一种腈水合酶氨基酸基序的改造及其应用的制作方法

本发明涉及一种腈水合酶氨基酸基序的改造及其应用，属于生物工程
技术领域：
。
背景技术：
：腈水合酶(nitrilehydratase，简称nhase，ec4.2.1.84)，是一类可以催化腈类物质通过水合反应转化为高附加值酰胺类化合物的金属酶，在大宗化学品丙烯酰胺的工业生产上已经被广泛应用。目前，腈水合酶以其绿色环保、反应条件较温和、安全系数高等优势，而逐渐替代传统的化学法，使得酰胺类的生产符合可持续发展和绿色生产理念。腈水合酶通常由α和β两个亚基构成，研究发现，目前已报道的原核生物来源的腈水合酶大都存在稳定性差、催化活性低、催化底物谱窄的问题。也有很多研究尝试对其进行了改造，来提高其相关的性质。但是目前的催化效率不高、底物谱窄等问题仍然限制着腈水合酶进一步的开发和应用。技术实现要素：针对现有的技术难点及存在的问题，本发明通过对来源于嗜热假诺卡氏菌(pseudonocardiathermophila)的腈水合酶的氨基酸改造，以期能拓宽底物谱并提升催化性能。本发明提供了一种腈水合酶突变体，所述腈水合酶包含α亚基和β亚基；所述突变体是将腈水合酶亲本的α亚基的第6和/或126位突变，和/或β亚基的第46位突变；所述腈水合酶亲本的α亚基的氨基酸序列如seqidno.1所示，β亚基的氨基酸序列如seqidno.2所示。在本发明的一种实施方式中，所述突变体包括如下(a)-(f)任一：(a)将β亚基的第46位突变为k，得到突变体m46k；(b)将α亚基的第6位突变为t，得到突变体l6t；(c)将α亚基的第126位突变为y，得到突变体f126y；(d)将α亚基的第126位突变为y，并将β亚基的第46位突变为k；(e)将α亚基的第6位突变为t，并将β亚基的第46位突变为k；(f)将α亚基的第6位突变为t、第126位突变为y，并将β亚基的第46位突变为k。本发明提供了编码所述突变体的基因。本发明提供了携带所述基因的重组质粒。在本发明的一种实施方式中，以pet-24a(+)为表达载体。本发明提供了表达所述突变体，或含有所述基因的宿主细胞。在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞包含原核或真核微生物。在本发明的一种实施方式中，以e.colibl21(de3)为表达宿主。本发明提供了一种生产酰胺类物质的方法，所述方法是以腈类物质为底物，利用所述突变体催化生成酰胺类物质。在本发明的一种实施方式中，所述腈类物质包括异丁腈、正戊腈、丙烯腈、烟腈、2-氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈和萘甲腈。在本发明的一种实施方式中，所述酰胺类物质包括异丁酰胺、戊酰胺、丙烯酰胺、烟酰胺、吡嗪酰胺、萘甲酰、苯甲酰胺和肉桂酰胺。本发明还提供了所述突变体，或所述基因，或所述重组质粒，或所述宿主细胞在制备酰胺类物质中的应用。本发明的有益效果：本发明提供了pt-nhase突变体，所述突变体相对于野生型，对β亚基上的46号位，α亚基上的6、126号位进行了突变，得到突变体(m46k、l6t及f126y)及其组合突变体pt3(m46k-l6t-f126y)。突变体的比酶活较野生型均有显著的提高，m46k比酶活提高最显著，约为野生型的6倍；突变体l6t和f126y的酶活则分别是野生型的2和2.5倍。并且突变体的底物谱较野生型拓宽，对于异丁腈、正戊腈、丙烯腈、烟腈、2-氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈和萘甲腈等均有很好的催化作用，且催化性能较野生型也有显著的提升。附图说明图1为纯酶的sds-page电泳图，m：蛋白marker，1:pet24a，2：wt，3：m46k，4：l6t，5：f126y，6：m46k-l6t，7：m46k-f26y，8：m46k-l6t-f126y。图2为ptnhase野生酶wt与突变体m46k、l6t、f126y、m46k-l6t、m46k-f26y及m46k-l6t-f126y的对于烟腈催化的比酶活。图3为ptnhase野生酶wt与突变体m46k、l6t、f126y、m46k-l6t、m46k-f26y及m46k-l6t-f126y对于8种不同腈类底物的催化活性。图4为ptnhase野生酶wt与突变体m46k、l6t、f126y、m46k-l6t、m46k-f26y及m46k-l6t-f126y对于烟腈催化的耐受性。具体实施方式腈水合酶的酶活力(u)：单位酶活力定义为25℃下，每分钟催化烟腈生成1μmol烟酰胺所需要的酶量。腈水合酶的比酶活(u/mg)：每毫克腈水合酶所具有的酶活力。lb培养基：胰蛋白胨10.0g/l，酵母提取物5.0g/l，nacl10.0g/l，卡那霉素终浓度50μg/ml。2×yt培养基：胰蛋白胨16.0g/l，酵母提取物10.0g/l，nacl5.0g/l，卡那霉素终浓度50μg/ml。采用亲和层析的方法纯化野生型wt及其6个突变体，纯化柱为ge公司的streptraphp1ml柱。在10000rpm条件下离心3min收集菌体细胞，用20ml结合缓冲液(20mmna2hpo4·12h2o，280mmnacl，6mmkcl，ph7.4)重悬，于冰水混合物中超声破碎。破碎液在4℃、12000rpm条件下离心30min，取上清液过0.22μm有机滤膜。纯化柱在用结合缓冲液平衡后，进行上样，然后用结合缓冲液洗去杂蛋白，目的蛋白用100％的洗脱缓冲液(20mmna2hpo4·12h2o，280mmnacl，6mmkcl，2.5mmd-desthiobiotin，ph7.4)洗脱并收集。蛋白浓度使用bradford蛋白浓度检测试剂盒进行定量。实施例1：ptnhase的各突变体的构建根据ptnhase的野生型质粒pet24a(+)-ptwt(该质粒记载于chengetal.,computationaldesignofnitrilehydratasefrompseudonocardiathermophilajcm3095forimprovedthermostability,2020)，采用全质粒pcr的方法构建了突变体质粒pet24a(+)-m46k，l6t，f126y及其组合突变体m46k-l6t、m46k-f26y和m46k-l6t-f126y。首先以质粒pet24a(+)-ptwt为模板，突变序列设计在引物上，通过pcr扩增出碱基序列发生突变的dna片段，所用引物序列如表1所示，扩增体系如表2所示，pcr扩增反应条件为95℃预变性3min，98℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸1min45s，72℃延伸5min，共30个循环。将pcr产物用dpni消化酶消化2-3h，转化e.colidh5α，在lb平板培养后、挑取单克隆由天霖生物科技(无锡)有限公司进行测序验证，得到阳性转化子。表1引物序列表2pcr扩增体系实施例2：ptnhase的野生型及突变体的催化效率将ptnhase的野生型wt及重构质粒pet24a(+)-m46k，pet24a(+)-l6t，pet24a(+)-f126y及其组合突变体pet24a(+)-m46k-l6t、pet24a(+)-m46k-f26y和pet24a(+)-m46k-l6t-f126y分别转化至e.colibl21(de3)，挑取单菌落至5mllb培养基，37℃、200rpm条件下培养7-8h。将种子液按1％(v/v)转接至100ml2×yt培养基，37℃、200rpm条件下培养至od600至0.6-0.8，加入终浓度为0.4mm的异丙基硫代半乳糖苷(iptg)以及0.1g/l的cocl2·6h2o，改变培养温度为24℃，诱导表达12-16h。纯化野生型wt及其6个突变体，采用sds-page检测目的蛋白的纯化质量，检测如图1所示，可见野生型及其突变体所表达的蛋白在纯化后蛋白条带单一，纯化质量高。用10mmkpb(磷酸缓冲盐，ph7.4)溶液将wt及其突变体纯酶的浓度稀释至0.5mg/ml，取10μl至1.5ml离心管中，置于25℃金属浴上。向离心管中加入490μl底物(200mm烟腈溶液)，充分涡旋混匀，25℃下反应10min，然后加入500μl纯乙腈溶液进行终止。将反应液用纯乙腈溶液稀释适当倍数，过0.22μm滤膜。液相检测方法：流动相组成为乙腈：水＝1：2(v/v)，流速为0.6ml/min，检测波长为215nm，柱温为40℃，测定反应体系中产物烟酰胺的生成量。wt及突变体的比酶活计算结果如图2所示，野生酶wt的比酶活为70.78±2.33u/mg，突变体m46k、l6t及f126y的比酶活分别为418.72±16.44u/mg、143.95±5.20u/mg、176.78±0.49u/mg，它们的组合突变体m46k-l6t、m46k-f126y及pt3(m46k-l6t-f126y)的比酶活分别为433.51±2.45u/mg、760±23.3u/mg、679.89±18.04u/mg。即当上述三个氨基酸残基发生突变时，腈水合酶的比酶活均有不同程度地提高，进行组合后酶活有更大程度地提升，说明上述3个氨基酸残基可能在两个亚基的关键结构域，对于腈水合酶的催化活性具有重要作用。实施例3：ptnhase的野生型及突变体m46k的底物谱培养诱导及反应体系同实施例2。基于上述的纯酶进行不同底物催化反应，其中异丁腈、丙烯腈、肉桂腈和苯甲腈催化反应用的浓度为0.05mg/ml，戊腈、烟腈和2-氰基吡嗪催化反应用的浓度为0.5mg/ml，萘甲腈催化反应用的浓度为0.01mg/ml。液相检测方法：流动相组成为乙腈：水＝1：2(v/v)；流速：除肉桂酰胺和苯甲酰胺为1ml/min外，异丁酰胺、戊酰胺、丙烯酰胺、烟酰胺、吡嗪酰胺和萘甲酰胺均为0.6ml/min；检测波长：异丁酰胺和戊酰胺为202nm，丙烯酰胺、烟酰胺、苯甲酰胺和萘甲酰胺为215nm，吡嗪酰胺和肉桂酰胺为261nm；柱温为40℃，测定反应体系中产物酰胺的生成量。wt及突变体m46k的比酶活计算结果如图3所示，对于异丁腈、正戊腈、丙烯腈、烟腈、2-氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈和萘甲腈等8种腈类底物催化，野生酶wt的比酶活分别为699.90±75.87u/mg、39.74±4.48u/mg、1692.88±9.15u/mg、70.78±2.33u/mg、62.99±0.00u/mg、63.69±0.35u/mg、15.63±0.76u/mg、19.92±0.21u/mg，突变体m46k的比酶活分别为3362.52±0.00u/mg、169.79±6.99u/mg、1602.99±8.23u/mg、418.72±16.44u/mg、512.59±0.00u/mg、667.72±9.33u/mg、280.28±5.01u/mg、132.48±2.15u/mg。其中，除丙烯腈比酶活几乎没有变化之外，m46k催化异丁腈、正戊腈的比酶活分别是wt的4.8倍、4.27倍；其催化烟腈、2-氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈和萘甲腈的比酶活分别是wt的5.9、8.13、10.48、17.9和6.65倍。即当46号位点的甲硫氨酸突变为赖氨酸时，除丙烯腈外，腈水合酶对于其他不同腈类底物的比酶活均有不同程度地提高，尤其是对于较大位阻底物分子的活性提升更为显著。实施例4：ptnhase的野生型及突变体的耐受性将od600为10的发酵菌液wt及其突变体分别置于烟腈浓度为0.8mol·l-1以及烟酰胺浓度为1.6mol·l-1的体系(200μl菌液+800μl烟腈/烟酰胺)中，对照组体系添加等量的10mmkpb，25℃处理30min。于6000rpm离心10min弃上清，再用10mmkpb进行重悬，反复2-3次，然后用200μlkpb进行重悬，吸取10μl全细胞至1.5ml离心管进行催化反应，其中未经处理的对照组和实验组分别添加490μl200mm烟腈，25℃金属浴反应10min，然后加入500μl纯乙腈溶液进行终止。将反应液用纯乙腈溶液稀释适当倍数，过0.22μm滤膜。液相检测方法同实施例1，通过分析烟腈和烟酰胺处理后发酵菌液的残余酶活来检测底物/产物耐受性。未经任何处理的细胞相对酶活定义为100％。与野生型腈水合酶相比，l6t在烟酰胺中的耐受性提高了41.73％，f126y在烟腈中的耐受性提高了85.08％，m46k-f126y突变体对于烟酰胺耐受性几乎不变的情况下，对于烟腈耐受性提高了52.68％；而pt3对于烟腈耐受性几乎不变的情况下，对于烟酰胺耐受性提高了10.36％％。表3突变体的在不同溶液中的剩余酶活(％)wtm46kl6tf126ym46k-l6tm46k-f126ym46k-l6t-f126ykpb100100100100100100100烟腈7.844.938.5814.517.2511.946.32烟酰胺52.0541.5673.7747.5945.3051.3857.44虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。sequencelisting<110>江南大学<120>一种腈水合酶氨基酸基序的改造及其应用<130>baa201486a<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>205<212>prt<213>pseudonocardiathermophila<400>1metthrgluasnileleuarglysseraspglugluileglnlysglu151015ilethralaargvallysalaleuglusermetleuilegluglngly202530ileleuthrthrsermetileaspargmetalagluiletyrgluasn354045gluvalglyprohisleuglyalalysvalvalvallysalatrpthr505560aspprogluphelyslysargleuleualaaspglythrglualacys65707580lysgluleuglyileglyglyleuglnglygluaspmetmettrpval859095gluasnthraspgluvalhishisvalvalvalcysthrleucysser100105110cystyrprotrpprovalleuglyleuproproasntrpphelysglu115120125proglntyrargserargvalvalarggluproargglnleuleulys130135140gluglupheglyphegluvalproproserlysgluilelysvaltrp145150155160aspserserserglumetargphevalvalleuproglnargproala165170175glythraspglytrpsergluglugluleualathrleuvalthrarg180185190glusermetileglyvalgluproalalysalavalala195200205<210>2<211>233<212>prt<213>pseudonocardiathermophila<400>2metasnglyvaltyraspvalglyglythraspglyleuglyproile151015asnargproalaaspgluprovalpheargalaglutrpglulysval202530alaphealametpheproalathrpheargalaglyphemetglyleu354045aspglupheargpheglyilegluglnmetasnproalaglutyrleu505560gluserprotyrtyrtrphistrpileargthrtyrilehishisgly65707580valargthrglylysileaspleuglugluleugluargargthrgln859095tyrtyrarggluasnproaspalaproleuprogluhisgluglnlys100105110progluleuilegluphevalasnglnalavaltyrglyglyleupro115120125alaserarggluvalaspargproprolysphelysgluglyaspval130135140valargpheserthralaserprolysglyhisalaargargalaarg145150155160tyrvalargglylysthrglythrvalvallyshishisglyalatyr165170175iletyrproaspthralaglyasnglyleuglyglucysprogluhis180185190leutyrthrvalargphethralaglngluleutrpglyproglugly195200205aspproasnserservaltyrtyraspcystrpgluprotyrileglu210215220leuvalaspthrlysalaalaalaala225230<210>3<211>144<212>prt<213>pseudonocardiathermophila<400>3metseralaglualalysvalargleulyshiscysprothralaglu151015aspargalaalaalaaspalaleuleualaglnleuproglyglyasp202530argalaleuaspargglypheaspgluprotrpglnleuargalaphe354045alaleualavalalaalacysargalaglyargpheglutrplysgln505560leuglnglnalaleuileserserileglyglutrpgluargthrhis65707580aspleuaspaspprosertrpsertyrtyrgluhisphevalalaala859095leugluservalleuglyglugluglyilevalgluproglualaleu100105110aspgluargthralagluvalleualaasnproproasnlysasphis115120125hisglyprohisleugluprovalalavalhisproalavalargser130135140当前第1页12