抗claudin18.2单克隆抗体的制作方法

1.本发明属于基因工程领域，具体涉及一种与claudin18.2特异性结合的抗体及其片段。


背景技术：

2.胃和食管的癌症在恶性肿瘤的治疗中是非常难于治疗的恶性肿瘤。胃癌在全球癌症死亡中位列第三，是一种难治性肿瘤，可选择的靶向药物较少，靶向治疗的疗效也欠佳，而且每年约有100万病例被确诊。尽管外科手术和新化疗方案均取得了很大的进步，但是5年生存率大约只有5％-20％，晚期胃癌患者的中位总生存期(os)约为10个月。患有这种癌症的患者急需一种创新药物来满足癌症治疗的需求。因此，寻找更有效的方法来延长胃癌患者的生命迫在眉睫。
3.密蛋白(claudin)是上皮与内皮紧密连接内的整合膜蛋白(integral membrane protein)，是一个多基因家族。claudin蛋白在人体正常分化上皮性组织中表达定位于细胞膜，除了屏障结构形成的功能外，不同claudin表达具有组织特异性，表现出相应的功能特点。claudin蛋白在细胞中的正常表达是稳定细胞之间相互作用动态平衡的前提条件，在细胞中的异常表达可破坏上皮细胞及内皮细胞的结构，并导致其功能受损，从而有利于肿瘤的发生、发展。
4.claudin-18(cldn18)是一种在人类中由cldn18基因编码的蛋白质，属于细胞紧密连接蛋白家族，是整合跨膜蛋白(四次跨膜蛋白)，其具有四个跨膜疏水区和两个细胞外环，其n末端和c末端均位于胞浆内，两个细胞外环使其成为理想的抗体靶点，可以控制层细胞之间的分子流动。claudin18是位于上皮和内皮紧密连接中的整合膜蛋白，紧密连接在相邻细胞之间组织起颗粒互联的网，在紧密连接中，闭合蛋白和密蛋白是主要的跨膜蛋白组分，由于其强的细胞间粘附特性，他们产生了防止和控制溶质的细胞旁转运并限制膜脂和蛋白质侧向扩散以维持细胞极性的主要屏障，形成紧密连接的蛋白质关键性的参与了组织上皮组织结构，这些蛋白质在构造良好的上皮中几乎无法接近抗体，但在肿瘤细胞中开始暴露出来。
5.claudin-18具有两个剪接变体，分别为claudin18.1和claudin18.2，两者在包含第一个跨膜(tm)区和环1的n端部分中存在八个氨基酸的差异，而c端的蛋白质一级序列相同。claudin18.1和claudin18.2的表达分布有所不同，claudin18.1在正常肺的细胞中选择性表达，claudin18.2在正常细胞中表达高度受限，但在多种肿瘤(胃癌、肺癌和胰腺癌等)中频繁异位激活和过表达。
6.claudin18.2(cldn18.2)是一种胃特异性膜蛋白，包含4个跨膜结构域和两个小细胞外环(环1被疏水区1和疏水区2包围，环2被疏水区3和疏水区4包围)，是高选择性胃谱系抗原，仅在短寿命的分化胃上皮细胞上表达，并且无法在正常人任何其他组织中检出，该抗原在包括胃食管癌和胰腺癌的多种人癌症中以显著水平异位表达(sahin.u等，clin cancer res，2008.14(23)：第7624-34页)。claudin18.2蛋白在胃癌的淋巴结转移和远处转
移中被频繁检出，被认为是胃癌和其他癌症类型的潜在治疗靶点，此靶点的发现也为胃癌的治疗提供了一种新的选择。cldn18.2在癌细胞和正常细胞之间的差异表达、其膜定位、其在大多数毒性相关正常组织中不存在、其在胃中的表达局限在可通过胃的靶阴性干细胞来补充的非必要的细胞群体-已分化的胃细胞，使得cldn18.2成为癌症免疫治疗的有吸引力的靶标，并且在癌症治疗中使用靶向cldn18.2的基于抗体的治疗剂(therapeutics)使高水平的特异性治疗成为可能。
7.简单从细胞粘合机理看阻断claudin似乎会打碎细胞联合、加速肿瘤转移，也确实有研究显示阻断某些claudin会加速肿瘤转移。但是因为claudin18.2只在肿瘤细胞表达，所以可以比较安全地用抗体诱导细胞杀伤，制备针对claudin18.2的抗体，而不和claudin18.1结合，可以特异性的阻断肿瘤的claudin18.2的通路，具有广泛的应用。
8.claudin18蛋白为4次跨膜蛋白，有claudin18.1和claudin18.2两个亚型，区别仅在其n端69个氨基酸，其余氨基酸完全一样，第7-27位氨基酸还是跨膜区，制备只针对claudin18.2的抗体，选择1-39位氨基酸为最好的选择。
9.imab362是首个靶向claudin18.2的嵌合型单克隆抗体，通过免疫效应机制激活介导特异性cldn18.2-阳性癌症细胞的杀伤。imab362是德国加尼梅德药物有限公司开发的针对claudin18.2的特异性的igg1亚型单克隆抗体，高特异性的作用于claudin18.2的第一个细胞外结构域，并且不与包括claudin18.1在内的其它蛋白结合。
10.2016年6月3-7日，一年一度的acso会议上也公布了其ii期临床结果，对于晚期胃癌患者来说，当将这种新型，首创抗体imab362添加到标准化疗时，该药可以显著延长中位生存期，而且在预治疗胃癌患者中安全且可耐受。
11.在美国波士顿举行的car-tcr峰会上，car-t细胞免疫疗法研发企业科济生物公布了其在研car-claudin18.2 t细胞治疗胃癌/胰腺癌的临床数据。截止2018年8月31日，共入组并治疗了12例胃癌和胰腺癌晚期患者，入组时多名患者已有发生多器官转移；经过治疗，car-t细胞在这些患者体内耐受良好；经过一段时间剂量和给药方式等摸索后，在最后采用优化给药方式的亚组，6名患者中有5名达到了客观缓解。其临床前数据也表明靶向claudin18.2的car-t细胞在小鼠模型中可以完全清除胃肿瘤，且没有发生脱靶毒性。
12.专利cn109762067公布了一种结合人claudin18.2的抗体，该抗体能特异性的结合claudin18.2而不和claudin18.1结合，该抗体是通过噬菌体展示技术获得的，后期的蛋白成药性，蛋白稳定性方面有待探究。
13.wo2009/053041公布了ganymed公司开发的claudin18.2 igg1抗体，在治疗治疗胃食道癌晚期的1期和2期临床实验中表现出很好的效果。
14.目前对于胃癌，食道癌，胰腺癌等治愈非常差的肿瘤，急需开发一款合适的抗体，解决这个难题，本领域中仍然需要靶向claudin18.2、并作为该靶点激动剂的新型免疫治疗剂，调控细胞膜性质，控制物质交换，激活adcc，从而提供更好的抗癌特性；仍需要新的抗cldn18.2抗体，为治疗提供新的思路。我们针对clauidn18.2靶点进行开发，制备了多种抗体，只针对claudin18.2，而和claudin18.1不反应。


技术实现要素：

15.本发明涉及一种分离的单克隆抗体，与人的claudin18.2和猴的claudin18.2特异
性结合的鼠源、嵌合或人源化的单克隆抗体，与现有技术相比，具有更高的adcc和cdc活性；和与claudin18.2的稳定结合亲和力以及良好的体内抗肿瘤活性。
16.本发明的claudin18.2抗体可用于claudin18.2靶点相关的试剂盒开发，实现疾病诊断或预防claudin18.2相关疾病，还可用于肿瘤疫苗的开发等。
17.本发明的第一个方面，是提供一种与cldn18.2结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含选自氨基酸序列seq id no：1-9或其变体的重链cdr；所述轻链可变区包含选自氨基酸序列seq id no：10-17或其变体的轻链cdr。
18.在一些实施方案中，本发明提供一种与cldn18.2结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含hcdr1、hcdr2和hcdr3氨基酸序列；所述轻链可变区包含lcdr1、lcdr2和lcdr3氨基酸序列。
19.在一些实施方案中，所述重链可变区hcdr1序列包含选自seq id no：1，4或7及其保守修饰的氨基酸序列；所述重链可变区hcdr2序列包含选自seq id no：2，5或8及其保守修饰的氨基酸序列；所述重链可变区hcdr3序列包含选自seq id no：3，6或9及其保守修饰的氨基酸序列。
20.在一些实施方案中，所述轻链可变区lcdr1序列包含选自seq id no：10，13或16及其保守修饰的氨基酸序列；所述轻链可变区lcdr2序列包含选自seq id no：11或14及其保守修饰的氨基酸序列；所述轻链可变区lcdr3序列包含选自seq id no：12，15或17及其保守修饰的氨基酸序列。
21.在一些实施方案中，本发明提供一种与cldn18.2结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区，其中，所述重链可变区包含选自下组的hcdr1、hcdr2和hcdr3：
22.(1)seq id no：1所示的hcdr1、seq id no：2所示的hcdr2和seq id no：3所示的hcdr3和/或
23.(2)seq id no：4所示的hcdr1、seq id no：5所示的hcdr2和seq id no：6所示的hcdr3和/或
24.(3)seq id no：7所示的hcdr1、seq id no：8所示的hcdr2和seq id no：9所示的hcdr3；
25.所述轻链可变区选自下组的lcdr1、lcdr2和lcdr3：
26.(4)seq id no：10所示的lcdr1、seq id no：11所示的lcdr2和seq id no：
27.12所示的lcdr3和/或
28.(5)seq id no：13所示的lcdr1、seq id no：14所示的lcdr2和seq id no：
29.15所示的lcdr3和/或
30.(6)seq id no：16所示的lcdr1、seq id no：11所示的lcdr2和seq id no：
31.17所示的lcdr3。
32.优选地，所述重链可变区hcdr1序列包含选自seq id no：1及其保守修饰的氨基酸序列；所述重链可变区hcdr2序列包含选自seq id no：2及其保守修饰的氨基酸序列；所述重链可变区hcdr3序列包含选自seq id no：3及其保守修饰的氨基酸序列；所述轻链可变区lcdr1序列包含选自seq id no：10及其保守修饰的氨基酸序列；所述轻链可变区lcdr2序列
包含选自seq id no：11及其保守修饰的氨基酸序列；所述轻链可变区lcdr3序列包含选自seq id no：12及其保守修饰的氨基酸序列；和/或
33.优选地，所述重链可变区hcdr1序列包含选自seq id no：4及其保守修饰的氨基酸序列；所述重链可变区hcdr2序列包含选自seq id no：5及其保守修饰的氨基酸序列；所述重链可变区hcdr3序列包含选自seq id no：6及其保守修饰的氨基酸序列；所述轻链可变区lcdr1序列包含选自seq id no：13及其保守修饰的氨基酸序列；所述轻链可变区lcdr2序列包含选自seq id no：14及其保守修饰的氨基酸序列；所述轻链可变区lcdr3序列包含选自seq id no：15及其保守修饰的氨基酸序列；和/或
34.优选地，所述重链可变区hcdr1序列包含选自seq id no：7及其保守修饰的氨基酸序列；所述重链可变区hcdr2序列包含选自seq id no：8及其保守修饰的氨基酸序列；所述重链可变区hcdr3序列包含选自seq id no：9及其保守修饰的氨基酸序列；所述轻链可变区lcdr1序列包含选自seq id no：16及其保守修饰的氨基酸序列；所述轻链可变区lcdr2序列包含选自seq id no：11及其保守修饰的氨基酸序列；所述轻链可变区lcdr3序列包含选自seq id no：17及其保守修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供一种与cldn18.2结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区，其中，所述重链可变区包含与选自seq id no：18、19或20至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列；和/或所述轻链可变区包含与选自seq id no：21、22或23至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
35.在一些实施方案中，本发明提供一种与cldn18.2结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区，其中，所述重链可变区包含选自seq id no：18、19或20的氨基酸序列；和/或所述轻链可变区包含选自seq id no：21、22或23的氨基酸序列。
36.在一些实施方案中，本发明的抗体包括这样的抗体，其包含选自以下可能性(i)至(iii)的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的组合：
37.(i)包含seq id no：18所示氨基酸序列或其片段的vh以及包含seq id no：21所示氨基酸序列或其片段的vl，
38.(ii)包含seq id no：19所示氨基酸序列或其片段的vh以及包含seq id no：22所示氨基酸序列或其片段的vl，
39.(iii)包含seq id no：20所示氨基酸序列或其片段的vh以及包含seq id no：23所示氨基酸序列或其片段的vl。
40.本发明第二个方面，是提供编码一种与cldn18.2结合的单克隆抗体或其抗原结合部分氨基酸序列的核苷酸序列。
41.在一些实施方案中，seq id no：18所示vh氨基酸序列可由包含seq id no：24所示核酸序列的核酸编码；seq id no：19所示vh氨基酸序列可由包含seq id no：25所示核酸序列的核酸编码；seq idno：20所示vh氨基酸序列可由包含seq id no：26所示核酸序列的核酸编码。
42.在一些实施方案中，seq id no：21所示vl氨基酸序列可由包含seq id no：27所示核酸序列的核酸编码；seq id no：22所示vl氨基酸序列可由包含seq id no：28所示核酸序列的核酸编码；seq id no：23所示vl氨基酸序列可由包含seq id no：29所示核酸序列的核
id no：15及其保守修饰的氨基酸序列；和/或
56.所述重链可变区hcdr1序列包含选自seq id no：7及其保守修饰的氨基酸序列；所述重链可变区hcdr2序列包含选自seq id no：8及其保守修饰的氨基酸序列；所述重链可变区hcdr3序列包含选自seq id no：9及其保守修饰的氨基酸序列；所述轻链可变区lcdr1序列包含选自seq id no：33及其保守修饰的氨基酸序列；所述轻链可变区lcdr2序列包含选自seq id no：11及其保守修饰的氨基酸序列；所述轻链可变区lcdr3序列包含选自seq id no：17及其保守修饰的氨基酸序列。
57.在一些实施方案中，本发明提供一种与cldn18.2结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区，其中，所述重链可变区包含与选自seq id no：34、35或36至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列；和/或所述轻链可变区包含与选自seq id no：37、38或39至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
58.在一些实施方案中，本发明提供一种与cldn18.2结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和/或轻链可变区，其中，所述重链可变区包含选自seq id no：34、35或36的氨基酸序列；和/或所述轻链可变区包含选自seq id no：37、38或39的氨基酸序列。
59.在一些实施方案中，本发明的抗体包括这样的抗体，其包含选自以下可能性(i)至(iii)的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的组合：
60.(i)包含seq id no：34所示氨基酸序列或其片段的vh以及包含seq id no：37所示氨基酸序列或其片段的vl，或包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
61.(ii)包含seq id no：35所示氨基酸序列或其片段的vh以及包含seq id no：38所示氨基酸序列或其片段的vl，或包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
62.(iii)包含seq id no：36所示氨基酸序列或其片段的vh以及包含seq id no：39所示氨基酸序列或其片段的vl，或包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
63.根据本发明的一个方面，所述一种与cldn18.2结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链和/或轻链，该重链包含重链可变区和重链恒定区，轻链包含轻链可变区和轻链恒定区。其中，重链可变区和轻链可变区含有上述的氨基酸序列，重链恒定区包含seq id no：40所示的氨基酸序列，轻链恒定区包含seq id no：41所示的氨基酸序列；或包含与这些序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
64.在一些实施方案中，一种与cldn18.2结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链和/或轻链，其中，所述重链与选自seq id no：42-44所示氨基酸80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列；和/或所述轻链包含与选自seq id no：45-47的氨基酸至少80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
65.在一些实施方案中，本发明提供一种与cldn18.2结合的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含具有seq id no：42的氨基酸序列的重链，和具有seq id no：45的氨基酸序列的轻链；和/或
66.具有seq id no：43的氨基酸序列的重链，和具有seq id no：46的氨基酸序列的轻链；和/或
67.具有seq id no：44的氨基酸序列的重链，和具有seq id no：47的氨基酸序列的轻链。
68.在一些实施方案中，所述抗体为全抗体、fab片段、f(ab’)2片段或单链fv片段(scfv)。
69.在一些实施方案中，所述重链包含重链可变区和重链恒定区，所述轻链包含轻链可变区和轻链恒定区。
70.在一些实施方案中，所述抗体还包含选自igg1亚型、igg2亚型或igg4亚型的重链恒定区和/或包含选自κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区；
71.在一些实施方案中，本发明所述抗体人源化改造所用骨架为igg1。
72.本发明的第四个方面，是提供一种表达载体，该表达载体包含编码本发明单克隆抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。
73.本发明的第五个方面，是提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含上述表达载体。宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，在一个较佳的实例中，该宿主细胞是hek293细胞。
74.本发明的第六个方面，是提供一种抗原，由包含seqid no：48所示的氨基酸序列组成的肽、或免疫等效肽、或表达所述肽的核酸或宿主细胞。
75.在一些实施方案中，本发明提供一种抗原，包括在一定条件下培养包含编码单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，并进行质粒的大量制备，得到基因免疫的dna子弹。
76.在一些实施方案中，本发明提供一种抗原，包括在一定条件下培养包含编码单克隆抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，并进行质粒的大量制备，然后转染细胞，获得高表达claudin18.2细胞。
77.本发明的第七个方面，是提供三种杂交瘤细胞株。以基因免疫、动物细胞免疫和/或蛋白免疫小鼠后获得的分泌claudin18.2单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株，名称为anti-claudin18.2-110e2a4、anti-claudin18.2-202e2c3和anti-claudin18.2-254h4e11。
78.所述的anti-claudin18.2-110e2a4杂交瘤细胞株是保藏号为cgmcc no：21913的细胞株，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2021年03月25日，分类命名：小鼠杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株对应本发明实施例中名称为110e2a4的杂交瘤细胞株。
79.所述的anti-claudin18.2-202e2c3杂交瘤细胞株是保藏号为cgmcc no：21914的细胞株，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2021年03月25日，分类命名：小鼠杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株对应本发明实施例中名称为202e2c3的杂交瘤细胞株。
80.所述的anti-claudin18.2-254h4e11杂交瘤细胞株是保藏号为cgmcc no：21915的细胞株，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2021年03月25日，分
类命名：小鼠杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株对应本发明实施例中名称为254h4e11的杂交瘤细胞株。
81.本发明的第八个方面，是提供一种制备claudin18.2抗体的方法，包括在一定条件下以本发明提供的抗原免疫小鼠后，获得小鼠脾细胞；采用细胞融合技术制备杂交瘤细胞株，筛选能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
82.本发明的第九个方面，是提供一种药物组合物，其包含本发明分离的单克隆抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的盐。
83.本发明的第十个方面，是提供所述的一种与cldn18.2结合的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗和/或预防与表达cld18.2的细胞相关的疾病药物的用途。所述与表达cld18.2的细胞相关的疾病包括肿瘤相关疾病，如胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌例如非小细胞肺癌(nsclc)、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌及其转移，特别是胃癌转移例如库肯勃氏瘤、腹膜转移和淋巴结转移。
84.本发明的抗体或抗原结合片段可与其他部分(例如可检测标记物)相偶联，即共价连接或非共价连接。
85.本发明的第十一个方面，是提供一种癌症治疗方案，包括同化疗药物奥沙利铂、紫杉醇、5-fu等联用，增强其抗肿瘤效果。本发明的抗体可以同opdivo kertruda等抗体药物联用，增加其抗肿瘤效果。
86.本发明的有益效果：本发明的抗体或其抗原结合部分，是与人的claudin18.2特异性结合的鼠源抗体、嵌合抗体和人源化抗体，具有较强的adcc和cdc活性，以高亲和力特异性结合claudin18.2，只针对claudin18.2，而和claudin18.1不反应，并具有良好的体内抗肿瘤效果。
附图说明
87.图1：小鼠杂交瘤抗体110e2的流式细胞筛选
88.图2：小鼠杂交瘤抗体202e2的流式细胞筛选
89.图3：小鼠杂交瘤抗体254h4的流式细胞筛选
90.图4：阳性对照抗体imab362的流式细胞筛选1
91.图5：pbs的流式细胞筛选1
92.图6：小鼠igg同型对照的流式细胞筛选1
93.图7：小鼠单克隆抗体110e2a4的流式细胞筛选
94.图8：小鼠单克隆抗体202e2c3的流式细胞筛选
95.图9：小鼠单克隆抗体254h4e11的流式细胞筛选
96.图10：阳性对照抗体imab362的流式细胞筛选2
97.图11：pbs的流式细胞筛选2
98.图12：小鼠igg同型对照的流式细胞筛选2
99.图13：facs实验检测小鼠单克隆抗体110e2a4、202e2c3和254h4e11与hek293/human-18.2的结合曲线图
100.图14：facs实验检测人源化抗体与hek293/human-18.2的结合曲线图
101.图15：报告基因法测定人源化抗体的adcc活性的曲线图
conjugated affinipure donkey anti-human igg,fcr fragment specific，终浓度：3μg/ml，每孔100μl，4度摇床孵育40分钟后，用pbs离心洗涤2次。将制备好的样品使用流式细胞仪上机检测，选取与hek293/human-claudin18.2特异性结合且平均荧光强度mfi值大于背景值10倍的作为阳性结果。检测结果见表1，基因免疫后血清抗体最佳小鼠为ad854；细胞免疫后血清抗体最佳小鼠为ad856；蛋白免疫后血清抗体最佳小鼠为ad863，分别选取这三只小鼠进行细胞融合。
115.表1 facs检测血清抗体结果
[0116][0117][0118]
实施例2细胞融合
[0119]
2.1脾细胞的准备
[0120]
断颈猝死免疫小鼠，于75％酒精浸泡3-4分钟。取出脾脏，放入有细胞滤网的培养皿中，加入少许不含血清的1640培养基，用注射器内芯将其碾碎，直至没有组织结块，细胞均匀为止，将细胞悬液转移至50ml离心管中。转速1000rpm，离心5min，弃上清，加入20ml红细胞裂解液，室温放置3min。用细胞滤网将细胞悬液过滤至50ml离心管中。转速1000rpm，离心5min，弃上清，悬浮于20ml不含血清的1640培养基中，计数备用。
[0121]
2.2 sp2/0准备
[0122]
用无菌吸管将培养的sp2/0细胞吹打均匀，转移至50ml离心管中，转速1000rmp离
心5min，吸去上清液。用20ml不含血清的1640培养基悬浮sp2/0细胞，1000rmp，离心5min，弃上清。悬浮于20ml不含血清的1640培养基中。计数备用。
[0123]
2.3电融合操作
[0124]
脾细胞：sp2/0＝2：1的比例混合两种细胞。每1ml悬液加入20μl胰酶(25mg/ml)消化2min。加入20ml不含血清的1640培养基，1000rpm，离心5min，弃上清(如出现细胞团块，加入不含血清的1640培养基重悬细胞后过滤一遍)。以转速1000rpm，离心5min的条件，加入20ml细胞融合液洗涤细胞三次。细胞沉淀以1
×
107个/ml的密度悬浮于电融合液中。加2ml细胞悬液于融合池中，30秒内按如下表2所示条件进行电融合。
[0125]
表2融合参数
[0126]
ac40-60v，30sdc1000-1900v，40μs，3
×
post ac4-6v，3s
[0127]
2.4融合后处理
[0128]
电融合后轻轻的将融合细胞转移至37℃预热的条件培养基中，室温继续放置60min。100μl/孔，将细胞按104个/孔接种入96孔板。次日每孔补加100μl的2
×
hat完全培养液。于融合后第四天用1
×
hat完全培养液半量换液一次。于融合后第七天用1
×
hat完全培养液全量换液一次。于融合后第九天取样流式细胞筛选检测。挑出阳性孔于24孔板中扩大培养。
[0129]
实施例3融合后细胞的流式筛选
[0130]
3.1制备细胞悬液
[0131]
阳性细胞hek293/human-claudin18.2(参照1.2方法制备)；阴性细胞hek293/human-claudin18.1(参照1.2方法制备，claudin18.1的氨基酸序列如seq id no：50所示，核苷酸序列如seq id no：51所示。)，空白细胞hek293。用pbs重悬细胞，调整细胞浓度，使每孔细胞数量为2.5
×
105个。
[0132]
3.2一抗孵育
[0133]
在96孔板中加入50μl待检克隆上清或者终浓度10μg/ml的阳性对照imab362、阴性对照pbs、终浓度3μg/ml的同型对照mouse igg及50μl制备好的细胞悬液，4℃摇床孵育50min，一抗孵育结束后，向96孔板中加入150μl冷的pbs，用枪头吹打混匀，将96孔板放入板式离心机中配平，转速2000rpm离心3min后用排枪小心吸去上清，再次向96孔板中加入150μl冷的pbs，用枪头吹打混匀，将96孔板放入板式离心机中配平，转速2000rpm离心3min后用排枪小心吸去上清。
[0134]
3.3二抗孵育
[0135]
根据一抗种属，加入相应的荧光二抗alexa fluor647标记goat anti-mouse igg(h+l)，和alexa fluor 488标记donkey anti-human igg，每孔80μl，4℃摇床孵育40分钟，二抗孵育结束后，向96孔板中加入150μl冷的pbs，用枪头吹打混匀，将96孔板放入板式离心机中配平，转速2000rpm离心3min后用排枪小心吸去上清，再次向96孔板中加入150μl冷的pbs，用枪头吹打混匀，将96孔板放入板式离心机中配平，转速2000rpm离心3min后用排枪小心吸去上清。
[0136]
3.4上机检测
[0137]
将制备好的样品使用流式细胞仪(ique或者calibur)上机检测，并使用flowjo软件进行数据分析，结果如图1-图6所示。
[0138]
图1-图6中线条
①
代表样品与hek293/human-claudin18.1细胞的结合强度；线条
②
代表样品与hek293/human-claudin18.2细胞的结合强度，线条
③
代表样品与空细胞hek293的结合强度。选取与表达人claudin18.2的hek293细胞特异性结合而不与表达人claudin18.1结合且与hek293/human-claudin18.2结合强度优于或者相当于阳性抗体imab362的克隆作为阳性克隆。结果显示：110e2克隆，202e2克隆，254h4克隆和阳性抗体imab362同hek293/human-claudin18.2细胞有良好的结合，结合荧光值分别为1131、3833、678和558，且同hek293/human-claudin18.1细胞、hek293细胞不结合。选取110e2克隆，202e2克隆，254h4克隆进行培养冻存与亚克隆。
[0139]
实施例4杂交瘤细胞亚克隆后筛选
[0140]
110e2克隆，202e2克隆，254h4克隆分别按照0.5个每孔进行有限稀释法单克隆化培养，培养七天后取上清分别与hek293/mouse-claudin18.2细胞、hek293/human-claudin18.2细胞、hek293/human-claudin18.1细胞以及hek293细胞进行facs检测，具体操作参见实施例3。结果如图7-图12所示，线条
①
代表样品与hek293/mouse-claudin18.2细胞的结合强度；线条
②
代表样品与hek293/human-claudin18.1细胞的结合强度；线条
③
代表样品与hek293/human-claudin18.2的结合强度；线条
④
代表样品与空细胞hek293的结合强度。筛选得到anti-claudin18.2-110e2a4和anti-claudin18.2-202e2c3、anti-claudin18.2-254h4e11杂交瘤上清同hek293/human-claudin18.2细胞、hek293/mouse-claudin18.2都有良好的结合，且结合强度均优于阳性对照抗体imab362，而小鼠igg同型对照抗体和阴性对照pbs同以上细胞均无结合。
[0141]
实施例5杂交瘤抗体的纯化
[0142]
将细胞培养在装有20ml完全培养基的平皿中，放入co2培养箱中培养。观察细胞状态，待细胞增殖到底面积60％以上，按照细胞接种密度4
×
106个细胞/摇瓶，每个摇瓶用培养基补齐至75ml。接种摇瓶10天后收集摇瓶上清，进行纯化。
[0143]
每升细胞上清中加入6.06g tris以及87.66g nacl，摇晃转瓶至粉末充分溶解，使终溶液环境达到和上样缓冲液一样(0.05m tris，1.5m nacl)。样品倒入离心瓶中配平，高速冷冻离心机8000rpm离心30min，使用滤器过滤上清。
[0144]
细胞上清连接层析柱，重力的作用下以3滴/秒的速度进样。连接核酸蛋白检测仪用上样缓冲液洗杂蛋白，使od值在0.5a时为0或数值稳定，核酸蛋白检测仪调t至100，调a至0。使用洗脱缓冲液洗脱，待核酸蛋白检测仪的0.5a数值上升到10，开始用50ml离心管收集洗脱下来的洗脱液，并记录最高值，在示数降至10停止收集，每毫升抗体加50μl中和buffer，用ph试纸测试是否接近中性ph 6-8左右。
[0145]
将50ml离心管收集下来的洗脱液透析至100倍以上体积的10mm pbs中(确保透析时间：室温18-25℃2h以上，2-8℃4h以上)，换液一次并在4℃10mm pbs透析过夜。用5个以上层析柱体积的上样buffer上样，收柱。取透析袋将抗体存放于50ml离心管中，记录体积，分装检测小样于ep管中，测定蛋白浓度。
[0146]
实施例6 facs方法测定抗体亲和力
[0147]
制备细胞悬液：hek293/human-claudin18.2，用pbs重悬细胞，调整细胞浓度，使每
孔细胞数量为1
×
105个。
[0148]
一抗孵育：分别将纯化的杂交瘤抗体(300nm)、阳性对照imab362抗体(1μg/ml)及小鼠igg对照抗体(1μg/ml)加入到96孔板首孔中，其余11孔做3倍梯度稀释。再将制备好的细胞悬液加入对应的96孔板中(50μl/孔)，4度摇床孵育50分钟后，用pbs离心洗涤2次。
[0149]
二抗孵育：根据一抗种属，加入相应的荧光二抗，goat anti-mouse igg(h+l)ifluor647(genscript,3μg/ml)，alexa fluor 647conjugated affinipure goat anti-human igg,fcr fragment specific，3μg/ml，每孔100μl，4度摇床孵育40分钟后，用pbs离心洗涤2次。
[0150]
上机检测：将制备好的样品使用流式细胞仪上机检测。并通过facs bd calibur读取信号。通过prism tm(graphpad软件，san diego，ca)使用非线性回归来分析数据，并且计算ec50值。
[0151]
实验结果如图13和表3所示，抗体110e2a4、202e2c3和254h4e11与hek293/human-claudin18.2的结合ec50值与对照抗体imab362相当，但最高结合强度远高于对照抗体。
[0152]
表3抗体在hek293/human-claudin18.2细胞上的结合
[0153][0154]
实施例7抗体测序
[0155]
抗体亚型鉴定：取杂交瘤细胞培养上清液，采用isostriptm小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定抗体亚型。根据亚型鉴定结果，设计特异性的巢式pcr引物，该扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区和恒定区互补。pcr扩增产物直接进行ta克隆，将ta克隆的产物直接进行测序，并利用kabat编号规则划分抗体可变区的cdr和fr。抗体重链cdr序列、轻链cdr以及抗体重链和轻链可变区氨基酸序列如seq id no：1～23所示，核苷酸序列如seq id no：24～29所示，并列表于表4、表5中。
[0156]
表4单克隆抗体cdr序列
[0157]
抗体名称110e2a4202e2c3254h4e11hcdr1seq id no：1seq id no：4seq id no：7hcdr2seq id no：2seq id no：5seq id no：8hcdr3seq id no：3seq id no：6seq id no：9lcdr1seq id no：10seq id no：13seq id no：16lcdr2seq id no：11seq id no：14seq id no：11lcdr3seq id no：12seq id no：15seq id no：17
[0158]
表5单克隆抗体可变区序列
[0159][0160]
实施例8抗体人源化
[0161]
根据测序的结果，对110e2a4和202e2c3、254h4e11抗体参见美国专利4816567、5225539、5530101、5585089、5693762和6180370进行人源化改造，通过将cdr移植到人种系框架上使抗claudin18.2抗体人源化。具体方法如下，为筛选用于人源化嵌合抗体的受体骨架，将这些嵌合抗体的轻链和重链可变区序列与ncbi人免疫球蛋白基因数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)进行比对，以确定同源度高的人种系igvh和igvk，作为人源化的受体，对于上述3个抗体，所选择的人轻链种系受体序列均为igkv4-1*01；110e2a4重链的种系受体序列为ighv1-2*02，202e2c3重链的种系受体序列为ighv1-2*05，254h4e11重链的种系受体序列为ighv1-46*01。
[0162]
另外，对抗体cdr区进行了翻译后修饰，对可能影响抗体稳定性和结合活性的位点进行回复突变。110e2a4、202e2c3和254h4e11人源化后分别命名为110e2a4-vh1+vl1t、202e2c3-vh4t+vl2t和254h4e11-vh6+vl1t。
[0163]
上述人源化抗体110e2a4-vh1+vl1t、202e2c3-vh4t+vl2t、254h4e11-vh6+vl1t的可变区cdr以及重链可变区和轻链可变区氨基酸序列如表6、表7所示。
[0164]
表6人源化抗体cdr序列
[0165][0166]
表7人源化抗体重链可变区与轻链可变区氨基酸序列
[0167]
[0168]
示例性的，抗体重链与轻链氨基酸序列如下：
[0169]
表8人源化抗体重链与轻链氨基酸序列
[0170][0171]
实施例9人源化抗体的表达和纯化
[0172]
9.1质粒制备
[0173]
通过本领域技术人员已知的标准方法，设计合成目的基因片段，序列构建如下：leader sequence-目的抗体可变区-人igg1恒定区。将目的基因片段亚克隆到pcdna3.4表达载体中。制备转染级别的表达质粒，采用axygen的质粒大量提取试剂盒进行质粒的大量提取。分装至1.5ml离心管中，标记，-20℃或-80℃入库保存。
[0174]
9.2细胞培养及转染
[0175]
在无血清培养基中培养expi293f
tm
细胞(thermo fisher scientific)，将细胞接种在摇瓶(corning inc.)中，并在37℃，8％co2的环境中置于摇床(vwr scientific)上培养。质粒转染前一天，调整细胞密度。转染当天，dna和expifectamine
tm
293试剂按照合适的比例混合，并添加进细胞培养摇瓶中。转染16-18小时后，添加expifectamine
tm
293transfection enhancer 1and expifectamine
tm
293transfection enhancer 2。细胞培养6天收集上清用于纯化。
[0176]
9.3抗体纯化
[0177]
离心细胞培养上清，并过滤。将过滤后的上清上样到亲和力纯化柱，并调节流速。经过洗杂，洗脱后，对分步收集的洗脱液进行缓冲液置换。对最终的纯化抗体110e2a4-vh1+vl1t、202e2c3-vh4t+vl2t和254h4e11-vh6+vl1t进行sds-page纯度分析和a280浓度测定。
[0178]
实施例10人源化抗体的facs结合测定
[0179]
制备细胞悬液：hek293/human-claudin18.2，用pbs重悬细胞，调整细胞浓度，使每孔细胞数量为1
×
105个。
[0180]
一抗孵育：分别将纯化的人源化抗体、阳性对照imab362抗体及小鼠igg对照抗体和pbs加入到96孔板首孔中，其余11孔做3倍梯度稀释。再将制备好的细胞悬液加入对应的96孔板中(50μl/孔)，4度摇床孵育50分钟后，用pbs离心洗涤2次。
[0181]
二抗孵育：加入相应的荧光二抗，alexa fluor 647conjugated affinipure goat anti-human igg,fcr fragment specific，3μg/ml，每孔100μl，4度摇床孵育40分钟后，用pbs离心洗涤2次。
[0182]
上机检测：将制备好的样品使用流式细胞仪上机检测。并通过facs bd calibur读取信号。通过prism tm(graphpad软件，san diego，ca)使用非线性回归来分析数据，并且计算ec50值，同样的方法检测与hek293/human-claudin18.1、hek293空细胞的结合，结果如图14和表9所示。由结果可知，人源化抗体110e2a4-vh1+vl1t、202e2c3-vh4t+vl2t和254h4e11-vh6+vl1t同hek293/human-claudin18.2细胞的结合ec50与imab362抗体相当，但是最大细胞结合强度要远优于imab362。三个人源化抗体110e2a4-vh1+vl1t、202e2c3-vh4t
+vl2t和254h4e11-vh6+vl1t同hek293/human-claudin18.1和hek293空细胞均不结合。
[0183]
表9人源化抗体结合活性
[0184][0185]
实施例11报告基因法测定抗体的adcc活性
[0186]
adcc效应是一种细胞调节的免疫反应，adcc报告基因生物测定是使用稳定表达fcγriiia，v158(高亲和力)变异体和nfat反应元件驱动萤火虫荧光素酶的工程化jurkat细胞受体作为效应细胞，抗体fab片段和fc片段分别与靶细胞上的相应抗原表位以及效应细胞的fc受体相结合后，效应细胞被引导至靶细胞附近并激活nfat通路，产生的荧光信号。最终以读取的荧光信号的强弱作为引发细胞毒性作用强弱的标准。
[0187]
具体实验步骤如下所示：
[0188]
(1)靶细胞(hek293/human-claudin18.2细胞)处理：收集细胞转移至新无菌离心管中离心，条件为800rpm，3min。弃上清，用5ml含10％fbs的f12k培养基重悬细胞并计数后，将细胞密度调整为1
×
105cells/ml，每孔100μl加入到96孔板中，边缘孔用dpbs封边，防止边缘效应。把培养板置于37℃(
±
2℃)，5％(
±
1％)co2培养箱中培养，培养过夜。
[0189]
(2)效应细胞gs-j2/cd16a用1640完全培养基于37℃/5％co2的细胞培养箱中进行培养。收集细胞转移至新无菌离心管中离心，条件为800rpm，3min。弃上清，用5ml含4％fbs的1640培养基重悬细胞并计数后，将细胞密度调整为1.2
×
106cells/ml，弃掉原培养板中的培养基，每孔加入50μl效应细胞，边缘孔用dpbs封边，防止边缘效应。
[0190]
(3)配制待测样品110e2a4-vh1+vl1t、202e2c3-vh4t+vl2t和254h4e11-vh6+vl1t以及阳性对照抗体imab362，起始配制浓度为12μg/ml，依次进行梯度稀释，共计12个浓度点，其中包含0浓度点，每孔加入50μl待测样品混匀。将培养板置于37℃(
±
2℃)，5％(
±
1％)co2培养箱中培养，继续培养6h。
[0191]
(4)孵育结束后每孔加入50μl luciferase assay system，室温避光孵育3min后读数检测rlu。以样品浓度的对数值为x值，以rlu为y值做四参数方程，作图分析样品的adcc活性。
[0192]
实验结果如图15和表10所示，人源化后抗体110e2a4-vh1+vl1t、202e2c3-vh4t+vl2t和254h4e11-vh6+vl1t均可介导gs-j2/cd16a对hek293/human-claudin18.2细胞产生报告基因活性，且adcc活性好于阳性对照imab362。
[0193]
表10抗体的adcc活性
[0194]
抗体ec50(ug/ml)110e2a4-vh1+vl1t0.01207202e2c3-vh4t+vl2t0.01726254h4e11-vh6+vl1t0.00739imab3620.02636
[0195]
实施例12抗体的cdc活性检测
[0196]
cdc效应是一种依赖补体系统，由抗体介导的细胞杀伤过程，细胞表面抗原和相应的抗体特异性地结合形成免疫复合物，可以通过经典途径激活补体形成攻膜复合物而导致细胞膜穿孔而裂解死亡。
[0197]
本实验以hek293/human-claudin18.2细胞为靶细胞，以混合健康人血清(pooled normal human serum,pnhs)作为补体来源，以imab362作为阳性参照，用于评价110e2a4-vh1+vl1t、202e2c3-vh4t+vl2t和254h4e11-vh6+vl1t的体外生物学活性。pnhs浓度设定为10％进行剂量反应曲线分析。
[0198]
具体实验步骤如下：
[0199]
(1)收集靶细胞(hek293/human-claudin18.2)，使用cdc缓冲液重悬，并计数。
[0200]
(2)使用cdc缓冲液稀释细胞悬液，调整靶细胞密度5
×
105cells/ml，转移到384孔细胞板中，每孔10μl。
[0201]
(3)配制4倍浓度的供试品工作液，转移工作液(对照组为cdc缓冲液)至384孔细胞板对应孔中，每孔10μl，室温孵育约30分钟。
[0202]
(4)使用cdc缓冲液稀释pnhs至2倍工作密度。转移稀释后的pnhs至完成孵育的384孔板的对应孔中，每孔20μl，放入细胞培养箱(37℃/5％co2)继续孵育约4小时。
[0203]
(5)实验对照为：10％pnhs：仅有pnhs(即30μl cdc buffer+10μl稀释后的pnhs)。
[0204]
(6)hek293/human-claudin18.2+10％pnhs：向仅有靶细胞悬液的孔中加入pnhs(即10μl靶细胞悬液+10μl cdc buffer+20μl稀释后的pnhs)。
[0205]
(7)孵育结束后，取出384孔板，用luminescent cell viability assay kit检测。使用pherastar plus来检测结果。
[0206]
(8)数据分析
[0207]
细胞裂解率采用以下公式进行计算：
[0208]
％cell lysis＝100％
×
(1-(rlusample-rlupnhs)/(rlucell+pnhs-rlupnhs))
[0209]
cdc实验结果如图16和表11所示，人源化后抗体110e2a4-vh1+vl1t、202e2c3-vh4t+vl2t和254h4e11-vh6+vl1t均具有激活补体系统于hek293/human-claudin18.2细胞产生的cdc效应的活性作用，且cdc活性好于阳性对照imab362，其中抗体110e2a4-vh1+vl1t的ec50活性比阳性对照提高17倍。
[0210]
表11抗体的cdc活性
[0211]
抗体ec50(μg/ml)110e2a4-vh1+vl1t0.2208202e2c3-vh4t+vl2t0.4986254h4e11-vh6+vl1t0.3078
imab3623.757
[0212]
实施例13：动物体内药效实验
[0213]
人源化抗体对b-ndg-hil15小鼠nugc-4-cldn18.2细胞皮下移植瘤模型的治疗作用研究
[0214]
利用b-ndg-hil15小鼠建立nugc-4-cldn18.2细胞皮下移植瘤模型，考察110e2a4-vh1+vl1t、202e2c3-vh4t+vl2t和254h4e11-vh6+vl1t对该模型的治疗作用。用于本实验的稳转人cldn18.2的人胃癌细胞nugc-4-cldn18.2，以1640培养基添加10％fbs、0.5μg/ml puromycin培养于含5％co2的37℃培养箱中。细胞连续培养十代之前，开始接种小鼠。收集nugc-4-cldn18.2细胞(将细胞浓度调为1
×
108个/ml)与matrigel以体积比1:1的比例混合，0.1ml/只接种于b-ndg hil15小鼠右侧胁肋部皮下。用于本实验的pbmc由一位受试者外周血提取而得。当小鼠肿瘤长至50-100mm3时，尾静脉注射1
×
107个pbmc/只小鼠，尾静脉注射pbmc后当天，将b-ndg-hil15小鼠按照肿瘤大小和体重随机分为五组，分别为：溶媒组(v)；imab362组(10mg/kg)；110e2a4-vh1+vl1t组(10mg/kg)；202e2c3-vh4t+vl2t组(10mg/kg)；254h4e11-vh6+vl1t组(10mg/kg)；每组6只，分组当天开始给药(将分组当天定义为d0天)，每周给药2次，连续给药3周，并每周两次测量肿瘤体积。结果显示(表12和图17)，110e2a4-vh1+vl1t、202e2c3-vh4t+vl2t和254h4e11-vh6+vl1t均能抑制nugc-4-cldn18.2细胞皮下移植瘤的活性，且药效优于阳性对照imab362。
[0215]
表12各组b-ndg-hil15小鼠不同天数的平均肿瘤体积(mm3)
[0216]
天数vimab362110e2a4-vh1+vl1t202e2c3-vh4t+vl2t254h4e11-vh6+vl1td083.582.783.483.083.1d4123.6100.598.2101.195.4d7189.9125.3
*
119.8
*
121.5
**
117.8
*
d11269.1150.7
*
143.2
*
156.2
*
145.2
*
d14367.9198.4
*
169.1
*
182.3
*
175.8
*
d18450.2259.4
**
195.8
**
225.4
**
215.7
**
d21612.5305.9
**
210.6
**
242.4
**
238.8
**
[0217]
与v组相比，*p《0.05,**p《0.01。