本发明涉及基因工程
技术领域：
，更具体地说，本发明涉及一种用于植物根腐病进行基因功能验证的方法。
背景技术：
：根腐病是一种真菌引起的病，该病会造成根部腐烂，吸收水分和养分的功能逐渐减弱，最后全株死亡，主要表现为整株叶片发黄、枯萎。发病时间一般多在3月下旬至4月上旬，5月进入发病盛期。主要危害幼苗，成株期也能发病。发病初期，仅仅是个别支根和须根感病，并逐渐向主根扩展，主根感病后，早期植株不表现症状，后随着根部腐烂程度的加剧，吸收水分和养分的功能逐渐减弱，地上部分因养分供不应求，新叶首先发黄，在中午前后光照强、蒸发量大时，植株上部叶片才出现萎蔫，但夜间又能恢复。病情严重时，萎蔫状况夜间也不能再恢复，整株叶片发黄、枯萎。此时，根皮变褐，并与髓部分离，最后全株死亡。该病常与沤根症状相似，属真菌病害。病菌在土壤中和病残体上过冬，发病的根茎一般多在3月下旬至4月上旬发病，5月进入发病盛期，其发生与气候条件关系很大。苗床低温高湿和光照不足，是引发此病的主要环境条件。育苗地土壤粘性大、易板结、通气不良致使根系生长发育受阻，也易发病。另外，根部受到地下害虫、线虫的危害后，伤口多，有利病菌的侵入。在此环境下，不仅采取播种、扦插的草本花卉易受害，采取扦插、分株、压条繁殖的月季、木芙蓉、扶桑等木本花卉也易发病。发病原因:1、所栽植树种对立地条件不适应而发病:地势低洼，土壤粘重，排水不良;2、管理不当:土壤板结，透气性不好，造成根系呼吸困难受阻，根部积水腐烂;3、地下害虫危害或栽植伤口没处理好，传染病菌从伤口侵入，使根系发病。此病可由腐霉、镰刀菌、疫霉等多种病原侵染引起。病菌在土壤中或病残体上越冬，成为翌年主要初侵染源，病菌从根茎部或根部伤口侵入，通过雨水或灌溉水进行传播和蔓延。地势低洼、排水不良、田间积水、连作及棚内滴水漏水、植株根部受伤的田块发病严重。年度间春季多雨、梅雨期间多雨的年份发病严重。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于针对上述细菌（尤其是立枯丝核菌和镰刀菌）导致植物根腐病的不足，提供一种用于植物根腐病进行基因功能验证的方法，分别通过对原大豆幼株和转基因大豆幼株培养而得两种培养液，分别观察分析这两种培养液对立枯丝核菌和镰刀菌的生长抑制状况，便于准确的研究aanat基因与根腐病之间的联系。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，一种用于植物根腐病进行基因功能验证的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：步骤一、构建含目的基因aanat的大豆核表达载体rhizoctoniasolani&fusarium-aanat；步骤二、将步骤一中的所述核表达载体rhizoctoniasolani&fusarium-aanat导入原大豆细胞核基因组中，筛选获得aanat基因表达的转基因大豆幼株；步骤三、选取原大豆幼株和步骤二中所述的转基因大豆幼株，将所述原大豆幼株和转基因大豆幼株分别在相同培养液中培养，分别得原培养液和转基因培养液；步骤四、制备立枯丝核菌培养基a1组和a2组，制备镰刀菌培养基b1组和b2组；步骤五、取所述原培养液分别加入培养基a1组和培养基b1组继续培养，取转基因培养液分别加入培养基a2组和培养基b2组继续培养；步骤六、将步骤五所述培养基分别培养后，放置于显微镜下分别观察培养基a1组、a2组、b1组、b2组，对比a1组和a2组培养基中立枯丝核菌的生长状态，对比b1组和b2组培养基中镰刀菌的生长状态，菌丝数量减少和萎缩的为转基因大豆幼株的培养液。作为优选，步骤四和步骤五均需要在无菌实验室进行，且实验室温度控制在18-22度。作为优选，所述培养基a1组、培养基a2组、培养基b2组和培养基b1组的培养基数量均大于30。作为优选，步骤五中需用1.0mol/lnaoh调节培养基的ph值，且ph值需要控制在7.2-7.8之间。作为优选，步骤六中，分别对培养基a1组、a2组、b1组、b2组培养5h、10h、15h、20h、25h后各取样一次。本发明提供的一种用于植物根腐病进行基因功能验证的方法，其具有如下优点：1、通过对原大豆幼株和转基因大豆幼株培养而得两种培养液，分别观察分析这两种培养液对立枯丝核菌和镰刀菌的生长抑制状况，便于更直观准确的研究aanat基因与根腐病之间的联系。2、此验证方法通过依次间隔观察分析菌落生长情况，利用交叉对比，避免了特殊实验失误影响菌落生长，使实验数据更准确，验证结果更接近实际。3、对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。实施例一种用于植物根腐病进行基因功能验证的方法：一、构建含目的基因aanat的大豆核表达载体rhizoctoniasolani&fusarium-aanat：将aanat基因完整的orf序列构建到表达载体rhizoctoniasolani&fusarium-aanat，具体操作如下：1、采用aanat-o-f和aanat-o-r组成的引物对，在高保真扩增酶primerstar(takara公司)的作用下进行pcr扩增，得到pcr扩增产物并回收。aanat-o-f:5’-gacaccgccggctccatggcggccggaac-3’aanat-o-r:5’-tcagagattgctcttgatctatcggtttgagttgac-3’pcr反应程序：78℃预变性1min；78℃10s、46℃15s、82℃2min，35个循环；82℃10min。2、回收并纯化步骤1得到的pcr扩增产物。3、用限制性内切酶bamhⅰ和sacⅰ酶切单子叶植物表达载体pwmb123，回收载体骨架，得到表达载体rhizoctoniasolani&fusarium-aanat。二、将步骤一中的所述核表达载体rhizoctoniasolani&fusarium-aanat导入原大豆细胞核基因组中，筛选获得aanat基因表达的转基因大豆幼株（利用现有技术，进行表达载体的导入）；三、选取原大豆幼株和步骤二中所述的转基因大豆幼株，将所述原大豆幼株和转基因大豆幼株分别在相同培养液中培养，分别得原培养液和转基因培养液：1、制备完全无机盐培养液：硝酸钙100克、磷酸二氢钾25克，硫酸镁25克，氯化铁25克，氯化钾25克，将上述成分溶解在100升蒸馏水中，培养液制备完成，平均分为两份备用；2、取原大豆幼株50株和转基因大豆幼株50株分别放入上述两份培养液中培养，待培养15d后完成，得到培养液a（代替原培养液）和培养液b（代替转基因培养液）；四、制备立枯丝核菌培养基a1组和a2组，制备镰刀菌培养基b1组和b2组（在无菌实验室进行）：1、制备细培养基：蛋白胨(tryptone)10g/l酵母提取物(yeastextract)5g/l氯化钠(nacl)10g/l按比例溶解在蒸馏水中，装入锥形瓶中，用纱布+报纸或牛皮纸封口，高压蒸汽灭菌20分钟，利用1.0mol/lnaoh调ph到7.2-7.8之间。此培养基制备120个备用：2、取上述培养基30个，加入相同质量的立枯丝核菌菌落，得到培养基a1组；取上述培养基30个，加入相同质量的立枯丝核菌菌落，得到培养基a2组，取上述培养基30个，加入相同质量的镰刀菌菌落，得到培养基b1组，取上述培养基30个，加入相同质量的镰刀菌菌落，得到培养基b2组；五、取所述原培养液分别加入培养基a1组和培养基b1组继续培养，取转基因培养液分别加入培养基a2组和培养基b2组继续培养（在无菌实验室进行）；1、取等量的培养液a分别加入培养基a1组和b1组；2、取等量的培养液b分别加入培养基a2组和b2组。六、将步骤五所述培养基a1组、a2组、b1组、b2组继续培养并观察（在无菌实验室进行）：1、将步骤五所述培养基a1组、a2组、b1组、b2组继续培养5h后取样，得到样品s1a1组，s1a2组，s1b1组，s1b2组，将样品s1a1组，s1a2组，s1b1组，s1b2组分别置于显微镜100x油镜下观察，得到如下观察数据：样品s1a1组s1a2组s1b1组s1b2组平均菌落密度（cfu）67551451222、将步骤五所述培养基a1组、a2组、b1组、b2组继续培养10h后取样，得到样品s2a1组，s2a2组，s2b1组，s2b2组，将样品s2a1组，s2a2组，s2b1组，s2b2组分别置于显微镜100x油镜下观察，得到如下观察数据：样品s2a1组s2a2组s2b1组s2b2组平均菌落密度（cfu）9547176983、将步骤五所述培养基a1组、a2组、b1组、b2组继续培养15h后取样，得到样品s3a1组，s3a2组，s3b1组，s3b2组，将样品s3a1组，s3a2组，s1b1组，s1b2组分别置于显微镜100x油镜下观察，得到如下观察数据：样品s3a1组s3a2组s3b1组s3b2组平均菌落密度（cfu）13542189854、将步骤五所述培养基a1组、a2组、b1组、b2组继续培养20h后取样，得到样品s4a1组，s4a2组，s4b1组，s4b2组，将样品s4a1组，s4a2组，s4b1组，s4b2组分别置于显微镜100x油镜下观察，得到如下观察数据：样品s4a1组s4a2组s4b1组s4b2组平均菌落密度（cfu）21137226715、将步骤五所述培养基a1组、a2组、b1组、b2组继续培养25h后取样，得到样品s5a1组，s5a2组，s5a3组，s5a4组，将样品s5a1组，s5a2组，s5b1组，s5b2组分别置于显微镜100x油镜下观察，得到如下观察数据：样品s5a1组s5a2组s5b1组s5b2组平均菌落密度（cfu）2793324457分析上述实验记录，得到如下结论：1、随着培养时间的推移，培养基a2组中立枯丝核菌的菌落密度不断减小，由此可知，转基因培养液对立枯丝核菌有抑制和萎缩作用；2、随着培养时间的推移，培养基b2组中镰刀菌的菌落密度不断减小，由此可知，转基因培养液对镰刀菌有抑制和萎缩作用；故转基因大豆幼株对立枯丝核菌和镰刀菌均有抗性，而植物根腐病主要由立枯丝核菌和镰刀菌引起，由此可知，转基因大豆幼株具有抗根腐特性，验证aanat基因成功。本发明提供的一种用于植物根腐病进行基因功能验证的方法，其通过对原大豆幼株和转基因大豆幼株培养而得两种培养液，分别观察分析这两种培养液对立枯丝核菌和镰刀菌的生长抑制状况，便于更直观准确的研究aanat基因与根腐病之间的联系；此验证方法通过依次间隔观察分析菌落生长情况，利用交叉对比，避免了特殊实验失误影响菌落生长，使实验数据更准确，验证结果更接近实际。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节与这里示出与描述的图例。当前第1页12