微流控芯片及其应用

1.本发明属于生物芯片领域，具体涉及微流控芯片及其应用。


背景技术：

2.研究人员正在努力阐明sars-cov-2这种疾病的机制并寻找可能的治疗方法。另一方面，奥密克戎(omicron)变体已成为最受关注的变体，因此寻找快速、特异且灵敏的基因检测方法迫在眉睫。就目前而言，阳性sars-cov-2样本仍主要通过聚合酶链式反应(pcr)进行检测，而识别变异类型要依赖于基因测序。这些技术耗时、耗力且成本较高，需要使用多种试剂、熟练的操作员和昂贵的设备进行复杂的反应。更重要的是，上述典型的检测方法(pcr)只允许对sars-cov-2进行一般检测，而不能对特定菌株进行检测。因此，开发一种快速、灵敏，一步即可区分不同变异的基因检测平台具有重要意义。
3.成簇的规则间隔短回文重复(crispr)系统是众所周知的微生物天然适应性免疫系统，并被开发为革命性的基因组编辑工具。crispr/cas技术在基因治疗、基因检测等领域得到了广泛开发和应用。例如，特异性高灵敏度酶报告基因解锁(sherlock) 是一种采用cas12或cas13检测预扩增dna或rna序列的方法。其他方法，如一小时低成本多用途高效系统(holmes)、holmesv2和crispr-cas-only扩增网络 (conan)正在展示高特异性和灵活性的优势。此类技术已逐渐应用于不同的临床场景：细菌检测、遗传病诊断、病毒筛查等。
4.据报道，基于crispr/cas的新兴诊断平台通过结合病毒纯化、扩增和检测过程来靶向sars-cov-2。这些诊断方法使sars-cov-2检测在不同的应用场景中更加可用。然而，上述基于crispr的诊断依赖于序列的扩增，导致对实验时间的需求增加，设备复杂且成本更高。
5.因此，有必要提供一种设备简单、成本低、检测时间短的基于crispr/cas的检测平台。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种微流控芯片，结构简单，成本较低，集成度高，可在较短时间内完成核酸提取、核酸扩增和检测过程，从而较快读出检测结果。
7.本发明还提出使用所述微流控芯片进行核酸检测的方法。
8.根据本发明的一个方面，提出了一种微流控芯片，包括核酸提取区域、核酸扩增区域和crispr反应区域，每个区域之间通过微流道连通；
9.所述核酸提取区域包括样品和磁珠混合液进液口、第一漂洗液进液口、第二漂洗液进液口、进样口和核酸提取室，所述样品和磁珠混合液进液口、所述第一漂洗液进液口、所述第二漂洗液进液口、所述进样口分别通过所述微流道与所述核酸提取室的一端连接；
10.所述核酸扩增区域包括扩增液进液口和第一蛇形微流道；所述扩增液进液口与所述核酸提取室的一端经所述微流道连接，所述核酸提取室的另一端经所述微流道与所述第
一蛇形微流道的一端连接，所述第一蛇形微流道用于进行恒温核酸扩增；
11.所述crispr反应区域包括crispr反应试剂存储腔和通气口，所述crispr反应试剂存储腔经所述微流道分别与所述第一蛇形微流道的另一端、所述通气口连接。
12.根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
13.本发明基于恒温核酸扩增技术和crispr检测技术，将核酸提取、核酸扩增和 crispr反应高度集成化于一个微流控芯片上，无需专业技术人员操作，即可实现对核酸的高灵敏度、快速、特异性的一体化检测，检测成本低，可满足在社区门诊、乡镇医院推广使用的需求；且利用该芯片可以一步区分病毒的不同变异。
14.在本发明的一些实施方式中，所述进样口用于通空气和水。
15.在本发明的一些实施方式中，所述微流控芯片是由上芯片和下芯片键合得到的。
16.具体地，所述上芯片包括所述样品和磁珠混合液进液口、所述核酸提取室、所述第一蛇形微流道、所述crispr反应试剂存储腔和所述通气口。
17.具体地，所述下芯片包括所述第一漂洗液进液口、所述第二漂洗液进液口、所述进样口、所述扩增液进液口。
18.具体地，在所述下芯片上，所述第一漂洗液进液口、所述第二漂洗液进液口、所述进样口和所述扩增液进液口分别通过所述微流道与所述上芯片的所述核酸提取室连接。
19.在本发明的一些实施方式中，所述上芯片的高度为0.2～0.3mm。
20.在本发明的一些优选的实施方式中，所述上芯片的高度为0.25mm。
21.在本发明的一些实施方式中，所述下芯片的高度为0.2～0.3mm。
22.在本发明的一些优选的实施方式中，所述下芯片的高度为0.25mm。
23.在本发明的一些实施方式中，所述微流控芯片的高度为0.4～0.6mm。
24.在本发明的一些优选的实施方式中，所述微流控芯片的高度为0.5mm。
25.在本发明的一些实施方式中，所述微流控芯片可以设置两组对称的核酸提取区域、核酸扩增区域和crispr反应区域，以同时对两个样品进行检测。
26.在本发明的一些实施方式中，所述核酸提取区域还包括分散区和第二蛇形微流道。
27.在本发明的一些实施方式中，所述分散区的一端经所述微流道与所述样品和磁珠混合液进液口连接，所述分散区的另一端经所述第二蛇形微流道与所述核酸提取室连接。
28.在本发明的一些实施方式中，所述分散区中包括若干微三棱柱结构，用于将所述样品和磁珠混合液中的磁珠分散，使磁珠与样品均匀混合。
29.在本发明的一些实施方式中，所述上芯片的外侧设置有磁铁单元。
30.具体地，所述磁铁单元对应所述核酸提取室，用于吸附所述磁珠。
31.在本发明的一些实施方式中，所述微流控芯片还包括第一废液出口和第二废液出口。
32.在本发明的一些实施方式中，所述第一废液出口位于所述上芯片。
33.在本发明的一些实施方式中，所述核酸提取室的第三端经所述微流道与所述第一废液出口连接。
34.具体地，所述下芯片还包括与所述第一废液出口对应的微孔。设计这些微孔是为了与所述第一废液出口搭接，以减小液体的流动阻力。
35.在本发明的一些实施方式中，所述第二废液出口位于所述下芯片。
36.在本发明的一些实施方式中，所述第二废液出口与所述微流道连通。
37.在本发明的一些实施方式中，所述crispr反应区域还包括进液口。
38.在本发明的一些实施方式中，所述进液口经所述微流道与所述crispr反应试剂存储腔连接。
39.在本发明的一些实施方式中，所述进液口用于通入crispr反应试剂，以存储在所述crispr反应试剂存储腔中。
40.在本发明的一些实施方式中，所述crispr反应试剂包括crispr/cas蛋白、crrna 和单链核酸探针。
41.在本发明的一些实施方式中，所述crispr/cas蛋白包括cas12或cas13蛋白中的至少一种。
42.在本发明的一些实施方式中，所述单链核酸探针包括荧光基团和淬灭基团。
43.具体地，所述荧光基团包括fam、fitc、joe、cy3、cy5或rox中的至少一种。
44.具体地，所述淬灭基团包括bhq1、bhq2或bhq3中的至少一种。
45.在本发明的一些实施方式中，所述crispr反应试剂存储腔的数量不限，可根据实际检测需要设置相应个数的存储腔。其中每个存储腔中放置不同的crispr反应试剂，以检测样品中的不同核酸。
46.具体地，所述不同的crispr反应试剂主要是所述crrna不同，从而用于识别不同的核酸片段。
47.在本发明的一些实施方式中，所述通气口的数量与所述crispr反应试剂存储腔的数量相对应。
48.具体地，设置所述通气口是为了保证扩增反应液、所述crispr反应试剂正常进入所述crispr反应试剂存储腔。
49.在本发明的一些实施方式中，所述下芯片还包括与所述样品和磁珠混合液进液口、所述crispr反应试剂存储腔、所述进液口和所述通气口对应的微孔。设计这些微孔是为了与样品和磁珠混合液进液口、crispr反应试剂存储腔、进液口和通气口搭接，以减小所加试剂的流动阻力。
50.具体地，所述微孔的直径大于所述微流道的宽度。
51.在本发明的一些实施方式中，所述微流控芯片与注射泵连接，用于控制各试剂或样品的通入，以及废液的排出。
52.具体地，所述微流控芯片的进样口或废液出口通过管路与所述注射泵连接。
53.具体地，所述注射泵对所述试剂或样品的通入以及废液的排出的控制，由程序化系统来实现。
54.具体地，计算机与所述注射泵相连，通过所述计算机的程序化系统来控制所述注射泵的开启或关闭，进而控制所述试剂或样品的通入，以及废液的排出。
55.根据本发明的第二个方面，提出了使用所述微流控芯片进行核酸检测的方法，包括以下步骤：
56.s1：将样品和磁珠混合液经样品和磁珠混合液进液口通入到核酸提取室，进行核酸提取，使提取的核酸吸附在磁珠上；
57.s2：依次将第一漂洗液和第二漂洗液经第一漂洗液进液口和第二漂洗液进液口通入到所述核酸提取室，对吸附核酸的磁珠进行漂洗；
58.s3：依次将空气和水经进样口通入到所述核酸提取室，洗脱核酸；
59.s4：将扩增液经扩增液进液口通入到第一蛇形微流道，对所述核酸进行恒温扩增，得扩增反应液；
60.s5：所述扩增反应液进入crispr反应试剂存储腔，进行crispr反应，反应结束后对反应结果进行检测。
61.在本发明的一些实施方式中，所述样品和磁珠混合液中还包括蛋白酶k和载体rna。
62.在本发明的一些实施方式中，样品为血清、血浆或淋巴液。
63.在本发明的一些实施方式中，步骤s2中所述第一漂洗液和所述第二漂洗液对所述吸附核酸的磁珠漂洗7～8次。
64.在本发明的一些实施方式中，步骤s3中通入所述空气，持续5～10min。
65.在本发明的一些实施方式中，步骤s3中通入的水为无rna酶的水。
66.在本发明的一些实施方式中，步骤s3在通入水后，对所述微流控芯片加热到 55～57℃，维持2～2.5min，以洗脱所述核酸。
67.在本发明的一些实施方式中，步骤s4中通入所述扩增液，与所述核酸混合反应 5min，实现对所述核酸的扩增。
68.在本发明的一些实施方式中，所述扩增液为rpa扩增液、raa扩增液中的任一种。
69.在本发明的一些实施方式中，步骤s4进行的所述扩增为rpa扩增或raa扩增。
70.在本发明的一些实施方式中，步骤s5中的所述crispr反应试剂存储腔中预先存储有crispr反应试剂，所述crispr反应试剂是通过进液口通入所述crispr反应试剂存储腔的。
71.在本发明的一些实施方式中，所述crispr反应试剂包括crispr/cas蛋白、crrna 和单链核酸探针。
72.在本发明的一些实施方式中，步骤s5反应结束后，通过荧光检测仪或肉眼观察检测荧光信号，以判断所述反应结果。
73.具体地，通过蓝光或紫外光照射步骤s5的反应产物，以检查是否有荧光产生。
74.具体地，若样品中有待测核酸，则所述crrna与所述扩增反应液中的扩增产物互补结合，激活所述crispr/cas蛋白的切割活性，将所述单链核酸探针的荧光基团切割为游离状态而发出荧光，此时可检测到荧光信号，并可进一步对荧光信号发出的荧光强度进行测定。
75.若所述样品中不含有待测核酸，则没有扩增产物与所述crrna结合，不会激活所述crispr/cas蛋白的切割活性，所述单链核酸探针的荧光基团未被切割，由于淬灭基团的存在，使得荧光基团不能发出荧光，此时不会检测到荧光信号。
附图说明
76.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
77.图1为本发明实施例1中微流控芯片的上芯片和下芯片的结构示意图；
78.图2为图1中a部分的放大图；
79.图3为本发明实施例2中微流控芯片的实物图；
80.图4为本发明实施例2中检测得到的crispr反应腔的荧光图和荧光强度图；其中， n-阴性对照；p-阳性对照；
81.图5为本发明实施例3中检测得到的crispr反应腔的荧光体和荧光强度图；其中， n-阴性对照；p-阳性对照；
82.图6为本发明实施例4中检测得到的crispr反应腔的荧光体和荧光强度图；其中， n-阴性对照；p-阳性对照；
83.图7为本发明实施例5中检测得到的crispr反应腔的荧光体和荧光强度图；其中， n-阴性对照；p-阳性对照；
84.图8为本发明实施例中对新冠病毒sars-cov-2、ba.1、ba.2和ba.5基因的检测限进行检测的结果图。
85.附图标记：
86.上芯片-10；下芯片-20；110-样品和磁珠混合液进液口；111-第一漂洗液进液口；112
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第二漂洗液进液口；113-进样口；114-分散区；115-第二蛇形微流道；116-核酸提取室； 120-第一微孔；121-微三棱柱结构；210-扩增液进液口；211-第一蛇形微流道；310-进液口；311-crispr反应试剂存储腔；312-通气口；320-第二微孔；321-第三微孔；322-第四微孔；410-第一废液出口；411-第二废液出口；420-第五微孔。
具体实施方式
87.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
88.在本发明的描述中，需要理解的是，涉及到方位描述，例如上、下、左、右等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
89.在本发明的描述中，若干的含义是一个以上。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
90.本发明的描述中，除非另有明确的限定，设置、连接等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。
91.本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、结构或者特点包含于本发明的至少一个实施例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例。而且，描述的具体特征、结构或者特点可以在任何的一个或多个实施例中以合适的方式结合。
92.实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
93.实施例1
94.本实施例提出了一种微流控芯片，其上芯片和下芯片的结构示意图如图1所示。参考图1描述该微流控芯片的结构：
95.微流控芯片包括核酸提取区域、核酸扩增区域和crispr反应区域，每个区域之间通过微流道连通。且该微流控芯片是由上芯片10和下芯片20键合后得到的，包括两组对称的核酸提取区域、核酸扩增区域和crispr反应区域，可同时检测两个样品。具体为：
96.核酸提取区域包括样品和磁珠混合液进液口110、第一漂洗液进液口111、第二漂洗液进液口112、进样口113、分散区114、第二蛇形微流道115和核酸提取室116。样品和磁珠混合液进液口110经微流道与分散区114的左端连接，分散区114的右端经第二蛇形微流道115与核酸提取室116的左端连接，其中分散区114中包括若干微三棱柱结构121(分散区114的放大结构如图2所示)，用于将样品和磁珠混合液中的磁珠分散，使磁珠与样品均匀混合；第一漂洗液进液口111、第二漂洗液进液口112和进样口113 分别通过微流道与核酸提取室116的左端连接；
97.核酸扩增区域包括扩增液进液口210和第一蛇形微流道211。扩增液进液口210通过微流道与核酸提取室116的左端连接，核酸提取室116的右端经微流道与第一蛇形微流道211的一端连接，第一蛇形微流道211用于进行恒温核酸扩增，可以是raa扩增，也可以是rpa扩增；
98.crispr反应区域包括进液口310、crispr反应试剂存储腔311和通气口312，其中设有5个crispr反应试剂存储腔311和对应的5个通气口312，每个crispr反应试剂存储腔311中放置不同的crispr反应试剂，可同时检测一个样品中的5种核酸。进液口310经微流道与crispr反应试剂存储腔311连接，crispr反应试剂从进液口 310通入crispr反应试剂存储腔311，并存储在crsipr反应试剂存储腔311中，以便后续反应；crispr反应试剂存储腔311经微流道分别与第一蛇形微流道211的另一端、通气口312连接；
99.微流控芯片还包括第一废液出口410和第二废液出口411，核酸提取室116的第三端经微流道与第一废液出口410连接，第二废液出口411与微流道连通。
100.微流控芯片包括上芯片10和下芯片20。其中，上芯片的高度为0.25mm，下芯片的高度为0.25mm，微流控芯片的高度为0.5mm。上芯片10包括样品和磁珠混合液进液口110、分散区114、第二蛇形微流道115、核酸提取室116、第一蛇形微流道211、进液口310、crispr反应试剂存储腔311、通气口312和第一废液出口410。在上芯片10 的外侧还设置有磁铁单元，其对应核酸提取室116，用于吸附磁珠。
101.下芯片20包括第一漂洗液进液口111、第二漂洗液进液口112、进样口113、扩增液进液口210和第二废液出口411，第一漂洗液进液口111、第二漂洗液进液口112、进样口113和扩增液进液口210分别通过微流道与上芯片10的核酸提取室116连接，第二废液出口411与微流道连通。下芯片20还包括与样品和磁珠混合液进液口110对应的第一微孔120，与进液口310对应的第二微孔320，与crispr反应试剂存储腔311 对应的第三微孔321，与通气口312对应的第四微孔322，和与第一废液出口410对应的第五微孔420。在下芯片20上设计这些微孔是为了与上芯片上对应的各结构搭接，以减小液体的流动阻力。
102.实施例2
103.本实施例采用实施例1的微流控芯片(其实物图如图3所示)对新型冠状病毒患者血清中的sars-cov-2基因进行检测，各试剂、样品的通入和废液的排出由计算机的程序化
ba.2基因进行检测，方法同实施例2。检测结果如图6所示，可以看出，5个crispr 反应腔311中只有第2个和第4个中有荧光显示，荧光强度也显示了同样的结果，表明血清样品是来源于变异体ba.2的。
117.实施例5
118.本实施例采用实施例1的微流控芯片对新型冠状病毒变异体ba.5患者血清中的ba.5基因进行检测，方法同实施例2。检测结果如图7所示，可以看出，5个crispr 反应腔311中只有第2个和第5个中有荧光显示，荧光强度也显示了同样的结果，表明血清样品是来源于变异体ba.5的。
119.另外，采用实施例1的微流控芯片及相应的方法对上述四种靶标物新冠病毒sars
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cov-2、ba.1、ba.2和ba.5基因的检测限进行了检测，结果如图8所示。图8显示，随dna浓度的升高，荧光强度逐渐升高，二者呈正相关；在dna浓度为100拷贝/ml 时，即可检测到荧光强度，表明采用本发明中的微流控芯片进行核酸检测，其检测限为 100拷贝/ml，灵敏度较高。
120.上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。