重组载体及其在制备比卡菌素中的应用的制作方法
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及重组载体及其在制备比卡菌素中的应用。
背景技术：
真菌聚酮是一大类结构和功能多样的天然产物，具有多样的临床相关的医学生物活性，包括抗生素、抗真菌、免疫抑制和抗癌活性。由于该类化合物种类巨多，生物活性明显，已经成为了筛选新药物开发新疗法的优秀候选分子。因此，此类产物的生物合成及大规模发酵，具有重要意义。真菌聚酮的生物合成是由一个多功能聚酮合酶从乙酰辅酶a开始通过聚合多个丙二酰辅酶a(或其他碳单元)形成初始骨架，然后经过相应的修饰蛋白催化形成最终产物。这是一个高度调控，多重迭代的过程，涉及了聚酮碳链的起始，延伸，环化和解离多等个环节。因此真菌聚酮的合成和大规模发酵也成为了一个难点。
比卡菌素(bikaverin)是一种红色的四环聚酮化合物，具有抗细菌，抗真菌，抗原虫，抗肿瘤的效果，在农业，林业和临床医学上都有巨大的应用潜力。作为次级代谢产物，比卡菌素在自然界中主要由镰刀菌属(fusarium)生产，受环境中的ph值，氮源等因素调节，同时又与硫元素，磷酸盐等因素相关。
目前研究已发现了一个推测的bikaverin生物合成基因簇，并在敲除研究的基础上提出了一种生物合成途径，但该途径尚未被完全表征，也没有通过功能实验的增益得到验证。在该推测的基因簇中包含有6个蛋白，分别为bik1，bik2，bik3，bik4，bik5，bik6，其中bik1、bik2和bik3酶被预测负责bikaverin的合成，bik4和bik5被预测为转录调控因子，bik6被推测为是一个渗透酶或转运蛋白。比卡菌素的合成是一个典型的聚酮合成过程。它的四环骨架首先由一个i型聚酮合酶(typeipks)，bik1，催化形成。这是一个含有超过2000个氨基酸的多功能酶，包含了6个具有不同功能的域：初始单位酰基转移酶功能域(sat)，酮基合酶功能域(ks)，丙二酰酰基转移酶功能域(mat)，聚酮产物模板功能域(pt)，酰基载体蛋白功能域(acp)和claise环化酶功能域(clc)，其中sat功能域选择乙酰辅酶a为起始单元，将1个乙酰辅酶a锚定到acp区，接着ks和mat功能域将8个丙二酰辅酶a聚合到延伸的聚酮碳链上，最后由clc功能域将该碳链环化并将其从acp区解离出来。该释放的四环前体物，pre-bikaverin在单加氧酶bik2和o-甲基转移酶bik3的作用下经过两次单氧化，两次甲基化最终形成比卡菌素(图1)。
酵母作为一个被清楚阐释的模式生物，易操作，安全，已被广泛用来生产工业材料分子，然而真菌聚酮类物质，尤其是复杂聚酮类物质在酵母中的表达并不常见。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供重组载体及其在制备比卡菌素中的应用，该重组载体转化酵母菌后能够实现比卡菌素在酵母体内的表达。
本发明提供了bik1，bik2，bik3、bik6、pptase、npga基因中至少一种在构建产比卡菌素的酵母菌株中的应用。
本发明提供了基因表达模块，其包含bik1，bik2，bik3、bik6、pptase、npga基因中至少一种。
本发明所述基因表达模块包含如下i)～ii)中至少一种：
i)、bik1，bik2，bik3、bik6、pptase、npga基因中至少一种，每个基因的5’端连接启动子，3’端连接终止子；
ii)、bik1，bik2，bik3、bik6、pptase、npga基因中至少两种的融合片段，每个融合片段的5’端连接启动子，3’端连接终止子。
一些实施例中，本发明所述表达模块包含bik1，bik2，bik3、bik6、pptase、npga基因中至少5种。
一些实施例中，本发明所述表达模块包含bik1，bik2，bik3、bik6、pptase、npga基因中任意2个组成的融合片段，以及其余4个基因中至少一种。
一些实施例中，所述启动子、终止子来自酿酒酵母。
所述启动子选自rps2、tef1、tpi1、pgk1、eno2、tef2或gal1；
所述终止子选自cyc1、acs2、acs1、zeo1、adh2或hxt7。
一些具体实施例中，本发明所述的表达模块包括ptef1-bik2、ptpi1-bik3、pgal1-bik1、ppgk1-bik6、peno2-pptase、ptef2-npga；
或包括ptef1-bik2、ptpi1-bik3、pgal1-bik1、peno2-pptase、ptef2-npga；
或包括ptef1-bik2、ptpi1-bik3、pgal1-bik1、ppgk1-bik6、ptef2-npga；
或包括ptef1-bik2、ptpi1-bik3、pgal1-bik1、ppgk1-bik6、peno2-pptase；
或包括pgal1-bik2、ptpi1-bik3、pgal1-bik1、ppgk1-bik6、peno2-pptase、ptef2-npga；
或包括ptef1-bik2、pgal1-bik3、pgal1-bik1、ppgk1-bik6、peno2-pptase、ptef2-npga；
或包括pgal1-bik2、pgal1-bik3、pgal1-bik1、ppgk1-bik6、peno2-pptase、ptef2-npga；
或包括pgal1-bik2-bik3、pgal1-bik1、ppgk1-bik6、peno2-pptase、ptef2-npga。
更具体的，本发明所述表达模块包括顺序连接的：ptef1-bik2-tcyc1、ptpi1-bik3-tacs2、pgal1-bik1-tacs1、ppgk1-bik6-tzeo1、peno2-ppt-tadh2、ptef2-npga-thxt7；
包括顺序连接的：ptef1-bik2-tcyc1、ptpi1-bik3-tacs2、pgal1-bik1-tacs1、peno2-ppt-tadh2、ptef2-npga-thxt7；
包括顺序连接的：ptef1-bik2-tcyc1、ptpi1-bik3-tacs2、prps2-bik1-tacs1、ppgk1-bik6-tzeo1、peno2-ppt-tadh2；
包括顺序连接的：ptef1-bik2-tcyc1、ptpi1-bik3-tacs2、prps2-bik1-tacs1、ppgk1-bik6-tzeo1、peno2-npga-tadh2；
包括顺序连接的：pgal1-bik2-bik3-tcyc1、pgal1-bik1-tacs1、ppgk1-bik6-tzeo1、peno2-ppt-tadh2、ptef2-npga-thxt7；
包括顺序连接的：pgal1-bik2-tcyc1、ptpi1-bik3-tacs2、pgal1-bik1-tacs1、ppgk1-bik6-tzeo1、peno2-ppt-tadh2、ptef2-npga-thxt7；
包括顺序连接的：ptef1-bik2-tcyc1、pgal1-bik3-tacs2、pgal1-bik1-tacs1、ppgk1-bik6-tzeo1、peno2-ppt-tadh2、ptef2-npga-thxt7；
包括顺序连接的：pgal1-bik2-tcyc1、pgal1-bik3-tacs2、pgal1-bik1-tacs1、ppgk1-bik6-tzeo1、peno2-ppt-tadh2、ptef2-npga-thxt7。
本发明所述的表达模块中，
bik1的序列如seqidno：1或2所示；
bik2的序列如seqidno：3或4所示；
bik3的序列如seqidno：5或6所示；
bik6的序列如seqidno：7或8所示；
pptase的序列如seqidno：9所示；
npga的序列如seqidno：10所示。
本发明还提供了重组载体，其包括本发明所述的表达模块。
本发明所述重组载体的骨架载体为psr416。
重组酵母菌，其由酵母菌转化本发明所述的重组载体制得
本发明重组酵母菌的底盘菌为酿酒酵母或奇异酵母。
本发明中，所述酿酒酵母选自by4742、s288c、l-1528、uwops872421、yjm978、dbvpg6044、378604x、yjm981、273614n、uwops03-461.4、yiic17-e5、dbvpg1373、y55、dbvpg1106、uwops05-227.2、uwops83-787.3、dbvpg6765、y12、sk1、l-1374、yps606、w303、322134s；
所述奇异酵母选自：cbs432、y8.5、t21.4、q62.5、z1、y7、q89.9、y8.1、q32.3、y9.6、n-17、q59.1、q74.4、cbs5829、q95.3、q69.8、s36.7、w7、yps138、z1.1、q31.4、ifo1804、a12、iv-44。
本发明所述的重组酵母菌在制备比卡菌素中的应用。
本发明还提供了一种制备比卡菌素的方法，其包括发酵本发明所述的重组酵母菌。
所述方法中，发酵的培养基中：
氮源包括无机氮源和酵母基础氮源；
所述无机氮源选自硫酸铵；
所述酵母基础氮源包括肌醇、维生素b1、维生素b2、维生素b3、维生素b5、维生素b6、硫酸铜、磷酸二氢钾、硼酸、对氨基苯甲酸、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、氯化铁、氯化钙、碘化钾、钼酸钠、生物素、叶酸、氯化钠；
对于未采用gal1启动子的重组酵母菌株以葡萄糖作为碳源；对于采用gal1启动子的重组酵母菌株则以半乳糖为碳源；
除碳源和碳源外，发酵培养基中还包括精氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、组氨酸、亮氨酸和腺嘌呤。
本发明中，所述发酵的条件为25～35℃，100～1000rpm，时间为1～10d。
所述发酵后，还包括以乙酸乙酯从菌体中提取比卡菌素的步骤。
本发明通过合成生物学策略，实现了复杂聚酮路径-bikaverinpathway在酿酒酵母中的首次合成，这也是比卡菌素在外源物种中的首次合成。本发明首先通过gfp融合策略找到了比卡菌素在酵母合成过程中的瓶颈步骤：bik1的催化步骤；然后通过更换bik1的启动子，筛选出了gal1启动子来表达bik1蛋白实现了比卡菌素在酵母中的合成。同时本发明又筛选了bik1，bik2，bik3的两个不同版本的序列蛋白，最终得到了一个优化的通路，当以by4742酵母菌为底盘时，菌株的摇瓶产量达到了0.7mg/l。在此基础上本发明将bik2，bik3的启动子进行了优化：将bik2，bik3基因的启动子分别更换为gal1启动子以及将bik2，bik3基因的启动子同时更换为gal1启动子，从而筛选出了更加优化的pathway通路，使摇瓶产量达到了3.56mg/l(以by4742为底盘)。此外，由于pre-bikaverin到bikaverin的过程是由bik2，bik3反复交错催化修饰而成，为了更进一步的的优化bik2与bik3的催化过程，本发明提出了bik2和bik3蛋白融合策略，此策略大大提高了bikaverin的产量，当使用摇瓶培养时，产量达到了41.44mg/l(以by4742为底盘)。此外，我们将最终优化后pathway，转入了48种不同的酵母底盘，通过24孔深孔板发酵，得到了高于by4742产量8倍产量的优质底盘。
附图说明
图1示比卡菌素生物合成路径；
图2示比卡菌素途径组装示意图；
图3示比卡菌素通路质粒示意图；
图4示gfp融合策略解决bik1的表达问题；a示gfp融合策略示意图，b示荧光观察个基因的表达水平，c示不同启动子表达bik1蛋白；
图5示启动子对比卡菌素产量影响；a示yzm002/009质粒示意图b示yzm002/009转入酵母后的颜色chplc和ms确定酵母合成了比卡菌素d空心圆表示该蛋白使用版本1，实心圆表示该蛋白使用版本2；
图6示bik6，ppt，npga的删除对比卡菌素产量的影响；
图7示bikpathway各基因表达强度；
图8示启动子优化和蛋白融合策略，a示通过启动子优化和蛋白融合提高比卡菌素产量，b示yzm037质粒示意图；c示蛋白表达水平；d示ypg培养基发酵比卡菌素水平；
图9不同底盘产量图。
具体实施方式
本发明提供了重组载体及其在制备复杂聚酮-比卡菌素中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
本发明提供了bik1，bik2，bik3、bik6、pptase、npga基因中至少一种在构建产比卡菌素的酵母菌株中的应用。
本发明提供了bik1，bik2，bik3、bik6、pptase、npga基因中至少两者的组合。
本发明提供了基因表达模块，其包含bik1，bik2，bik3、bik6、pptase、npga基因中至少一种。
本发明所述的基因表达模块中，基因的顺序不做限定，基因的数量为1～6个，基因可以融合也可不融合。当基因融合时，两基因之间连接有linker片段。
本发明中，所述基因表达模块包含如下i)～ii)中至少一种：
i)、bik1，bik2，bik3、bik6、pptase、npga基因中至少一种，每个基因的5’端连接启动子，3’端连接终止子；
ii)、bik1，bik2，bik3、bik6、pptase、npga基因中至少两种的融合片段，每个融合片段的5’端连接启动子，3’端连接终止子。
具体的，本发明中，所述的基因表达模块由相互连接的转录单元组成。本发明中所述的转录单元包括顺序连接的启动子、基因片段、终止子。例如，bik1基因的转录单元即包括顺序连接的启动子、bik1基因、终止子。bik2基因的转录单元即包括顺序连接的启动子、bik2基因、终止子。bik3基因的转录单元即包括顺序连接的启动子、bik3基因、终止子。bik6基因的转录单元即包括顺序连接的启动子、bik1基因、终止子。pptase基因的转录单元即包括顺序连接的启动子、pptase基因、终止子。npga基因的转录单元即包括顺序连接的启动子、npga基因、终止子。
本发明中，所述的转录单元为：
bik1基因转录单元、bik2基因转录单元、bik3基因转录单元、bik6基因转录单元、pptase基因转录单元、npga基因转录单元；
bik1-bik2融合片段的转录单元、bik1-bik3融合片段的转录单元、bik1-bik6融合片段的转录单元、bik1-pptase融合片段的转录单元、bik1-npga融合片段的转录单元、bik2-bik3融合片段的转录单元、bik2-bik6融合片段的转录单元、bik2-pptase融合片段的转录单元、bik2-npga融合片段的转录单元、bik3-bik6融合片段的转录单元、bik3-pptase融合片段的转录单元、bik3-npga融合片段的转录单元、bik6-pptase融合片段的转录单元、bik6-npga融合片段的转录单元、pptase-npga融合片段的转录单元；
bik1-bik2-bik3融合片段的转录单元、bik1-bik2-bik6融合片段的转录单元、bik1-bik2-pptase融合片段的转录单元、bik1-bik2-npga融合片段的转录单元、bik1-bik3-bik6融合片段的转录单元、bik1-bik3-pptase融合片段的转录单元、bik1-bik3-npga融合片段的转录单元、bik1-bik6-pptase融合片段的转录单元、bik1-bik6-npga融合片段的转录单元、bik1-npga-pptase融合片段的转录单元、bik2-bik3-bik6融合片段的转录单元、bik2-bik3-pptase融合片段的转录单元、bik2-bik3-npga融合片段的转录单元、bik2-bik6-pptase融合片段的转录单元、bik2-bik6-npga融合片段的转录单元、bik2-pptase-npga融合片段的转录单元、bik3-bik6-pptase融合片段的转录单元、bik3-bik6-npga融合片段的转录单元、bik3-pptase-npga融合片段的转录单元、bik6-pptase-npga融合片段的转录单元；
bik1-bik2-bik3-bik6融合片段的转录单元、bik1-bik2-bik6-pptase融合片段的转录单元、bik1-bik3-bik6-pptase融合片段的转录单元、bik1-bik6-pptase-npga融合片段的转录单元、bik3-bik6-pptase-npga融合片段的转录单元、bik1-bik2-bik3-pptase融合片段的转录单元、bik1-bik2-bik6-npga融合片段的转录单元、bik1-bik3-bik6-npga融合片段的转录单元、bik2-bik3-bik6-pptase融合片段的转录单元、bik2-bik6-pptase-npga融合片段的转录单元、bik1-bik2-bik3-npga融合片段的转录单元、bik1-bik2-pptase-npga融合片段的转录单元、bik1-bik3-pptase-npga融合片段的转录单元、bik2-bik3-bik6-npga融合片段的转录单元、bik2-bik3-pptase-npga融合片段的转录单元；
bik2-bik3-bik6-pptase-npga融合片段的转录单元、bik1-bik3-bik6-pptase-npga融合片段的转录单元、bik1-bik2-bik6-pptase-npga融合片段的转录单元、bik1-bik2-bik3-pptase-npga融合片段的转录单元、bik1-bik2-bik3-bik6-npga融合片段的转录单元、bik1-bik2-bik3-bik6-pptase融合片段的转录单元。
本发明所述的转录单元中，融合片段中基因片段的连接顺序不做限定，以任何连接顺序进行连接都能获得良好的表达效果。
本发明所述的表达模块由相互连接的上述转录单元组成，并且，对每种转录单元的拷贝数、连接顺序、以及连接方向不做限定。
本发明所述表达模块中，转录单元的制备通过yeastgoldengate技术实现。
各转录单元通过同源臂连接。在本发明实施例中，所述同源臂的左臂和右臂分别位于转录单元启动子的5’端和终止子3’端。本发明实施例中，所述同源臂的长度为50～60bp。优选为57bp。
本发明所述表达模块的制备方法为：通过versatilegeneticassemblysystem(vegas)将转录单元组装到一起。
作为优选，本发明提供了如下表达模块：
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik3基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik6基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元和bik2基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元和bik3基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元和bik6基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元和pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2基因的转录单元和bik3基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2基因的转录单元和bik6基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2基因的转录单元和pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik3基因的转录单元和bik6基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik3基因的转录单元和pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik3基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik6基因的转录单元和pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik6基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含npga基因的转录单元和pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元和bik3基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元和bik6基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元和pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik3基因的转录单元和bik6基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik3基因的转录单元和pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik3基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik6基因的转录单元和pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik6基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、npga基因的转录单元和pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2基因的转录单元、bik3基因的转录单元和bik6基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2基因的转录单元、bik3基因的转录单元和pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2基因的转录单元、bik3基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2基因的转录单元、bik6基因的转录单元和pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2基因的转录单元、bik6基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2基因的转录单元、npga基因的转录单元和pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik3基因的转录单元、bik6基因的转录单元和pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik3基因的转录单元、bik6基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik3基因的转录单元、npga基因的转录单元和pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik6基因的转录单元、npga基因的转录单元和pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、bik3基因的转录单元和bik6基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、bik3基因的转录单元和pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、bik3基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、bik6基因的转录单元和pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、bik6基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、pptase基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik3基因的转录单元、bik6基因的转录单元和pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik3基因的转录单元、bik6基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik3基因的转录单元、pptase基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik6基因的转录单元、pptase基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2基因的转录单元、bik3基因的转录单元、bik6基因的转录单元和pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2基因的转录单元、bik3基因的转录单元、bik6基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik3基因的转录单元、bik6基因的转录单元、pptase基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2基因的转录单元、bik6基因的转录单元、pptase基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2基因的转录单元、bik3基因的转录单元、pptase基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2基因的转录单元、bik3基因的转录单元、bik6基因的转录单元、pptase基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik3基因的转录单元、bik6基因的转录单元、pptase基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、bik6基因的转录单元、pptase基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、bik3基因的转录单元、pptase基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、bik3基因的转录单元、bik6基因的转录单元和npga基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、bik3基因的转录单元、bik6基因的转录单元和pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、bik3基因的转录单元、bik6基因的转录单元、npga基因的转录单元和pptase基因的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik2融合片段的转录单元。
一种实施方式中，含有bik1-bik2融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik3基因的转录单元、bik6基因的转录单元、pptase基因的转录单元、npga基因的转录单元中至少一种。
另一种实施方式中，含有bik1-bik2融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik3、bik6、pptase、npga中至少两种组成的融合片段的转录单元。
另一种实施方式中，含有bik1-bik2融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik3基因的转录单元、bik6基因的转录单元、pptase基因的转录单元、npga基因的转录单元中至少一种，以及bik3、bik6、pptase、npga中至少两种组成的融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik3融合片段的转录单元。
一种实施方式中，含有bik1-bik3融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik2基因的转录单元、bik6基因的转录单元、pptase基因的转录单元、npga基因的转录单元中至少一种。
另一种实施方式中，含有bik1-bik3融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik2、bik6、pptase、npga中至少两种组成的融合片段的转录单元。
另一种实施方式中，含有bik1-bik3融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik2基因的转录单元、bik6基因的转录单元、pptase基因的转录单元、npga基因的转录单元中至少一种，以及bik2、bik6、pptase、npga中至少两种组成的融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik6融合片段的转录单元。
一种实施方式中，含有bik1-bik6融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik3基因的转录单元、bik2基因的转录单元、pptase基因的转录单元、npga基因的转录单元中至少一种。
另一种实施方式中，含有bik1-bik6融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik3、bik2、pptase、npga中至少两种组成的融合片段的转录单元。
另一种实施方式中，含有bik1-bik6融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik3基因的转录单元、bik2基因的转录单元、pptase基因的转录单元、npga基因的转录单元中至少一种，以及bik3、bik2、pptase、npga中至少两种组成的融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-npga融合片段的转录单元。
一种实施方式中，含有bik1-npga融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik3基因的转录单元、bik6基因的转录单元、pptase基因的转录单元、bik2基因的转录单元中至少一种。
另一种实施方式中，含有bik1-npga融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik3、bik6、pptase、bik2中至少两种组成的融合片段的转录单元。
另一种实施方式中，含有bik1-npga融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik3基因的转录单元、bik6基因的转录单元、pptase基因的转录单元、bik2基因的转录单元中至少一种，以及bik3、bik6、pptase、bik2中至少两种组成的融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-pptase融合片段的转录单元。
一种实施方式中，含有bik1-pptase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik3基因的转录单元、bik6基因的转录单元、npga基因的转录单元、bik2基因的转录单元中至少一种。
另一种实施方式中，含有bik1-pptase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik3、bik6、npga、bik2中至少两种组成的融合片段的转录单元。
另一种实施方式中，含有bik1-pptase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik3基因的转录单元、bik6基因的转录单元、npga基因的转录单元、bik2基因的转录单元中至少一种，以及bik3、bik6、npga、bik2中至少两种组成的融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2-bik3融合片段的转录单元。
一种实施方式中，含有bik2-bik3融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1基因的转录单元、bik6基因的转录单元、pptase基因的转录单元、npga基因的转录单元中至少一种。
另一种实施方式中，含有bik2-bik3融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1、bik6、npga、pptase中至少两种组成的融合片段的转录单元。
另一种实施方式中，含有bik2-bik3融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1基因的转录单元、bik6基因的转录单元、npga基因的转录单元、pptase基因的转录单元中至少一种，以及bik1、bik6、npga、pptase中至少两种组成的融合片段的转录单元。
一些具体实施例中，基因表达模块包括：bik2-bik3融合片段的转录单元、bik1基因的转录单元、bik6基因的转录单元、npga基因的转录单元、pptase基因的转录单元。
在此表达模块中，bik2-bik3融合片段中，bik2基因与bik3基因以3×(gggs)1inker连接。在此表达模块中，转录单元的连接顺序为：bik2-bik3融合片段的转录单元、bik1基因的转录单元、bik6基因的转录单元、npga基因的转录单元、pptase基因的转录单元。
其中，bik2-bik3融合片段的转录单元左右同源臂的序列分别为：va1(seqidno：11)，va3(seqidno：12)；
bik1基因的转录单元左右同源臂的序列分别为：va3(seqidno：12)，va5(seqidno：13)，
bik6基因的转录单元左右同源臂的序列分别为：va5(seqidno：13)，va6(seqidno：14)，
ppt基因的转录单元左右同源臂的序列分别为：va6(seqidno：14)，va7(seqidno：15)，
npga基因的转录单元左右同源臂的序列分别为：va7(seqidno：15)，va2(seqidno：16)。
一种基因表达模块，其包含bik2-bik6融合片段的转录单元。
一种实施方式中，含有bik2-bik6融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik3基因的转录单元、bik1基因的转录单元、pptase基因的转录单元、npga基因的转录单元中至少一种。
另一种实施方式中，含有bik2-bik6融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1、bik3、npga、pptase中至少两种组成的融合片段的转录单元。
另一种实施方式中，含有bik2-bik6融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1基因的转录单元、bik3基因的转录单元、npga基因的转录单元、pptase基因的转录单元中至少一种，以及bik1、bik3、npga、pptase中至少两种组成的融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2-npga融合片段的转录单元。
一种实施方式中，含有bik2-npga融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik3基因的转录单元、bik6基因的转录单元、pptase基因的转录单元、bik1基因的转录单元中至少一种。
另一种实施方式中，含有bik2-npga融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1、bik3、bik6、pptase中至少两种组成的融合片段的转录单元。
另一种实施方式中，含有bik2-npga融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1基因的转录单元、bik6基因的转录单元、bik3、基因的转录单元、pptase基因的转录单元中至少一种，以及bik1、bik6、bik3、、pptase中至少两种组成的融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2-pptase融合片段的转录单元。
一种实施方式中，含有bik2-pptase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik3基因的转录单元、bik6基因的转录单元、npga基因的转录单元、bik1基因的转录单元中至少一种。
另一种实施方式中，含有bik2-pptase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1、bik3、bik6、npga中至少两种组成的融合片段的转录单元。
另一种实施方式中，含有bik2-pptase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1基因的转录单元、bik6基因的转录单元、bik3、基因的转录单元、npga基因的转录单元中至少一种，以及bik1、bik6、bik3、npga中至少两种组成的融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik3-bik6融合片段的转录单元。
一种实施方式中，含有bik3-bik6融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、npga基因的转录单元、pptase基因的转录单元中至少一种。
另一种实施方式中，含有bik3-bik6融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1、bik2、pptase、npga中至少两种组成的融合片段的转录单元。
另一种实施方式中，含有bik3-bik6融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、pptase基因的转录单元、npga基因的转录单元中至少一种，以及bik1、bik2、pptase、npga中至少两种组成的融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik3-npga融合片段的转录单元。
一种实施方式中，含有bik3-npga融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik2基因的转录单元、bik6基因的转录单元、pptase基因的转录单元、bik1基因的转录单元中至少一种。
另一种实施方式中，含有bik3-npga融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1、bik2、pptase、bik6中至少两种组成的融合片段的转录单元。
另一种实施方式中，含有bik3-npga融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、pptase基因的转录单元、bik6基因的转录单元中至少一种，以及bik1、bik2、pptase、bik6中至少两种组成的融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik3-pptase融合片段的转录单元。
一种实施方式中，含有bik3-pptase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、bik6基因的转录单元、npga基因的转录单元中至少一种。
另一种实施方式中，含有bik3-pptase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1、bik2、npga、bik6中至少两种组成的融合片段的转录单元。
另一种实施方式中，含有bik3-pptase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、npga基因的转录单元、bik6基因的转录单元中至少一种，以及bik1、bik2、npga、bik6中至少两种组成的融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik6-npga融合片段的转录单元。
一种实施方式中，含有bik6-npga融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、bik3基因的转录单元、pptase基因的转录单元中至少一种。
另一种实施方式中，含有bik6-npga融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1、bik2、pptase、bik3中至少两种组成的融合片段的转录单元。
另一种实施方式中，含有bik6-npga融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、pptase基因的转录单元、bik3基因的转录单元中至少一种，以及bik1、bik2、pptase、bik3中至少两种组成的融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik6-pptase融合片段的转录单元。
一种实施方式中，含有bik6-pptase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、bik3基因的转录单元、npga基因的转录单元中至少一种。
另一种实施方式中，含有bik6-pptase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1、bik2、npga、bik3中至少两种组成的融合片段的转录单元。
另一种实施方式中，含有bik6-pptase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、npga基因的转录单元、bik3基因的转录单元中至少一种，以及bik1、bik2、npga、bik3中至少两种组成的融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含npga-pptase融合片段的转录单元。
一种实施方式中，含有npga-pptase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、bik3基因的转录单元、bik6基因的转录单元中至少一种。
另一种实施方式中，含有npga-pptase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1、bik2、bik6、bik3中至少两种组成的融合片段的转录单元。
另一种实施方式中，含有npga-pptase融合片段的转录单元的基因表达模块中，还包含bik1基因的转录单元、bik2基因的转录单元、bik6基因的转录单元、bik3基因的转录单元中至少一种，以及bik1、bik2、bik6、bik3中至少两种组成的融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik2-bik3融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik2-bik6融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik2-pptase融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik2-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik3-bik6融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik3-pptase融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik3-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik6-pptase融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik6-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-npga-pptase融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2-bik3-bik6融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2-bik3-pptase融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2-bik3-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2-bik6-pptase融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2-bik6-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2-pptase-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik3-bik6-pptase融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik3-bik6-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik3-pptase-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik6-pptase-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik2-bik3-bik6融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik2-bik6-pptase融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik3-bik6-pptase融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik6-pptase-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik3-bik6-pptase-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik2-bik3-pptase融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik2-bik6-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik3-bik6-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2-bik3-bik6-pptase融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2-bik6-pptase-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik2-bik3-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik2-pptase-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik3-pptase-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2-bik3-bik6-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2-bik3-pptase-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik2-bik3-bik6-pptase-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik3-bik6-pptase-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik2-bik6-pptase-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik2-bik3-pptase-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik2-bik3-bik6-npga融合片段的转录单元。
一种基因表达模块，其包含bik1-bik2-bik3-bik6-pptase融合片段的转录单元。
一些实施例中，本发明所述表达模块包含bik1，bik2，bik3、bik6、pptase、npga基因中至少5种。
一些实施例中，本发明所述表达模块包含bik1，bik2，bik3、bik6、pptase、npga基因中任意2个组成的融合片段，以及其余4个基因中至少一种。
本发明所述的表达模块中，对基因的连接顺序不做限定，任意顺序的连接都能够实现本发明的目的；所述的表达模块中，对转录单元的拷贝数也不做限定，尽管在实施例中，仅验证了每种基因1个拷贝，实现酵母中比卡菌素的表达，但根据本领域的公知常识，提高基因的拷贝数有利于酶促反应产物产量的提高。在本发明中，也不限定表达模块中基因的转录方向，其可与实施例中所展示的方向一致，也可以与其呈反向互补关系。
一些实施例中，所述启动子、终止子来自酿酒酵母。
所述启动子选自rps2、tef1、tpi1、pgk1、eno2、tef2或gal1；
所述终止子选自cyc1、acs2、acs1、zeo1、adh2或hxt7。
一些具体实施例中，本发明所述的表达模块包括ptef1-bik2、ptpi1-bik3、pgal1-bik1、ppgk1-bik6、peno2-pptase、ptef2-npga；
或包括ptef1-bik2、ptpi1-bik3、pgal1-bik1、peno2-pptase、ptef2-npga；
或包括ptef1-bik2、ptpi1-bik3、pgal1-bik1、ppgk1-bik6、ptef2-npga；
或包括ptef1-bik2、ptpi1-bik3、pgal1-bik1、ppgk1-bik6、peno2-pptase；
或包括pgal1-bik2、ptpi1-bik3、pgal1-bik1、ppgk1-bik6、peno2-pptase、ptef2-npga；
或包括ptef1-bik2、pgal1-bik3、pgal1-bik1、ppgk1-bik6、peno2-pptase、ptef2-npga；
或包括pgal1-bik2、pgal1-bik3、pgal1-bik1、ppgk1-bik6、peno2-pptase、ptef2-npga；
或包括pgal1-bik2-bik3、pgal1-bik1、ppgk1-bik6、peno2-pptase、ptef2-npga。
更具体的，本发明所述表达模块包括顺序连接的：ptef1-bik2-tcyc1、ptpi1-bik3-tacs2、pgal1-bik1-tacs1、ppgk1-bik6-tzeo1、peno2-ppt-tadh2、ptef2-npga-thxt7；
包括顺序连接的：ptef1-bik2-tcyc1、ptpi1-bik3-tacs2、pgal1-bik1-tacs1、peno2-ppt-tadh2、ptef2-npga-thxt7；
包括顺序连接的：ptef1-bik2-tcyc1、ptpi1-bik3-tacs2、prps2-bik1-tacs1、ppgk1-bik6-tzeo1、peno2-ppt-tadh2；
包括顺序连接的：ptef1-bik2-tcyc1、ptpi1-bik3-tacs2、prps2-bik1-tacs1、ppgk1-bik6-tzeo1、peno2-npga-tadh2；
包括顺序连接的：pgal1-bik2-bik3-tcyc1、pgal1-bik1-tacs1、ppgk1-bik6-tzeo1、peno2-ppt-tadh2、ptef2-npga-thxt7；
包括顺序连接的：pgal1-bik2-tcyc1、ptpi1-bik3-tacs2、pgal1-bik1-tacs1、ppgk1-bik6-tzeo1、peno2-ppt-tadh2、ptef2-npga-thxt7；
包括顺序连接的：ptef1-bik2-tcyc1、pgal1-bik3-tacs2、pgal1-bik1-tacs1、ppgk1-bik6-tzeo1、peno2-ppt-tadh2、ptef2-npga-thxt7；
包括顺序连接的：pgal1-bik2-tcyc1、pgal1-bik3-tacs2、pgal1-bik1-tacs1、ppgk1-bik6-tzeo1、peno2-ppt-tadh2、ptef2-npga-thxt7。
本发明所述的表达模块中，
bik1的序列如seqidno：1或2所示；
bik2的序列如seqidno：3或4所示；
bik3的序列如seqidno：5或6所示；
bik6的序列如seqidno：7或8所示；
pptase的序列如seqidno：9所示；
npga的序列如seqidno：10所示。
本发明还提供了重组载体，其包括本发明所述的表达模块。
本发明所述的重组载体中，包括至少一个本发明所述的表达模块。
所述重组载体中包含一个或多个本发明所述的表达模块，获得的表达载体中，包含bik1，bik2，bik3、bik6、pptase、npga基因中至少一种，也可包括bik1，bik2，bik3、bik6、pptase、npga基因中至少两者的融合片段，每种基因的拷贝数可为1也可为多个。
本发明所述重组载体的骨架载体为psr416。
重组酵母菌，其由酵母菌转化本发明所述的重组载体制得。
本发明所述的重组酵母菌至少转化有一个本发明所述的重组载体。
本发明所述的重组酵母菌中，至少含有bik1转录单元、bik2转录单元、bik3转录单元和npga转录单元。
或者，本发明所述的重组酵母菌中，至少含有bik1转录单元、bik2转录单元、bik3转录单元和pptase转录单元。
或者，本发明所述的重组酵母菌中，至少含有bik1转录单元、bik2转录单元、bik3转录单元、pptase转录单元和npga转录单元。
或者，本发明所述的重组酵母菌中，至少含有bik1转录单元、bik2转录单元、bik3转录单元、bik6转录单元、pptase转录单元和npga转录单元。
本发明所述的重组酵母菌中的转录单元可位于同一个重组载体上，也可位于多个重组载体上。每个重组载体中的表达模块的数量不做限定，每个表达模块中的转录单元的数量也不做限定，可位于同一重组载体的不同表达模块中，也可位于同一重组载体的同一表达模块中。其连接顺序、连接方向与拷贝数皆不做限定。
所述重组酵母菌的制备方法包括电转、氯化钙法。
本发明重组酵母菌，其底盘菌为酿酒酵母或奇异酵母。
本发明中，所述酿酒酵母选自by4742、s288c、l-1528、uwops872421、yjm978、dbvpg6044、378604x、yjm981、273614n、uwops03-461.4、yiic17-e5、dbvpg1373、y55、dbvpg1106、uwops05-227.2、uwops83-787.3、dbvpg6765、y12、sk1、l-1374、yps606、w303、322134s；
所述奇异酵母选自：cbs432、y8.5、t21.4、q62.5、z1、y7、q89.9、y8.1、q32.3、y9.6、n-17、q59.1、q74.4、cbs5829、q95.3、q69.8、s36.7、w7、yps138、z1.1、q31.4、ifo1804、a12、iv-44。
本发明所述的重组酵母菌在制备比卡菌素中的应用。
本发明还提供了一种制备比卡菌素的方法，其包括发酵本发明所述的重组酵母菌。
所述方法中，发酵的培养基中：
氮源包括无机氮源和酵母基础氮源；
所述无机氮源为硫酸铵；
所述酵母基础氮源包括肌醇、维生素b1、维生素b2、维生素b3、维生素b5、维生素b6、硫酸铜、磷酸二氢钾、硼酸、对氨基苯甲酸、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、氯化铁、氯化钙、碘化钾、钼酸钠、生物素、叶酸、氯化钠；
对于未采用gal1启动子的重组酵母菌株以葡萄糖作为碳源；对于采用gal1启动子的重组酵母菌株则以半乳糖为碳源；
除碳源和碳源外，发酵培养基中还包括营养缺陷型氨基酸。
本发明中，所述发酵的条件为25～35℃，100～1000rpm，时间为1～10d。
所述发酵后，还包括以乙酸乙酯从菌体中提取比卡菌素的步骤。
本发明通过合成生物学策略，实现了复杂聚酮路径-bikaverinpathway在酿酒酵母中的首次合成，这也是比卡菌素在外源物种中的首次合成。本发明首先通过gfp融合策略找到了比卡菌素在酵母合成过程中的瓶颈步骤：bik1的催化步骤；然后通过更换bik1的启动子，筛选出了gal1启动子来表达bik1蛋白实现了比卡菌素在酵母中的合成。同时本发明又筛选了bik1，bik2，bik3的两个不同版本的序列蛋白，最终得到了一个优化的通路，当以by4742酵母菌为底盘时，菌株的摇瓶产量达到了0.7mg/l。在此基础上本发明将bik2，bik3的启动子进行了优化：将bik2，bik3基因的启动子分别更换为gal1启动子以及将bik2，bik3基因的启动子同时更换为gal1启动子，从而筛选出了更加优化的pathway通路，使摇瓶产量达到了3.56mg/l(以by4742为底盘)。此外，由于pre-bikaverin到bikaverin的过程是由bik2，bik3反复交错催化修饰而成，为了更进一步的的优化bik2与bik3的催化过程，本发明提出了bik2和bik3蛋白融合策略，此策略大大提高了bikaverin的产量，当使用摇瓶培养时，产量达到了41.44mg/l(以by4742为底盘)。此外，我们将最终优化后pathway，转入了48种不同的酵母底盘，通过24孔深孔板sc-ura发酵，得到了高于by4742产量8倍产量的优质底盘。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例
在酵母中构建比卡菌素生物合成途径：为了在酿酒酵母中实现bikaverin生物合成途径的异种表达，我们选取了bik1，bik2，bik3，bik6以及pptase和npga等6个基因。
其中bik1，bik2，bik3来源于f.fujikuroi，分别为聚酮合酶，单加氧酶，甲基化酶，它们是比卡菌素合成的必需基因。
pptase与npga为磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyltransferase)，其功能是为了激活聚酮合酶bik1的acp功能域。其中pptase来源于f.fujikuroi，npga来源于a.nidulans，由于无法预知这两个蛋白是否能够在酵母中良好表达及是否可以激活bik1的acp域，所以我们在构建时，将这两个pptase都构建进了bikaverinpathway里面。
此外bik6是一个功能未知，被推测为参与转运的一个蛋白，在ffujikuroi中，该基因敲后，f.fujikuroi仍能表达比卡菌素，但是产量会大大降低，因此在设计酵母bikaverinpathway时，我们也将其考虑了进去。
此外，在ncbi数据库里，我们发现虽然同在f.fujikuroi种属中，报道出的bik1，bik2，bik3蛋白序列也有差异，为了保险起见，我们在bik1，bik2，bik3基因的选择时，分别选取了两个版本(版本1accessionnumbers：bik1，cab92399；bik2，caj76275；bik3，caj76274；bik6，cam90596；版本2：bik1，s0dzm7；bik2，s0e2x6；bik3，s0e608；bik6，s0dzn4)。
设计了一个酵母编码的bikaverin基因簇，包括bik1、bik2、bik3和bik6基因，以及pks酶翻译后激活acp结构域所需的pptase(磷酸戊二醇转移酶)。我们从ncbi蛋白数据库中的两条f.fujikuroi记录中检索到bik1、bik2、bik3和bik6的蛋白序列：version1(加入号：bik1，cab92399；bik2caj76275；bik3caj76274；2017年和修订版本2(加入号：bik1，s0dzm7；bik2s0e2x6；bik3s0e608；bik6，s0dzn4)。我们利用biopartsbuilder将所选择的基因的蛋白序列反向翻译成核苷酸序列，并优化密码子以适配酵母。
在构建代谢通路的过程中，首先利用yeastgoldengate的方法将基因与启动子、终止子以及左右同源臂(va)连接在一起形成转录单元(tu)。其中基因片段由公司直接合成，启动子和终止子均从酿酒酵母by4742基因组中pcr获得。然后通过versatilegeneticassemblysystem(vegas)将构建好的转录单元组装到一起，装配成完整的代谢通路。组装流程示意图见图2。
组装的质粒首先经过酵母菌落pcr验证，然后将质粒回转入大肠杆菌top10菌株中，经测序正确后，将质粒重新转入酵母by4742底盘中。在最初的pathway设计中，bik1使用rps2启动子，bik2使用tef1启动子，bik3使用tpi1启动子，bik6使用pgk1启动子，ppt使用eno2启动子，npga使用tef2启动子，见图3。
我们将得到的pathway质粒(版本1：yzm001；版本2yzm006)转入酵母中，并没有检测到有比卡菌素合成。于是我们开发了一个gfp融合策略，来寻找代谢通路的瓶颈。我们首先将一个gfp标签融合到不同基因上，然后检测gfp的荧光，发现bik1的荧光几乎看不到，表明bik1的表达有问题。为解决这个问题，我们分别使用rpl43a，gpm，gal1启动子将bik1的启动子进行了更换，发现当使用gal1启动子时，bik1得到了良好的表达。见图4。
于是我们将bik1使用gal1启动子的质粒(版本1：yzm002；版本2：yzm009见图5a)转入酵母by4742中。在sc-ura(半乳糖为碳源)的培养基中，yzm009能使酵母变的有颜色(见图5b)，通过hplc和ms检测，证实酵母生产了比卡菌素(图5c)。而使用版本1蛋白的质粒yzm002则不能使酵母产生颜色(见图5b)，也检测不到比卡菌素。随后我们又构建了一些版本一与版本二蛋白混合使用的质粒，通过对比发现，当全部使用版本2的蛋白时，摇瓶产量最高(0.7mg/l)，见图5d。于是后续实验全部采用版本2的蛋白。
此外我们也探索了删除bik6，和只是用一种pptase对产量的影响，发现bik6的删除对酵母生产比卡菌素没有明显影响，当只是用ppt或只是用npga时，比卡菌素的产量会减少，见图6。当完全删除ppt和npga时，菌株无法生产比卡菌素，见图6。
在yzm009的基础上，我们利用gfp融合策略，检测各蛋白的表达水平，发现bik2，bik3的表达水平相对bik1较低，而pptase的表达总量相对较高，图7。
为了更进一步优化比卡菌素的产量，我们将比卡菌素通路进行了启动子优化。在yzm009的基础上，我们将bik2的启动子由tef1更换为gal1启动子(yzm029)，使产量提高到了2.9mg/l；将bik3的启动子由tpi1更换为gal1后(yzm030)，产量提高到了1.37mg/l；而同时将bik2，bik3的启动子换为gal1时(yzm031)，产量提高到了3.56mg/l。在yzm031的基础上，当bik2与bik3融合后(yzm037，见图8b)，摇瓶产量提高到了41.44mg/l，图8。(然而当bik2于bik3以相反方向融合时，我们发现，反向的融合的蛋白bik3-bik2并无法生产比卡菌素。我们同时又对比了融合前后的蛋白表达水平，并没有发现显著性变化。)当我们化成更加丰富的ypg(yp+20ggal)培养基时，产量达到了131.48mg/l。当我们进一步在培养基加倍半乳糖(使用yp+40ggal)后，产量达到了202.75mg/l。(见图8)为了进一步检测构建的pathway对酵母底盘的适配性以及筛选高产底盘，我们利用融合后的pathway(yzm037)对48种酵母底盘进行了筛选，其中24种为酿酒酵母，24种为奇异酵母。经过24孔深孔板sc-ura发酵，我们筛选出了产量比by4247(15.8mg/l)高8倍的多个优质底盘，如酿酒酵母378604x(119.2mg/l)，l-1528(91mg/l)，y12(108.5mg/l)，奇异酵母ifo1804(93.2mg/l)，图9。
实施例中所述摇瓶、深孔板发酵方法为：
摇瓶发酵：挑取酵母菌落接入5mlsu-ura液体培养基中，30℃，250rpm，过夜培养。然后收集细胞，使用无菌水洗涤3次，以初始od＝0.5od转接到30mlsc-ura(如有gal1启动子则使用半乳糖为碳源，没有使用gal1启动子的菌株以葡糖糖为碳源)，30℃，250rpm，培养4天。
24深孔板发酵：首先酵母菌落接入24深孔板(每孔加有1.5mlsc-ura液体培养基)，30℃，250rpm，过夜培养。然后收集细胞，使用无菌水洗涤3次，以初始od＝0.5od转接到新的24深孔板中，每孔加有1.5mlsc-ura液体培养基(半乳糖为碳源)，30℃，250rpm，培养4天。
比卡菌素提取方法：
摇瓶发酵：使用2ml离心管，收集适量菌体(摇瓶发酵：2-5ml，24深孔板发酵：200μl)，12000rpm离心10min，去上清，加入500μl无菌水，加入200μl玻璃珠，加入500μl乙酸乙酯，涡旋振荡20min，转移有机相至新管中，如此抽提5次，将抽提的有机相，于真空旋干机中旋干，加入500μl乙腈溶解旋干后的产物。
表1菌株基因型
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>天津大学
<120>重组载体及其在制备比卡菌素中的应用
<130>mp1925957
<160>16
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>6031
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
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