一种细胞因子融合纳米抗体CTLA-4Nb16-IL12及其制备方法与应用

本发明涉及生物制品领域，具体涉及一种新型细胞因子融合纳米抗体及其制备方法与应用。

背景技术：

1、激发机体t细胞进行抗肿瘤的免疫治疗已成为治疗各种类型肿瘤的既定模式。基于bite（bispecific t cell engager，即双特异性t细胞激动剂）技术平台的双特异性抗体能招募t细胞接近肿瘤细胞，是一类具有广阔应用前景的创新治疗策略。构建以纳米抗体作为基础结构的t细胞激动剂能赋予bite以纳米抗体的诸多优势，可有望进一步提高bite类蛋白药物的疗效。同时但由于纳米抗体体积小导致其半衰期短、组织滞留少、从血清中清除快的缺点，在一定程度上影响了其疗效。因此，如何克服因分子量小代谢迅速导致的疗效下降是纳米抗体在临床应用中的核心问题。融合蛋白技术可以克服纳米抗体和细胞因子在体内半衰期短、组织滞留少、血浆清除率快的缺点，增加了它们在体内的作用时间，且具有协同效应，大大提高了它们的抗肿瘤能力。

2、细胞毒性t淋巴细胞相关抗原-4（cytotoxic t lymphocyte-associatedantigen-4，ctla-4）是一种免疫负调节因子，主要表达于活化t细胞表面，与t细胞共刺激蛋白cd28同源。ctla-4在t细胞活化后迅速上调，以比cd28更高的亲和力与b7分子结合，向下游传递抑制性信号，从而抑制t细胞的增殖与活化。专利号zl201610575258.3 的发明专利，公开了一种利用噬菌体展示技术，成功筛选出针对ctla-4的特异性纳米抗体16 （ctla-4nb16），ctla-4nb16 可增强树突细胞/肝癌细胞融合（dc/hepg2-fc） 诱导的 cd8+ t 细胞介导的肿瘤杀伤作用，从而抑制肿瘤的生长。同时由于纳米抗体具有人源化、高效化及小型化的优点，能够更好地阻断 ctla-4 抑制信号通路，促进 细胞毒性t细胞（cytotoxic tlymphocyte, ctl）的高效特异性。

3、白介素-12（interleukin-2，il-12）是一种异源二聚体糖蛋白，可介导先天免疫和获得性免疫。它由通过二硫键共价连接的p40和p35的两个亚基组成，其分子量约为75kda，主要由抗原呈递细胞产生。il-12可刺激活化的t细胞增殖，促进th0细胞向th1细胞分化，诱导ctl和nk细胞的细胞毒性，促进其分泌ifn-γ、tnf-α、il-2等细胞因子。本专利将建立一种新型细胞因子融合蛋白纳米抗体，即细胞毒性t淋巴细胞相关抗原-4纳米抗体16-白介素12融合蛋白纳米抗体（ctla-4 nb16-il12），增强两者在体内的作用时间，两者协同作用，更高效地抑制ctla-4活性与活化的t细胞结合发挥抗肿瘤作用。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种新型细胞因子融合蛋白纳米抗体ctla-4nb16-il12及其制备方法与应用。

2、为了解决该技术问题，本发明采用以下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供一种新型细胞因子融合蛋白纳米抗体ctla-4 nb16-il12，其结构包含能够特异性的产生细胞因子il-12的第一功能域以及能够特异性结合并有效阻断t细胞表面免疫检查位点ctla-4的第二功能域，即抗ctla-4 nb16；其中所述第一功能域、所述第二功能域从n端到c端顺序连接。

4、所述新型细胞因子融合蛋白纳米抗体能够通过il-12可刺激活化的t细胞增殖，并能有效阻断t细胞表面ctla-4分子，从而增强t细胞活化所需的信号；

5、优选地，所述抗ctla-4 nb16包含决定簇互补区cdr和框架区fr；所述纳米抗体的决定簇互补区cdr由cdr1、cdr2和cdr3组成；其中cdr1为seq id no.1中的第26-35位氨基酸，cdr2为seq id no.1中的第51-59位氨基酸，cdr3为seq id no.1中的第97-106位氨基酸；

6、优选地，所述il-12的氨基酸序列为seq id no.2，其genbank的登录号为:aad16432.1；

7、优选地，所述细胞因子il-12、所述抗ctla-4纳米抗体16之间均通过连接片段（linker）连接；

8、优选地，所述连接片段为以g4s为单元的柔性连接片段；

9、所述g4s具体为ggggs；

10、所述linker含有二个g4s单位，所述连接片段的氨基酸序列如seq id no .1和seqid no .2所示；

11、优选地，所述新型细胞因子融合蛋白纳米抗体的氨基酸序列如seq id no .3所示。

12、本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，其编码所述新型细胞因子融合蛋白纳米抗体ctla-4 nb16-il12；

13、优选地，编码所述ctla-4 nb16-il12的核苷酸序列如seq id no .3所示。

14、本发明的第三方面，提供一种表达载体，其含有所述多核苷酸。

15、本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，其被所述表达载体所转化。

16、本发明的第五方面，提供一种药物组合物，其包含所述新型细胞因子融合纳米抗体ctla-4 nb16-il12和可药用载体。

17、本发明的第六方面，提供一种新型细胞因子融合蛋白纳米抗体ctla-4 nb16-il12的制备方法，包括构建含有新型细胞因子融合蛋白纳米抗体ctla-4 nb16-il12的基因序列的原核表达载体，然后将含有细胞因子融合蛋白纳米抗体ctla-4 nb16-il12的基因序列的原核表达载体转化至宿主菌中诱导表达和纯化，从而获得所述新型细胞因子融合蛋白纳米抗体ctla-4 nb16-il12，所述原核表达载体采用pet-32a。

18、所述宿主菌采用e.coli rosstta (de3)。

19、本发明的第七方面，提供一种新型细胞因子融合蛋白纳米抗体ctla-4 nb16-il12在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。

20、有益效果

21、1.本发明所述的新型细胞因子融合蛋白纳米抗体ctla-4 nb16-il12是以融合细胞因子，并以纳米抗体作为结构基础的t细胞激动剂，赋予t细胞激动剂以纳米抗体的诸多优势，如体积小，抗原结合性能好，容易基因工程改造和实现大量生产，免疫原性弱以及其融合蛋白技术可以克服纳米抗体和细胞因子在体内半衰期短、组织滞留少、血浆清除率快的缺点。采用原核细胞表达系统生产，其成本低廉，蛋白产量高，使用方便，可工业化生产，具有良好的发展前景且适于推广使用。

22、2.本发明所述的新型细胞因子融合蛋白纳米抗体ctla-4 nb16-il12可同时产生细胞因子il-12，刺激活化的t细胞增殖，促进th0细胞向th1细胞分化，诱导ctl和nk细胞的细胞毒性，促进其分泌ifn-γ、tnf-α、il-2等细胞因子，产生抗肿瘤效应。同时，所述新型细胞因子融合蛋白纳米抗体（ctla-4 nb16-il12）包含的抗ctla-4纳米抗体能有效阻断ctla-4介导的免疫抑制信号通路，消除其免疫抑制功能，诱导t细胞激动剂具有更高疗效，在肿瘤免疫治疗领域具有良好的临床应用前景。