一种酸性蛋白酶及其生产方法与流程

技术领域：
：本发明属于生物工程
技术领域：
，特别涉及一种产酸性蛋白酶及其生产方法。
背景技术：
：：酸性蛋白酶是一种能在ph值为2.5～5.0环境下水解蛋白质的酶类。酸性蛋白酶对ph值的这种要求，可能与其酶活中心含有的羧基有关。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。目前商品化的酸性蛋白酶大都来源于微生物，可产酸性蛋白酶的微生物菌株有：斋藤曲霉，泡盛酒曲霉，微小毛霉，青霉，根霉，宇佐美曲霉、黑曲霉、米曲霉、拟青霉、啤酒酵母、乳酸杆菌、枯草杆菌等。其中商品化的酸性蛋白酶生产菌主要是米曲霉，黑曲霉、宇佐美曲霉。专利cn201810409771.4公布了一种改变传统的曲盘结构和液体发酵工艺，采用固体发酵方式来提高酶活力的方法，发酵物料的酶活力达62314.0u/g。专利cn201510677600.6本发明公布了一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉诱变株及其液体发酵方法，所述黑曲霉突变菌株为黑曲霉tp-235，该菌株通过液体深层发酵在50l发酵罐上经补料发酵培养100-120h，产酶水平为21852u/ml。生产的酸性蛋白酶最适ph范围为2.5-3.5，最适作用温度范围为55℃-65℃，在60℃保温1h后剩余酶活为78％，80℃保温2h后剩余酶活为58.4％。专利cn201810014018.5公布了一种酸性蛋白酶及其编码基因和应用，该蛋白酶的最适ph为3.5，在ph2.5-ph3.5范围内，该酶能够维持其70％以上的酶活力；最适温度60℃，在65℃时依然具有60％以上的酶活力。但是由于受原材料价格上涨及国外同行业中酶活水平的不断提高，目前国内现有技术中酸性蛋白酶的发酵水平普遍较低，产品的竞争力不足，所以选育一株高产酸性蛋白酶的生产菌株，且所生产的酸性蛋白酶具有良好的耐酸性和耐热性，对推动新旧动能转换，产业结构升级具有重大意义。技术实现要素：：本发明的目的是提供一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉诱变菌株及其液体发酵产酶方法。本发明中所述的高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株具体为黑曲霉(aspergillusniger)fsm-208063，该菌株已于2020年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.20724。所述菌株是由保藏号为cgmccno.10789的黑曲霉经亚硝基胍诱变选育获得。本发明所述的液体发酵技术主要包括以下步骤：1)固体斜面培养基如下：酵母粉5g/l，蛋白胨2g/l，蔗糖40g/l，nah2po42g/l，mgso40.5g/l，cacl20.5g/l，kh2po44g/l，酪蛋白2g/l，琼脂15g/l，其余为水，调节ph至4.0，121℃灭菌20min，备用；2)液体种子培养基配制如下：大豆浓缩蛋白30g/l，酵母粉3g/l，蛋白胨8g/l，蔗糖2g/l，nah2po42g/l，mgso40.5g/l，cacl20.5g/l，其余为水,调节ph至4.0，121℃灭菌20min；3)种子罐培养基：玉米淀粉30g/l，大豆浓缩蛋白30g/l，蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，kh2po40.15g/l，cacl20.005g/l，其余为水，调节ph至4.0，121-123℃灭菌30-40min；4)发酵罐培养基：玉米粉40g/l，玉米淀粉20g/l，棉籽蛋白粉60g/l，nh4cl10g/l，kh2po422g/l,玉米浆18g/l，cacl210g/l，其余为水，调节ph至4.0，121-123℃灭菌30-40min；5)补料瓶培养基：麦芽糖浆300g/l，氯化铵60g/l，kh2po41.0g/l，nah2po420g/l，柠檬酸钠8.0g/l，玉米浆60g/l，cacl23.0g/l，其余为水，调节ph至3.5，121-123℃灭菌30-40min；6)培养方法：固体斜面种子培养：将所述黑曲霉诱变株取一接种环菌苔接种于固体斜面，34℃下恒温培养60h；液体种子培养：将固体斜面培养得到的菌株取一接种环菌苔接入种子培养基中，在初始ph4.0、34℃、摇床转速200rpm条件下培养55h；种子罐培养：将摇瓶发酵后的种子液按照接种量12％的比例接入种子罐，34℃，罐压0.08mpa、风量0-3vvm、转速200-800rpm，通过不断增加转速和风量控制溶氧处于20％-30％，初始ph4.0，ph低于4.0时补氨控制ph4.0，当ph开始上升且高于4.5时将种子液移种至发酵罐，培养周期约50h；发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量10％的比例接入发酵罐，培养条件：34℃、罐压0.08mpa、风量0-3vvm、转速200-800rpm，通过不断增加转速和风量控制溶氧处于10％-20％，初始ph4.0，ph低于4.0时补氨控制ph4.0，发酵期间ph高于4.5时开始补料，补料控制ph4.5-4.7，发酵至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期约90-110h，发酵酶活达到82800u/ml至84600u/ml。有益效果：1.本发明通过对保藏号为cgmcc10789的黑曲霉菌株进行亚硝基胍诱变，选育了一株高产酸性蛋白酶的诱变菌株fsm-208063，并对诱变株fsm-208063发酵过程进行优化使其酶活达到82800u/ml至84600u/ml之间。2.诱变株fsm-208063发酵得到的酸性蛋白酶，酶的有效ph范围为1.0-5.5，酶的最适ph范围1.5-4.5，酶的最适反应ph值2.5。酶的有效温度范围为46℃-78℃，酶的最适温度范围50℃-74℃，酶的最适反应温度66℃。在80℃保温4h后剩余酶活在70％以上，具有良好的耐酸性和耐热性，可应用于酿酒、食品、饲料以及皮革加工等行业。附图说明：图1不同ph下的相对酶活；图2不同温度下的相对酶活；图380℃下保温0-6h后的相对酶活。具体实施方式：以下通过具体实施例对本发明做更详细的说明，具体实施案例仅为举例说明，不作为对本发明实施范围的限定。实施例1菌株的诱变选育每个诱变批次中，取诱变菌株的新鲜斜面100个，用约300ml灭菌的生理盐水洗脱菌体至大摇瓶中，加入玻璃珠在摇床中200rmp，30min，使菌体分散，离心收集菌体，以此作为出发菌的诱变用菌悬液。分别吸取20ml菌悬液于1个50ml的三角瓶中，在三角瓶中加入亚硝基胍并使其终浓度在10-30μg/ml，置于34℃摇床，200rpm，从加入亚硝基胍时开始计时，诱变的时间在30-40min，使致死率处于70-95％。诱变结束后，将诱变菌悬液置于50ml离心管中，使用高速冷冻离心机，设定温度4℃，10000rpm，离心3min，弃上清，立即用约1200ml预热至34℃的种子培养基清洗沉淀菌体4遍，最后将所有诱变液体种子培养基重新垂悬并定容至10-30ml，取100μl涂布于诱变种子筛选培养基上，34℃培养60h，长出单菌落后挑取菌落hc值(hc值＝水解圈直径/菌落直径)高的菌株。诱变用固体斜面培养基：蔗糖40g，酵母粉5g，蛋白胨2g，nah2po42g，mgso40.5g，cacl20.5g，kh2po44g，酪蛋白2g，琼脂15g，将上述各组分溶于1000ml水中，调节ph至4.0，121℃灭菌20min；诱变用液体种子培养基：酪蛋白10g，酵母粉3g，蛋白胨8g，蔗糖2g，nah2po42g，mgso40.5g，cacl20.5g，将上述各组分溶于1000ml水中，调节ph至4.0，121℃灭菌20min；诱变种子筛选培养基：酪蛋白30g，酵母粉3g，蛋白胨8g，蔗糖2g，nah2po42g，mgso40.5g，cacl20.5g，琼脂2.3％，将上述各组分溶于1000ml水中，调节ph至4.0，121℃灭菌20min；平板初筛：初筛方法：将诱变后长出的菌落点种在筛选平板上，34℃培养60h后，观察其周围透明圈大小，选取酪蛋白透明圈直径与菌落直径比值较大的菌落进行摇瓶复筛。摇瓶复筛：复筛方法：将诱变菌株接入发酵摇瓶进行发酵，34℃，300rpm，培养80h后以分光光度法测定各诱变株发酵酶活。摇瓶筛选培养基：玉米粉5％，玉米淀粉4％，大豆浓缩蛋白8％，氯化铵1％，k2hpo43％，kh2po45％，玉米浆5％，cacl21％，其余为水，调节ph至4.0，121-123℃灭菌30-40min；通过多次摇瓶复筛选出1株具有较高酶活的诱变株列表如下：菌株原始菌fsm-208063酶活(u/ml)1920835800高产菌株fsm-208063连续传代5次的摇瓶酶活水平如下：经上述验证，诱变得到的高产菌株fsm-208063具有很好的遗传稳定性，可用于大生产放大生产。实施例2液体发酵生产酸性蛋白酶固体斜面种子培养：将所述黑曲霉诱变株fsm-208063取一接种环菌苔接种于固体斜面，34℃下恒温培养60h；液体种子培养：将固体斜面培养得到的菌株取一接种环菌苔接入种子培养基中，在初始ph4.0、34℃、摇床转速200rpm条件下培养55h；种子罐培养：将摇瓶发酵后的种子液按照接种量12％的比例接入种子罐，34℃，罐压0.08mpa、风量0-3vvm、转速200-800rpm，通过不断增加转速和风量控制溶氧处于20％-30％，初始ph4.0，ph低于4.0时补氨控制ph4.0，当ph开始上升且高于4.5时将种子液移种至发酵罐，培养周期约50h；发酵罐培养：将种子罐中的种子液按照接种量10％的比例接入发酵罐，培养条件：34℃、罐压0.08mpa、风量0-3vvm、转速200-800rpm，通过不断增加转速和风量控制溶氧处于10％-20％，初始ph4.0，ph低于4.0时补氨控制ph4.0，发酵期间ph高于4.5时开始补料，补料控制ph4.5-4.7，发酵至酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期约90-110h。下表是100l发酵罐5批次的发酵产酶情况，平均产酶水平为83540u/ml。实施例3酸性蛋白酶的酶活测定方法(1)酶活单位定义：1ml液体酶在40℃，ph值为3.0的条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以u/ml计。(2)原理：蛋白酶在一定温度和ph条件下，水解酪素(哺乳类为幼子生长提供氮源的一种蛋白质)底物，产生含有酚基的氨基酸[如：酪氨酸(α-氨基-β-对羟苯基丙酸)，色氨酸(α氨基-β-吲哚基丙酸)等]，在碱性条件下，将福林试剂还原，生成鉬蓝和钨蓝，用分光光度计测定吸光度，计算其酶活力。(3)试剂和溶液福林试剂的制备：于2000ml磨口回流装置中加入钨酸钠(na2wo4·2h2o)100g，钼酸钠(na2moo4·2h2o)25g，水700ml，85％磷酸50ml，浓盐酸100ml，小火沸腾10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂(liso4)50g，水50ml和数滴浓溴水(99％)，再微沸15min，以除去多余的溴(冷后仍有绿色再加溴水，再微沸除去过量的溴)，冷却，加水定容至1000ml，混匀，过滤。制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶中。使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。碳酸钠溶液[c(na2co3)＝0.4mol/l]：取无水碳酸钠42.4g，用水溶解并定容至1000ml。三氯乙酸[c(ccl3·cooh)]＝0.4mol/l：取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000ml。氢氧化钠溶液[c＝0.5mol/l]：按gb601配制。盐酸溶液[c＝1mol/l及0.1mol/l]gb601：量取90ml盐酸，注入1000ml水中，摇匀，即得1mol/l盐酸。量取9ml盐酸，注入1000ml水中，摇匀，即得0.1mol/l盐酸。磷酸缓冲液(ph＝7.5)：称取磷酸氢二钠(na2hpo4·12h2o)6.02g和磷酸二氢钠(nah2po4·2h2o)0.5g，加水溶解并定容至1000ml，须用ph计校正。10g/l酪素(酪蛋白)溶液：称取酪素1.000g，精确至0.001g，用浓乳酸2～3滴湿润后，加入ph7.5的缓冲液约80ml，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100ml的容量瓶中，用缓冲液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期3天。l-酪氨酸标准溶液：a.称取预先于105℃干燥至恒重的l-酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/l盐酸60ml溶解后定容至100ml，即为1mg/ml酪氨酸标准溶液。b.吸取1mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml，用0.1mol/l盐酸定容至100ml，即得到100ug/ml-酪氨酸标准溶液。(4)仪器和设备恒温水浴锅：40±0.2℃分光光度计：应符合gb9721的规定(5)分析步骤标准曲线的绘制分别吸取100mg/mll－酪氨酸标准液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于10ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，制成每ml分别含l－酪氨酸0、10、20、30、40、50、60mg的稀标准液。各取上述溶液1.00ml(须做平行试验)于试管中，加入0.4mol/l碳酸钠溶液5.00ml，稀福林试剂1.00ml，置于40℃水浴中显色20min，取出用10mm比色皿，在波长660nm处用分光光度计分别测定其吸光度，其中不含酪氨酸的管为空白对照。以吸光度为纵坐标，相应的酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。当吸光度为1时的酪氨酸量(mg)即为比色常数k值。(6)待测酶液的制备比色测定：精确吸取待测酶液1.0ml(每个样品3支平行试管)，40℃水浴预热2min。同时取适量1％酪素溶液在40℃水浴预热3～5min，然后取其1.0ml，加入到经预热的上述酶液中，立即开始计时，于40℃水浴精确反应10min，立即加入2.0ml0.4mol/l三氯乙酸，摇匀，取出静置10min，过滤，取滤液1.0ml。加入0.4mol/l碳酸钠溶液5.0ml，以后按标准曲线绘制步骤测定样品吸光度。同时进行空白对照测定，其步骤为吸取待测酶液1.0ml，40℃水浴2min后加入2.0ml0.4mol/l三氯乙酸，40℃水浴10min，然后加入1％酪素溶液1.0ml，取出静置10min，过滤，取滤液1.0ml，以后步骤同于样品测定。(7)计算x＝(a×k×4×n)/(1×10)式中：x－样品的酶活力，u/ml；a－样品平行试验的平均吸光度；k－比色常数；4－反应试剂体积(ml)；n－样品稀释倍数；1－参与反应的酶液量，ml；10－反应时间，min实施例4酶的作用ph范围以本发明所产的酶活力80000u/ml的酸性蛋白酶为统一样品，在40℃条件下，分别在不同ph值(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.5)下，测定酶活力，测定的相对酶活力变化曲线如图1所示，酶的有效ph范围为1.0-5.5，酶的最适ph范围1.5-4.5，酶的最适反应ph值2.5。实施例5酶的作用温度范围以酶活力80000u/ml的酸性蛋白酶为统一样品，在ph值为4.0条件下，分别在不同温度(38、42、46、50、54、58、62、66、70、74、78、82、86)下，测定酶活力，测定的相对酶活力变化曲线如图2所示，酶的有效温度范围为46℃-78℃，酶的最适温度范围50℃-74℃，酶的最适反应温度66℃。实施例6酶的热稳定性以酶活力80000u/ml的酸性蛋白酶为统一样品，在ph值为4.0条件下，80℃下保温0-6h测定酶活力，如图3所示，80℃保温4h后存留酶活仍在70％以上(初始活力为100％)，具有良好的耐热保存活性。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。当前第1页12