本发明涉及鱼类肝细胞分离
技术领域：
，具体涉及一种鲤科鱼类肝细胞的快速分离方法。
背景技术：
：肝脏是机体最重要的器官之一，它具有消化、代谢和免疫调节功能，是环境有害因素作用的靶器官。因此，从肝脏分离的原代细胞常作为药理学、毒理学、免疫学、细胞生物学及内分泌学研究的客体。鱼类肝细胞也已分离和培养，它们已被用于鱼类肝结构和功能研究，比如鱼的温度驯化、细胞衰老、细胞相互作用、脂蛋白代谢，营养代谢和内分泌调节、卵黄原蛋白的合成、激素受体表达、细胞色素p450的代谢和毒理学研究。肝细胞的分离常常使用灌注法，这种方法用含酶制剂的缓冲液从比较完整肝脏内易识别和易插灌注针的血管进行灌注，收集灌注液中的肝细胞。在门静脉比较明显的鲑科鱼类中，采用肝静脉插灌注针的方法灌注；在缺乏明显门静脉的鲤科鱼类中，采用腹腔动脉或者是从心脏进行逆灌注。灌注法存在明显的缺点：1、灌注时间长，使得肝细胞分离时间长；2、灌注液体积较大，需要的酶制剂多，使得成本较高；3、只能适用于肝脏组织完整的鱼类，对于体积较小的鱼类使用时困难较大。技术实现要素：针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种鲤科鱼类肝细胞的快速分离和培养方法，该方法可有效解决现有的方法存在的分离时间长，所需的酶制剂多，导致成本高以及对鱼类体积要求大的问题。为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种鲤科鱼类肝细胞的快速分离方法，包括以下步骤：(1)获取鱼肝脏，取部分肝块，将其切成肝片，并对其进行冲洗；(2)将冲洗后的肝片切碎，得肝碎块，向肝碎块中加入汉克斯平衡盐溶液，然后震荡、离心，得沉淀；(3)向步骤(2)所得沉淀中加入由cacl2、牛血清白蛋白、胶原酶、分散酶、胰酶抑制剂、脱氧核糖核酸酶ⅰ和汉克斯平衡盐溶液组成的消化液进行震荡消化，然后对其进行吹打，静置，待大块组织沉淀后，上层细胞悬液过细胞筛，收集细胞混悬液；(4)向步骤(3)中剩余大块组织中加入由cacl2、牛血清白蛋白和汉克斯平衡盐溶液组成的清洗液，然后对其进行吹打，静置，待大块组织沉淀后，上层细胞悬液过细胞筛，收集得细胞混悬液，重复该步骤3次，并合并细胞混悬液；(5)将步骤(3)和(4)中收集的细胞混悬液进行离心，得细胞沉淀，然后加入由cacl2、牛血清白蛋白和汉克斯平衡盐溶液组成的清洗液进行清洗，离心，重悬，制得原代肝细胞。按照上述方法可快速分离鲤科鱼类肝细胞，分离操作在90分钟以内即可完成，分离后的肝细胞活力较高，存活率在95％以上。进一步地，步骤(2)中在26-30℃条件下震荡15-25min，然后在离心力为100g的条件下离心15s。进一步地，步骤(3)消化液与沉淀的体积质量比为3:1，沉淀于26-30℃条件下在消化液中震荡20-40min。在26-30℃条件下进行震荡，可提高消化效果，震荡特定的时间，即可提高分离效果又可减小对肝细胞的损伤，提高肝细胞的存活率。进一步地，步骤(3)的消化液中cacl2的摩尔浓度为5mmol/l，牛血清白蛋白的质量浓度为0.1g/ml，胶原酶的质量浓度为1mg/ml，分散酶的质量浓度为22ug/ml，胰酶抑制剂的质量浓度为50ug/ml，脱氧核糖核酸酶ⅰ的质量浓度为75ug/ml。限定cacl2、牛血清白蛋白、胶原酶、分散酶、胰酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶ⅰ的浓度，在提高消化效果的同时可减小对肝细胞的伤害，缩短消化时间，提高消化后肝细胞的活力。进一步地，步骤(4)中在离心力为100g的条件下离心15s。进一步地，步骤(4)和步骤(5)中的清洗液中cacl2的摩尔浓度为5mmol/l，牛血清白蛋白的质量浓度为0.03g/ml。合适浓度的cacl2可提高胶原酶的活性，进而提高消化效果，缩短消化时间，合适浓度的牛血清白蛋白可提高胶原酶、分散酶、胰酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶ⅰ的活性。进一步地，步骤(5)中先在100g的条件下离心4min，再在100g离心力的条件下离心2min。进一步地，步骤(3)和步骤(4)中的细胞筛的目数均为200目。进一步地，汉克斯平衡盐溶液中不含钙镁离子。采取上述方案所产生的有益效果为：本发明中加入牛血清白蛋白对肝细胞有生理和机械保护作用，同时可以作为稳定剂，增强胶原酶、分散酶、胰酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶ⅰ的活性，提高肝细胞分离效果。胶原酶用于切断结缔组织，有利于细胞的分散；分散酶用于消化组织或器官中的细胞外基质，具有快速、有效、温和的优点，先通过胶原酶将肝组织切割后再通过分散酶进行消化，提高分散酶的消化效果，胶原酶和分散酶相互协同作用，可大大缩短消化的时间，进而缩短肝细胞分离时间；胰酶抑制剂作用是抑制肝组织或细胞中的胰蛋白酶消化肝细胞本身的成分，防止细胞受损，从而保持细胞活力。脱氧核糖核酸酶ⅰ用于切断受损细胞释放的基因组dna，降低溶液粘稠度，利于细胞分离，缩短分离所需时间，使得分离细胞效率得到提高，其作用温和，对细胞损伤小，提高分离的肝细胞活力。向其中加入cacl2的作用，可增强胶原酶的活性，提高结缔组织的切断作用目的。采用本发明的方法分离鱼类肝细胞，不需要完整的肝组织，取较小的肝块即可完成分离，肝细胞分离过程中使用的试剂材料较少，可有效降低成本，而且，肝细胞分离所需的时间较短，一般情况下90分钟内即可完成，分离的肝细胞存活率大于95％，活力较高，可培养12天左右。具体实施方式实施例1一种鲤科鱼类肝细胞的快速分离方法，包括以下步骤：(1)将草鱼用浓度为100mg/l的间氨基苯甲酸乙酯甲烷磺酸麻醉，麻醉后剪断其背部动脉放血，然后将鱼腹部向上放置在冰块上，用75％酒精对其腹部消毒，沿腹部中线剪开鱼腹取出肝脏，将肝脏放入预冷的汉克斯平衡盐溶液中；(2)从步骤(1)中的肝脏上取1cm×2cm大小的肝块，去掉肝块表面的膜、血窦和结缔组织，然后将其切成1mm厚的肝薄片，将肝薄片用预冷的汉克斯平衡盐溶液冲洗干净；(3)将步骤(2)中冲洗后的肝薄片切碎，得肝碎块，将肝碎块转移到离心管中，并向其中加入30ml汉克斯平衡盐溶液，然后在26℃条件下以100次/min的频率震荡15min，再在离心力为100g条件下离心15s，得沉淀；(4)向步骤(3)沉淀中加入由cacl2、牛血清白蛋白、胶原酶、分散酶、胰酶抑制剂、脱氧核糖核酸酶ⅰ和汉克斯平衡盐溶液组成的消化液，消化液与沉淀的质量体积比为3:1，然后在26℃条件下以220次/min的频率震荡20min，用巴氏吸管吹打，静置，待大块组织沉淀后，分离得上清液，将上层细胞悬液过200目细胞筛，收集细胞混悬液；其中，消化液中cacl2的质量浓度为5mmol/l，牛血清白蛋白的质量浓度为0.1mg/ml，胶原酶的质量浓度为1mg/ml，分散酶的质量浓度为22ug/ml，胰酶抑制剂的质量浓度为50ug/ml，脱氧核糖核酸酶ⅰ的质量浓度为75ug/ml；(5)向步骤(4)剩余大块组织中加入由cacl2、牛血清白蛋白和汉克斯平衡盐溶液组成的清洗液，用巴氏吸管吹打肝碎块，静置，待大块组织沉淀后，上层细胞悬液过200目细胞筛，收集细胞混悬液，重复该步骤3次，得合并细胞混悬液，其中，清洗液中cacl2的质量浓度为5mmol/l，牛血清白蛋白的质量浓度为0.03mg/ml；(6)将步骤(4)和步骤(5)中收集的细胞混悬液合并并在离心力为100g的条件下离心4min，得细胞沉淀，向细胞沉淀中加入由cacl2、牛血清白蛋白和汉克斯平衡盐溶液组成的清洗液，吹打肝细胞，然后继续在离心力为100g的条件下离心2min，丢弃上清液，得原代肝细胞，将原代肝细胞重悬在含有胎牛血清的l15培养基中，培养即可，其中，清洗液中cacl2的质量浓度为5mmol/l，牛血清白蛋白的质量浓度为0.03mg/ml。实施例2一种鲤科鱼类肝细胞的快速分离方法，包括以下步骤：(1)将草鱼用浓度为100mg/l的间氨基苯甲酸乙酯甲烷磺酸麻醉，麻醉后剪断其背部动脉放血，然后将鱼腹部向上放置在冰块上，用75％酒精对其腹部消毒，沿腹部中线剪开鱼腹取出肝脏，将肝脏放入预冷的汉克斯平衡盐溶液中；(2)从步骤(1)中的肝脏上取1cm×2cm大小的肝块，去掉肝块表面的膜、血窦和结缔组织，然后将其切成1mm厚的肝薄片，将肝薄片用预冷的汉克斯平衡盐溶液冲洗；(3)将步骤(2)中冲洗后的肝薄片切碎，得肝碎块，将肝碎块转移到离心管中，并向其中加入30ml汉克斯平衡盐溶液，然后在28℃条件下以100次/min的频率震荡20min，再在离心力为100g条件下离心15s，得沉淀；(4)向步骤(3)沉淀中加入由cacl2、牛血清白蛋白、胶原酶、分散酶、胰酶抑制剂、脱氧核糖核酸酶ⅰ和汉克斯平衡盐溶液组成的消化液，消化液与沉淀的体积质量比为3:1，然后在28℃条件下以220次/min的频率震荡30min，用巴氏吸管吹打，静置，待大块组织沉淀后，上层细胞悬液过200目细胞筛，收集细胞混悬液；其中，消化液中cacl2的质量浓度为5mmol/l，牛血清白蛋白的质量浓度为0.1mg/ml，胶原酶的质量浓度为1mg/ml，分散酶的质量浓度为22ug/ml，胰酶抑制剂的质量浓度为50ug/ml，脱氧核糖核酸酶ⅰ的质量浓度为75ug/ml；(5)向步骤(4)中剩余的大块组织中加入由cacl2、牛血清白蛋白和汉克斯平衡盐溶液组成的清洗液，用巴氏吸管吹打肝碎块，静置，待大块组织沉淀后，上层细胞悬液过200目细胞筛，收集细胞混悬液，重复该步骤3次，得合并细胞混悬液，其中，清洗液cacl2的质量浓度为5mmol/l，牛血清白蛋白的质量浓度为0.03mg/ml；(6)将步骤(4)和步骤(5)中收集的细胞混悬液在离心力为100g的条件下离心4min，得细胞沉淀，向细胞沉淀中加入由cacl2、牛血清白蛋白和汉克斯平衡盐溶液组成的清洗液，吹打肝细胞，然后继续在离心力为100g的条件下离心2min，丢弃上清液，得原代肝细胞，将原代肝细胞重悬在含有胎牛血清的l15培养基中，培养即可，其中，清洗液中cacl2的质量浓度为5mmol/l，牛血清白蛋白的质量浓度为0.03mg/ml。对比例1一种鲤科鱼类肝细胞的快速分离法，其在实施例2的基础上做以下调整：第一、步骤(4)中分散酶替换为胰蛋白酶，第二、将组织混合液在30℃条件下以240次/min的频率震荡40min，第三，将cacl2的质量浓度调整为2mmol/l。对比例2一种鲤科鱼类肝细胞的快速分离方法，其在实施例2的基础上做以下调整：第一取消步骤(3)中胰酶抑制剂的加入，第二将cacl2的质量浓度调整为9mmol/l。对比例3一种鲤科鱼类肝细胞的快速分离方法，其在实施例2的基础上做以下调整：将步骤(4)中牛血清白蛋白的质量浓度调整为0.6mg/ml，胶原酶的质量浓度调整为0.5mg/ml，分散酶的质量浓度调整为80ug/ml，胰酶抑制剂的质量浓度调整为100ug/ml，脱氧核糖核酸酶ⅰ的质量浓度为120ug/ml。对比例4一种鲤科鱼类肝细胞的快速分离方法，其在实施例2的基础上做以下调整：将步骤(4)中牛血清白蛋白的质量浓度调整为0.01mg/ml，胶原酶的质量浓度调整为1.5mg/ml，分散酶的质量浓度调整为10ug/ml，胰酶抑制剂的质量浓度调整为20ug/ml，脱氧核糖核酸酶ⅰ的质量浓度为60ug/ml。试验例分别对实施例1-2和对比例1-4中得到的肝细胞采用台盼蓝染色的方法进行染色，然后对细胞进行计数和活率测定，具体计数结果和活率见表1。表1：存活率统计表细胞总数(×107)活细胞数量(×107)细胞存活率(％)实施例12.582.4996.5实施例22.372.3197.5对比例12.412.2794.2对比例22.382.2293.3对比例32.362.2093.2对比例42.422.2793.8通过上表得知，按照本发明实施例1-2中的方法分离的草鱼肝细胞，细胞的成活率均在96.5％以上，尤其是实施例2中的方法分离的肝细胞，成活率高达97.5％，远远高于对比例1-4中的成活率。实施例1和实施例2中变更了步骤(3)和步骤(4)中的震荡温度、时间和频率，分离后的肝细胞的存活率均较高。对比例1中分离的肝细胞，其存活率低于95％，证明分离时所需的酶、震荡的时间、温度和频率等均对分离的肝细胞的活性产生影响。对比例2中分离的肝细胞，其存活率降低，证明胰酶抑制剂对肝细胞起到保护作用，可降低分离过程中对肝细胞的损伤，cacl2的质量浓度对胶原酶的活性产生较大影响，进而影响分离的肝细胞的活性。对比例3和对比例4中分离的肝细胞，其存活率也较低，证明牛血清白蛋白、胶原酶、分散酶、胰酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶ⅰ的浓度均对肝细胞的活性产生影响。当前第1页12