一种用于直接检测AMOZ的柠檬酸基树状半抗原CAA、树状抗原、重链抗体及制备方法与流程

本发明属于生物检测技术领域。更具体地，涉及一种用于直接检测amoz的柠檬酸基树状半抗原caa、树状抗原、重链抗体及制备方法。

背景技术：

呋喃它酮是人工合成的硝基呋喃类广谱抗生素，具有杀菌能力强、抗菌谱广、价格低廉等优点，曾被广泛应用于畜禽和水产养殖业。有关研究证明，呋喃它酮原药及其代谢物具有相当大的毒性，具有致癌致畸致突变作用。鉴于呋喃它酮及其代谢物的危害性，1995年起欧美多国禁止其在动物生产中使用，我国2002年也规定动物性食品中不得检出。但是，由于呋喃它酮药效好，非法使用情况仍然比较严重，农业部通报2019年畜禽及蜂产品兽药残留监控结果显示，硝基呋喃类代谢物检测的171批样品中超标2批；山西省市场监督管理局网站发布2019年第10期食品安全监督抽检信息公告显示，山东省沂南县同心食品有限公司生产的冻鸭呋喃它酮代谢物检出值为2.3μg/kg；因此加强对动物性食品中呋喃它酮及其代谢物的检测监控显得十分紧迫和必要。由于硝基呋喃类药物代谢速度很快，在生物体内数小时便可降解，而代谢产物可与细胞膜蛋白结合形成稳定结合物，长期存在于生物体内；因此，测定动物组织中呋喃它酮代谢物的残留比检测呋喃它酮原药更具有现实意义。

呋喃它酮代谢物(3-氨基-5-吗啉甲基-2-恶唑烷酮，amoz)是抗生素呋喃它酮残留的标示物。目前，amoz的检测方法主要有色谱方法及其联用技术、分光光度法、免疫分析法等。前两种方法属于仪器分析检测技术，具有准确、灵敏、特异性好和假阳性率低的优点；但是，其样本前处理及测定过程繁琐，费用高、需要专业人员操作，不适于大量样本筛查。而酶联免疫吸附检测法具有灵敏度高、特异性强、仪器设备要求低和样本前处理相对简单等优点，是近年来常用的农兽药检测方法。目前，amoz残留免疫检测方法主要是检测amoz的衍生物，而现有直接检测amoz的方法中的衍生化过程十分耗时(cn103951630b)。并且现在amoz残留免疫检测主要以单克隆抗体和多克隆抗体为主，虽然单克隆抗体和多克隆抗体具有快速、灵敏、高通量的优势，但是在极端条件下抗体稳定性变差，容易失活。而基于驼源重链抗体直接检测amoz的方法未见报道。

酶联免疫吸附检测法基于抗原、抗体之间特异性识别，能够实现对检测样品中目标物的定性、定量分析，其关键在于制备出高特异性和高灵敏度的抗体，建立该方法的首要条件是设计合成有效的半抗原及完全抗原。但是，传统的半抗原设计大多为“试错法”，需要设计多个半抗原分子，然后根据大量的动物免疫实验效果来进行优化选择，不仅工作量大，周期长，成本高。因此，亟需研发一种简便、快速、检测特异性强、灵敏度高的amoz的检测方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有检测amoz的方法的缺陷和不足，提供一种用于直接检测amoz的柠檬酸基树状半抗原caa、树状抗原、重链抗体及制备方法。

本发明的第一个目的是提供一种柠檬酸基树状半抗原caa。

本发明的第二个目的是提供所述柠檬酸基树状半抗原caa在制备amoz树状抗原中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种amoz树状抗原。

本发明的第四个目的是提供所述柠檬酸基树状半抗原caa或所述amoz树状抗原在制备amoz重链抗体中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种amoz重链抗体。

本发明的第六个目的是提供所述amoz重链抗体在检测amoz或制备amoz检测试剂盒中的应用。

本发明的第七个目的是提供一种检测amoz的方法。

本发明的第八个目的是提供一种amoz检测试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种柠檬酸基树状半抗原caa，是将amoz与柠檬酸进行缩合反应而得到，其结构式如式(i)所示：

本发明利用分子模拟技术，通过对amoz的三维构型、电荷分布和分子疏水表面情况进行模拟，比较半抗原与amoz的电子构型和优势构象之间的相似度，最终设计出了最佳半抗原(柠檬酸基树状半抗原caa)。

优选地，所述柠檬酸基树状半抗原caa的制备方法为：

(1)将柠檬酸溶解于无水乙醇中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)在4℃中搅拌10小时，得到柠檬酸-edc-nhs溶液；

(2)将amoz的乙醇溶液加入柠檬酸-edc-nhs溶液中，在4℃搅拌反应8小时，将反应产物液-液分层后，取有机相干燥浓缩，浓缩物经硅胶柱层析纯化获得白色粉末，即为所述柠檬酸基树状半抗原caa；其中，所述柠檬酸的结构式如式(iii)所示：

所述柠檬酸基树状半抗原caa在制备amoz树状抗原中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种amoz树状抗原，是将所述柠檬酸基树状半抗原caa与蛋白(protein)偶联得到，其结构式如式(ii)所示：

其中，protein为鸡卵清白蛋白或刀豆球蛋白a。

本发明利用柠檬酸基树状半抗原caa引用柠檬酸，每个柠檬酸分子偶联3个分子amoz，使得amoz的结构特征明显增强，有效地提高免疫原性。

优选地，所述柠檬酸基树状半抗原caa与蛋白的偶联比为1～2：60～80。

更优选地，所述柠檬酸基树状半抗原caa与蛋白的偶联比为1：60。

所述柠檬酸基树状半抗原caa或所述amoz树状抗原在制备amoz重链抗体中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种amoz重链抗体，其制备方法为：用所述柠檬酸基树状半抗原caa与刀豆球蛋白a的偶联物对羊驼进行免疫后，交替使用proteina和proteing亲和层析柱对羊驼血清进行分离，洗脱，即得所述amoz重链抗体。

所述amoz重链抗体在检测amoz或制备amoz检测试剂盒中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种检测amoz的方法，以所述柠檬酸基树状半抗原caa与鸡卵清白蛋白的偶联物作为包被原，以所述amoz重链抗体作为检测抗体进行检测。

优选地，所述检测的方法为间接竞争elisa法。

本发明还提供了一种amoz检测试剂盒，包括所述amoz重链抗体。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的柠檬酸基树状半抗原caa、amoz树状抗原的制备方法简单易行、成本低，并且能够有效地刺激被免疫动物产生灵敏度高、特异性强的amoz重链抗体igg3和igg2，该重链抗体能够特异性结合amoz并对amoz有抑制作用，igg2的抑制率为34.12％，igg3的抑制率为68.54％。利用其建立的直接检测amoz的方法对amoz的最低检测限为0.99ng/ml，ic50为50.95ng/ml，线性范围为8.87-292.71ng/ml，具有简便快速、灵敏度高、特异性强的特点，能够满足目前高通量、快速、现场检测环境和食品样品中amoz的需求。驼源重链抗体作为天然存在的最小分子抗体，不仅具有分子量小，易克隆操作，可以后续用于将该重链抗体的可变区制备出由一个重链可变区组成的驼源单域抗体，构建基于抗原-纳米抗体特异性结合的免疫分析法。

附图说明

图1是柠檬酸基树状半抗原caa的质谱图。

图2是sds-page对羊驼血清中的三个亚型的鉴定结果图。

图3是基于重链抗体igg3建立的间接竞争elisa标准曲线图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1柠檬酸基树状半抗原caa的制备

1、实验方法

一种柠檬酸基树状半抗原caa的制备方法，包括以下步骤：

(1)活化羧基

将0.1mol柠檬酸溶解于30ml无水乙醇中，加入0.15moledc和nhs，在4℃搅拌10小时，得到柠檬酸-edc-nhs溶液。

(2)羧基与氨基缩合

0.3molamoz的乙醇溶液中缓慢地逐滴加入步骤(1)制备得到的柠檬酸-edc-nhs溶液中，在4℃搅拌反应8小时后，将反应产物用乙酸乙酯和饱和nacl萃取，液-液分层，滤液通过减压蒸馏除溶剂后，取有机相干燥浓缩，浓缩物经硅胶柱层析纯化获得白色粉末，即为柠檬酸基树状半抗原caa。

2、实验结果

柠檬酸基树状半抗原caa的质谱图如图1所示，可以看出，742.19为半抗原ph-a的正离子分子峰，计算得其相对分子质量为741.19，与实际的相对分子质量相符。

以上结果说明：本发明成功制备得到了柠檬酸基树状半抗原caa，其结构式如式(i)所示：

实施例2amoz树状抗原的制备

1、实验方法

一种amoz树状抗原的制备方法，将实施例1制备得到的柠檬酸基树状半抗原caa通过曼尼希法偶联protein(鸡卵清白蛋白(ova)和刀豆球蛋白a(cona))而得到。具体方法为：

将0.6mmolprotein溶解于6ml0.1mph4.6醋酸盐缓冲液(配方：3.7g冰醋酸和3.2g醋酸钠溶解于1l去离子水)中，在4℃搅拌，逐滴滴加实施例1制备得到的柠檬酸基树状半抗原caa的dmso溶液(0.01mmol柠檬酸基树状半抗原caa溶解于200ul无水dmso)，然后加入300ul30％的甲醛溶液，混合物在室温中反应12小时，离心取上清液，上清液于4℃下透析3天，每天换两次透析液，共透析6次，收集透析袋中的溶液，即为免疫原溶液，即得amoz树状抗原(amoz完全抗原caa-ova和caa-cona)，其结构式如式(ii)所示：

实施例3amoz重链抗体的制备

1、实验方法

(1)羊驼的免疫

用健康的羊驼作为实验动物，以实施例2制备得到的amoz完全抗原caa-cona作为免疫原，在羊驼背颈部进行皮下注射，每次免疫剂量为0.5ml(其中含有0.5mg免疫原)。首次免疫用0.5ml完全弗氏佐剂与抗原乳化后用于免疫，4周后用0.5ml不完全弗氏佐剂与抗原乳化后加强免疫，之后每间隔2周加强免疫一次。免疫前取10ml血分离血清作为阴性对照。从第二次免疫开始，每次取免疫一周后从羊驼颈部采集全血50ml，共免疫5次。

(2)将步骤(1)得到的5次免疫的羊驼血清交替使用proteina和proteing亲和层析柱，对其进行盲纯。具体步骤如下：

1)配制溶液

平衡缓冲液：20mmpb(配方：4.13g/lnah2po4·2h2o+21.85g/lna2hpo4·12h2o+5.58g/lkcl，ph7.0)-用于平衡纯化柱，洗涤杂蛋白；

igg3洗脱液：0.15mnacl-醋酸盐溶液(ph3.5)-洗脱proteing中的igg3；

igg1洗脱液：0.1m甘氨酸-盐酸缓冲液(ph2.7)-洗脱proteing中的igg1；

igg2洗脱液：0.15mnacl-醋酸盐溶液(ph4.5)-洗脱proteina中的igg2；

中和液：1mol/ltris-用于中和洗脱液。

2)稀释血清，平衡填料

proteing层析柱和proteina层析柱先用平衡缓冲液平衡，将稀释好的羊驼血清先后上样至proteing层析柱和proteina层析柱，10ml平衡缓冲液冲洗proteing，a填料柱。proteing先用8mligg3洗脱液洗脱蛋白，边收集边用中和液中和(可用ph试纸测流出液ph)，得到的蛋白为igg3。同时proteina用8mligg2洗脱液洗脱蛋白，边收集边用中和液中和，得到的蛋白为igg2。之后用8mligg1洗脱液冲洗proteing，a填料柱，使残留的蛋白充分洗脱，边收集边用中和液中和，得到的蛋白为igg1。

用nanodrop测定洗脱液蛋白浓度，通过sds-page鉴定得到的蛋白是否正确及纯度是否符合要求，选择浓度较高、蛋白较纯的三种洗脱液进行elisa鉴定。

3)填料的再生

用完的proteina和proteing分别用5倍柱体积的igg1洗脱液、平衡缓冲液、一级水、20％乙醇洗涤，并在20％乙醇、4℃环境下保存。

2、实验结果

sds-page对羊驼血清中的三个亚型的鉴定结果图如图2所示，可以看出，血清的条带较杂，igg1有2个条带，分别在50kd和30kd附近；igg2只有一个条带，在46kd附近；igg3只有一个条带，在43kd附近；该鉴定结果符合igg三个亚型的分子量大小和结构。

以上结果说明：本发明制备得到了3种不同分子量的igg抗体，分别为43kd(重链)的igg3，50kd(重链)和25kd(轻链)的igg1以及46kd(重链)的igg2，成功制备得到了amoz重链抗体igg3和igg2。

实施例4amoz重链抗体的eilsa鉴定

1、实验方法

以实施例2制备得到的amoz完全抗原caa-ova作为包被原，取实施例3制备得到的amoz重链抗体为检测抗体，采用间接竞争elisa方法测定amoz重链抗体的抗血清效价与抑制率，综合考虑各重链抗体的效价、抑制率，对其进行评价。具体步骤如下：

1)包板

将amoz完全抗原caa-ova用0.05m碳酸盐buffer(ph9.6)稀释至1μg/ml，按100μl/well，4℃包被过夜；弃包被液，pbst洗涤2次，每孔加入120μl5％脱脂牛奶，37℃封闭3h；弃封闭液，37℃烘干60min，用密封袋装于4℃待用，得到包好的酶标板。

2)血清效价与抑制检测

将步骤(1)包好的酶标板，每孔分别加入50μl稀释好的1000ng/ml药物(amoz)、50μlpbs、50μl按梯度倍数稀释(100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、1600ng/ml、3200ng/ml、6400ng/ml)的实施例3制备得到的amoz重链抗体(igg2和igg3)，做两组平行。37℃孵育40min，用pbst洗五次，拍干孔内液体，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗alpaca(goatanti-alpacaiggh&l)二抗(用pbs按1:5000稀释)，37℃孵育30min，用pbst洗五次，拍干孔内液体，加入100μltmb底物液，37℃避光显色10min；加入50μl终止液(2mh2so4)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸收值。

2、实验结果

amoz重链抗体igg2和igg3的免疫效果图如表1所示，可以看出，本发明制备得到的amoz重链抗体igg2和igg3均对amoz有抑制作用，igg2的抑制率为34.12％，igg3的抑制率为68.54％。

表1amoz重链抗体igg2和igg3的免疫效果

以上结果说明：本发明成功制备得到了能够特异性结合amoz的重链抗体。实施例5基于amoz重链抗体建立间接竞争elisa法

1、实验方法

由实施例4的结果可知，amoz重链抗体igg3比igg2有更好的抑制作用，第四次免疫的效果最佳，因此选用第四次免疫的igg3用于建立基于amoz重链抗体的间接竞争elisa标准曲线。具体步骤如下：

1)包板

将amoz完全抗原caa-ova用0.05m碳酸盐buffer(ph9.6)稀释至100ng/ml，按100μl/well，4℃包被过夜；弃包被液，pbst洗涤2次，每孔加入120μl5％脱脂牛奶，37℃封闭3h；弃封闭液，37℃烘干60min，用密封袋装于4℃待用，得到包好的酶标板。

2)血清效价与抑制检测

将步骤(1)包好的酶标板，每孔加入50μlamoz重链抗体igg3和不同浓度(0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml)的50μl的amoz标准品。37℃孵育40min，用pbst洗五次，拍干孔内液体，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗alpaca(goatanti-alpacaiggh&l)二抗(用pbs按1:5000稀释)，37℃孵育30min，用pbst洗五次，拍干孔内液体，加入100μltmb底物液，37℃避光显色10min；加入50μl终止液(2mh2so4)终止反应；用酶标仪读取450nm处的吸光值。

以amoz标准品浓度对横坐标，b/b0(加入amoz的孔的od450/未加入amoz的孔的od450)为纵坐标，建立间接竞争elisa标准曲线。

2、实验结果

基于amoz重链抗体建立的间接竞争elisa标准曲线如图3所示，可以看出，标准曲线呈s型，线性相关性较好，对amoz的最低检测限为0.99ng/ml，ic50为50.95ng/ml，线性范围为8.87-292.71ng/ml。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。