina3蛋白受胰岛素和生长因子的双重调控，影响细胞的增殖，促进骨骼肌的生长，调节胚胎在子宫内的发育，从而影响个体的生长和发育。牛serpina3基因簇包含bovserpina3-1至bovserpina3-8在内的8个基因和一个假基因，它们之间的序列相似性高达95％。虽然近些年对于serpina3基因的研究越来越多，但目前还不清楚黄牛的生长性状差异是否与serpina3-1基因的拷贝数变异有关。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种serpina3-1基因cnv标记辅助检测黄牛生长性状的方法及其应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种检测黄牛serpina3-1基因cnv标记的方法，包括以下步骤：以提取自待测黄牛(皮南牛、郏县红牛、夏南牛、独龙牛和云岭牛)个体的血液或耳组织的全基因组dna为模板，以引物对p1和引物对p2为引物，分别通过实时荧光定量pcr技术扩增serpina3-1基因的拷贝数变异区域和作为内参的btf3基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定黄牛个体serpina3-1基因的拷贝数变异类型。

优选的，所述的serpina3-1基因的拷贝数变异区域位于牛serpina3-1基因候选区域chr21：60097201bp-60113200bp(参考序列为nc_007319.6)。

优选的，根据log22^-δδct(即-δδct)将拷贝数变异类型分为三类：插入型，log22^-δδct>0.5；缺失型，log22^-δδct<-0.5；正常型，log22^-δδct≤|±0.5|。

优选的，所述的引物对p1为：

上游引物f：5’-acttagaccctgtggtaggtca-3’；

下游引物r：5’-atgatcacaaactacctctggatac-3’。

优选的，所述的引物对p2为：

上游引物f：5’-aaccaggagaaactcgccaa-3’；

下游引物r：5’-ttcggtgaaatgccctctcg-3’。

优选的，所述的实时荧光定量pcr所用的扩增反应体系以12.5μl计为：10ng/μl模板dna1μl、10μmol/l的引物对p1或引物对p2所对应的上、下游引物各0.5μl以及premixextaq^tmii6.25μl和ddh2o4.25μl。

优选的，所述的实时荧光定量pcr所用的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。

优选的，基于引物对p1扩增的pcr产物片段大小为194bp，基于引物对p2扩增的pcr产物片段大小为166bp。

上述检测黄牛serpina3-1基因cnv标记的方法在黄牛分子标记辅助选择育种中的应用。

优选的，所述的黄牛个体中，具有插入型拷贝数变异类型的个体在生长性状上优于具有缺失型、正常型的个体。

优选的，所述的生长性状为体高、体斜长、十字部高、胸围、腰角宽、尻长。

本发明的有益效果体现在：

本发明利用基因组dna进行实时定量pcr，以btf3基因为参照，根据-δδct值即可确定黄牛个体serpina3-1基因的拷贝数变异的类型，并发现了该serpina3-1基因的拷贝数变异可以作为分子标记。与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明提供的黄牛serpina3-1基因拷贝数变异检测方法，不受年龄的限制，可用于早期选育，甚至在个体刚出生时就可进行选择；

(2)本发明快速、简单、成本低，能够准确可靠的鉴定黄牛个体serpina3-1基因的拷贝数类型；

(3)本发明在一定程度上为黄牛生长性状的分子标记辅助选择提供科学依据，可快速建立种质资源优良的黄牛种群，从而加快育种过程。

附图说明

图1为利用普通pcr扩增验证引物对p1和p2扩增特异性的电泳图谱：泳道1为marker，泳道2为引物对p2扩增的内参序列，泳道3为引物对p1扩增的目标序列。

图2为本发明中进行qpcr(serpina3-1基因)绘制的扩增曲线。

图3是本发明中进行qpcr(serpina3-1基因)绘制的溶解曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。

本发明利用实时荧光定量pcr对黄牛serpina3-1基因的拷贝数变异进行检测并用于分子育种，包括以下步骤：

(1)利用ncbi数据库查找serpina3-1基因序列，再用primer5软件进行引物设计，并用普通pcr检测引物；

(2)采用实时荧光定量pcr(qpcr)技术检测候选位点在群体中的拷贝数变异情况；

(3)利用spss23.0软件将拷贝数变异类型与黄牛生长性状进行关联分析，筛选到与黄牛生长性状相关的cnv标记；

(4)根据拷贝数变异类型获得生长性状优异的黄牛种群，进行选育。

1、黄牛样本采集

本发明具体以皮南牛、郏县红牛、夏南牛、独龙牛和云岭牛共542头作为检测对象，分别采集个体的血样或耳组织样，并记录它们的生长性状数据，如体高、体斜长、十字部高、胸围、腰角宽和尻长等，以用于后续的关联分析(见表1)。

表1.样品信息

2、基因组dna的提取(以耳组织为例)

(1)取30mg样品放入2.0ml离心管，用手术剪将组织样剪碎呈粉末状。

(2)每只离心管内加入600μlse缓冲液和20μl的蛋白酶k(20mg/ml)，经37℃水浴消化12～16h。

(3)加入200μl的6mol/lnacl充分混匀后，加入1ml的tris饱和酚，温和摇动20min，使其充分混匀，4℃、12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌的2.0ml离心管。

(4)加入0.5ml的tris饱和酚和0.5ml的氯仿，充分混合20min，4℃、12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌的2.0ml离心管。

(5)加入1ml氯仿，充分混合20min，4℃、12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌的1.5ml离心管。

(6)加入1ml预冷无水乙醇(–20℃)，充分混匀至絮状沉淀析出，放置–20℃下30min。

(7)4℃、12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％的冰冷乙醇漂洗dna沉淀2次。

(8)4℃、12000r/min离心10min，弃上清液，室温下使乙醇挥发干净。

(9)干燥后的dna溶液中加入80～100μl的te溶解，4℃保存直至dna完全溶解，利用紫外分光光度仪泳检测其质量，-80℃保存，作为模板dna。

3、目的基因及内参基因的扩增用特异性引物的设计

以ncbi数据库公布的牛serpina3-1基因(目的基因)序列(nc_007319.6)为参考序列，根据重测序中筛选出的存在拷贝数变异区域即serpina3-1基因序列的60097201nt至60113200nt，利用primer5.0设计扩增该区域中一段194bp的序列的引物(引物对p1)。同时，以ncbi所公布的牛btf3基因序列(ac_000177.1)为参考序列，采用相同方法设计扩增内参基因(btf3基因)中一段166bp的序列的引物(引物对p2)。引物对序列信息如表2所示(引物合成时间为2019年1月)。

表2.实时荧光定量pcr的引物信息

注：f表示上游引物，r表示下游引物。

4、实时定量pcr

参见图1，利用普通pcr扩增和1％的琼脂糖凝胶电泳验证了引物对p1、p2的扩增特异性。

实时定量pcr所用的扩增体系以12.5μl计为：10ng/μl模板dna1μl、10μmol/l上、下游引物各0.5μl以及premixextaqtmii6.25μl和ddh2o4.25μl。

引物对p1、引物对p2所对对应的实时定量pcr的反应程序均为：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。

通过绘制扩增曲线(图2)和溶解峰(图3)确定引物适用于qpcr分析。

5、个体拷贝数变异类型判定

每个样品分别用目的基因序列和内参基因序列的引物进行扩增，并且每对引物设定3个重复。根据2^-δδct方法进行拷贝数的分析。其中δδct＝(ct实验组目的基因-ct实验组内参基因)-(ct对照组目的基因-ct对照组内参基因)。实验组即为待检测有无拷贝数变异的样本，对照组即为已知无拷贝数变异的样本，可以采用重测序试验中所选择的对照组各品种黄牛个体。2^-δδct表示的是实验组目的基因序列的拷贝数相对于对照组的倍数，ct即cyclethreshold，为pcr扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

根据公式计算得出每个待测个体的-δδct，并根据cnv类型的判定标准：log22^-δδct>0.5为duplication类型(插入型)；-0.5≤log22^-δδct≤0.5为normal类型(正常型)，log22^-δδct<-0.5为deletion类型(缺失型)，判定检测的黄牛个体的cnv类型。

6、关联分析

关联分析模型：在数据处理中，根据影响体尺性状指标的因素的不同，考虑到环境效应、年龄、品种、遗传效应及其互作效应，采用固定模型进行分析，同时根据实际情况进行简化；根据数据特征，应用spss23.0软件分析各基因型间的生产性状效应。固定模型为：

yijk＝μ+ai+gj+eijk

其中：yijk为性状观察值，μ为总体均值，ai为第i头个体的年龄，gj为第j个拷贝数变异类型的固定效应，eijk为随机误差。各组数据间的差异性采用lsd多重比较进行检验，试验结果以mean±se形式表示。数据处理的结果如表3所示。

表3.黄牛serpina3-1基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析

注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(p>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(p<0.05)。*p<0.05。括号里面的数值表示拷贝数变异类型的频率。

关联分析结果表明(见表3)：针对黄牛serpina3-1基因候选区域chr21：60097201bp-60113200bp，具有插入型(duplication)拷贝数变异类型的黄牛个体在生长性状上较优，并且拷贝数变异位点与体高、十字部高、腰角宽和尻长等生长性状具有显著的相关性。因此，黄牛serpina3-1基因在以上区域对应的cnv位点的duplication类型可以作为一个提高黄牛生长性状的候选分子遗传标记(cnv标记)，加快黄牛优良品种的选育进程。

<110>西北农林科技大学

<120>一种serpina3-1基因cnv标记辅助检测黄牛生长性状的方法及其应用

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<212>dna

<213>人工合成

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<212>dna

<213>人工合成

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<212>dna

<213>人工合成

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