顺序电穿孔方法与流程

背景技术：

技术实现思路

1、在一些方面中，本文中描述了用于使用包括连续电脉冲的新的电穿孔方案用目的药剂对难以转染的细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织进行有效电穿孔的方法和设备。在某些方面中，与对细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织进行单次电穿孔相比，对细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织进行顺序电穿孔出乎意料地导致显著更高的转基因表达。在某些方面中，本文中所述的方法和设备是独特的，因为它们可以提高目的药剂进入到细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织中的加载效率，同时维持细胞、细胞颗粒、脂质囊泡或组织的生存力并维持细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织产生临床作用的能力。在某些方面中，本文中公开的方法和设备可以通过改变在每轮电穿孔期间使用的电穿孔能量来优化在顺序电穿孔之后的效率和生存力。

2、本公开内容的一些方面涉及转染目的药剂的方法；使膜暂时透化以允许目的药剂转运通过膜的方法；对细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织进行电穿孔的方法；产生经电穿孔的细胞、细胞颗粒、脂质囊泡、脂质体或组织的方法；以及提高电穿孔的效率同时维持经电穿孔物质的临床作用的方法。本公开内容中所讨论的步骤和方面被考虑为这些方法中的任意者的一部分。在一些方面中，本文中考虑的方法可以包括或不包括以下步骤中的1、2、3、4、5个或更多个：根据第一方案，使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；根据第二方案，使样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；使样品经受在第一电脉冲与第二电脉冲之间的时间延迟；在样品中提供核酸、多肽、蛋白质或小分子；使细胞、细胞颗粒或脂质囊泡经受足以对细胞、细胞颗粒或脂质囊泡进行电穿孔的条件；在细胞中表达经电穿孔的核酸、多肽、蛋白质；以及通过调节样品所经受的电脉冲的电参数和/或电脉冲之间的时间延迟来调节药剂进入到样品中的加载效率、经电穿孔样品的临床作用、和/或样品生存力。这些步骤中的任何一个或更多个均可以从所公开方法中排除。

3、本公开内容的一些方面包括电穿孔方法，其包括：

4、(1)根据第一方案，使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；以及根据第二方案，使所述样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间；

5、(2)根据第一方案，使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；允许所述样品恢复至少24小时；以及根据第二方案，使所述样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；

6、(3)根据第一方案，使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；允许所述样品恢复至少24小时；以及根据第二方案，使所述样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间；

7、(4)使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；以及使所述样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间；

8、(5)使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；允许所述样品恢复至少24小时；以及使所述样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；或者

9、(6)使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；允许所述样品恢复至少24小时；以及使所述样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间。

10、本公开内容的一些方面包括连续编辑细胞基因的方法，其包括：

11、(1)根据第一方案，使包含一个或更多个完整细胞的样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使所述细胞加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；以及根据第二方案，使所述样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使所述细胞加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间；

12、(2)根据第一方案，使包含一个或更多个完整细胞的样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使所述细胞加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；允许所述样品恢复至少24小时；以及根据第二方案，使所述样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使所述细胞加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；

13、(3)根据第一方案，使包含一个或更多个完整细胞的样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使所述细胞加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；允许所述样品恢复至少24小时；以及根据第二方案，使所述样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使所述细胞加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间；

14、(4)使包含一个或更多个完整细胞的样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使所述细胞加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；以及使所述样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使所述细胞加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间；

15、(5)使包含一个或更多个完整细胞的样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使所述细胞加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；允许所述样品恢复至少24小时；以及使所述样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使所述细胞加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；或者

16、(6)使包含一个或更多个完整细胞的样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使所述细胞加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；允许所述样品恢复至少24小时；以及使所述样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使所述细胞加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间。

17、本公开内容的另一些方面包括电穿孔方法，其包括：

18、(1)根据第一方案，使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含rna的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；允许所述细胞样品恢复至少24小时；以及根据第二方案，使所述细胞样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含rna的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间；

19、(2)根据第一方案，使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含dna的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；允许所述细胞样品恢复至少24小时；以及根据第二方案，使所述细胞样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含dna的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间；或者

20、(3)根据第一方案，使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含一种或更多种蛋白质的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；允许所述细胞样品恢复至少24小时；以及根据第二方案，使所述细胞样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含一种或更多种蛋白质的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间；或者

21、(4)根据第一方案，使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含核糖核蛋白的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；允许所述细胞样品恢复至少24小时；以及根据第二方案，使所述细胞样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含核糖核蛋白的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间；或者

22、(5)使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含rna的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；允许所述细胞样品恢复至少24小时；以及使所述细胞样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含rna的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间；

23、(6)使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含dna的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；允许所述细胞样品恢复至少24小时；以及使所述细胞样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含dna的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间；或者

24、(7)使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含一种或更多种蛋白质的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；允许所述细胞样品恢复至少24小时；以及使所述细胞样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含一种或更多种蛋白质的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间；或者

25、(8)使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含核糖核蛋白的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；允许所述细胞样品恢复至少24小时；以及使所述细胞样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含核糖核蛋白的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间。

26、在一些方面中，第一药剂和第二药剂是相同的药剂。在一些方面中，第一药剂和第二药剂是不同的药剂。在一些方面中，第一药剂和第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。在一些方面中，核酸是rna，并且其中所述rna是mrna、mirna、shrna、sirna或反义寡核苷酸。在一些方面中，核酸是dna，并且其中所述dna是反义寡核苷酸、载体或双义线性dna。在一些方面中，蛋白质是核糖核蛋白。在一些方面中，核糖核蛋白包含cas9蛋白和指导rna。

27、在一些方面中，所述方法还包括在第一和/或第二电脉冲之后的静置步骤。在一些方面中，静置步骤包括将样品孵育10至30分钟。在一些方面中，静置步骤包括在25℃至50℃下孵育样品。在一些方面中，静置步骤包括在3％至8％co2下孵育样品。在一些方面中，样品在第一和/或第二电脉冲之后不经受静置步骤。

28、在一些方面中，第一场强等于第二场强，并且第一脉冲持续时间长于第二脉冲持续时间。在一些方面中，第一场强等于第二场强，并且第一脉冲持续时间短于第二脉冲持续时间。在一些方面中，第一场强等于第二场强，并且第一脉冲持续时间等于第二脉冲持续时间。在一些方面中，第一场强小于第二场强，并且第一脉冲持续时间等于第二脉冲持续时间。在一些方面中，第一场强大于第二场强，并且第一脉冲持续时间等于第二脉冲持续时间。在一些方面中，第一场强小于第二场强，并且第一脉冲持续时间长于第二脉冲持续时间。在一些方面中，第一场强大于第二场强，并且第一脉冲持续时间长于第二脉冲持续时间。在一些方面中，第一场强小于第二场强，并且第一脉冲持续时间短于第二脉冲持续时间。在一些方面中，第一场强大于第二场强，并且第一脉冲持续时间短于第二脉冲持续时间。

29、在一些方面中，第一电脉冲的场强和第一电脉冲的脉冲持续时间产生第一总施加电能并且第二电脉冲的场强和第二电脉冲的脉冲持续时间产生第二总施加电能，并且第一总施加电能大于第二总施加电能。在一些方面中，第一总施加电能小于第二总施加电能。

30、在一些方面中，第一和第二电脉冲的第一和第二场强是电脉冲的电压幅值、电脉冲的持续时间和样品的电导率的函数。电脉冲的电压幅值可以为0.001伏特至10,000伏特、0.01伏特至10,000伏特、0.1伏特至10,000伏特、1伏特至10,000伏特、1伏特至9,000伏特、1伏特至8,000伏特、1伏特至7,000伏特、1伏特至6,000伏特、1伏特至5,000伏特、1伏特至4,000伏特、1伏特至3,000伏特、1伏特至2,000伏特、或1伏特至1,000伏特。在一些方面中，电脉冲的电压幅值为100伏特至900伏特。在一些方面中，样品的电导率是这样的参数的函数，所述参数包括电穿孔缓冲液的离子组成、待被加载到细胞中的药剂的浓度、细胞密度、温度和压力。样品的电导率可以为0.01西门子/米至10西门子/米、0.01西门子/米至1西门子/米、0.1西门子/米至10西门子/米、0.1西门子/米至1西门子/米、或1西门子/米至10西门子/米。在一些方面中，样品的电导率为1.0至3.0西门子/米。在一些方面中，第一和第二场强还是电穿孔室的几何形状的函数。电穿孔室可以包含0.001cm至10cm、0.001cm至1cm、0.01cm至10cm、0.01cm至1cm、0.1cm至10cm、0.1cm至1cm、或1cm至10cm的电极间隙。在一些方面中，电穿孔室包含0.01cm至1cm的电极间隙。

31、第一和第二电脉冲的第一和第二场强可以为0.01kv/cm至10kv/cm、0.01kv/cm至1kv/cm、0.1kv/cm至10kv/cm、0.1kv/cm至1kv/cm、或1kv/cm至10kv/cm。在一些方面中，第一和第二电脉冲的第一和第二场强为0.3kv/cm至3kv/cm。

32、第一和第二电脉冲的第一和第二脉冲持续时间可以为10-6秒至10秒、10-6秒至1秒、10-3秒至10秒、或10-3秒至1秒。在一些方面中，第一和第二电脉冲的第一和第二脉冲持续时间为1微秒至100毫秒。

33、在一些方面中，第一和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征。脉冲数可以为1个脉冲至1000个脉冲、1个脉冲至900个脉冲、1个脉冲至800个脉冲、1个脉冲至700个脉冲、1个脉冲至600个脉冲、1个脉冲至500个脉冲、1个脉冲至400个脉冲、1个脉冲至300个脉冲、1个脉冲至200个脉冲、1个脉冲至100个脉冲、1个脉冲至90个脉冲、1个脉冲至80个脉冲、1个脉冲至70个脉冲、1个脉冲至60个脉冲、1个脉冲至50个脉冲、1个脉冲至40个脉冲、1个脉冲至30个脉冲、1个脉冲至20个脉冲、或1个脉冲至10个脉冲。在一些方面中，脉冲数为1个脉冲至130个脉冲。

34、在一些方面中，脉冲宽度是指数衰减率的函数。在一些方面中，指数衰减率是样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数。样品的电阻可以为1欧姆至10000欧姆、1欧姆至9000欧姆、1欧姆至8000欧姆、1欧姆至7000欧姆、1欧姆至6000欧姆、1欧姆至5000欧姆、1欧姆至4000欧姆、1欧姆至3000欧姆、1欧姆至2000欧姆、1欧姆至1000欧姆、1欧姆至900欧姆、1欧姆至800欧姆、1欧姆至700欧姆、1欧姆至600欧姆、1欧姆至500欧姆、1欧姆至400欧姆、1欧姆至300欧姆、1欧姆至200欧姆、1欧姆至100欧姆、1欧姆至90欧姆、1欧姆至80欧姆、1欧姆至70欧姆、1欧姆至60欧姆、1欧姆至50欧姆、1欧姆至40欧姆、1欧姆至30欧姆、1欧姆至20欧姆、或1欧姆至10欧姆。在一些方面中，样品的电阻为1欧姆至1000欧姆。电源电容可以为1μf至1,000,000μf、1μf至100,000μf、1μf至10,000μf、1μf至1,000μf、或1μf至100μf。在一些方面中，电源电容为1000μf至5000μf。

35、在一些方面中，脉冲形状是方波脉冲或指数衰减波脉冲。在一些方面中，脉冲模式包括与第一或第二脉冲的持续时间相对应的单脉冲。在一些方面中，脉冲模式包括多脉冲，其中多脉冲的组合持续时间与第一或第二脉冲的持续时间相对应。在一些方面中，第一和第二电脉冲的极性为正或负。

36、在一些方面中，在样品经受第一脉冲之后至少12小时至至少48小时使所述样品经受第二电脉冲。在一些方面中，在样品经受第一脉冲之后至少24小时使所述样品经受第二电脉冲。

37、所述方法可以通过具有包含指令的非暂态计算机可读介质的电穿孔系统进行，所述指令当由处理器执行时引起所述处理器执行第一和第二方案以对样品进行电穿孔。在一些方面中，电穿孔系统包含流式电穿孔设备并且当样品在流式电穿孔设备内流动时使所述样品经受电脉冲。

38、在一些方面中，细胞可以是哺乳动物细胞，并且在一些方面中，细胞是人细胞、鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞或灵长类细胞。在一些方面中，细胞是原代细胞。在一些方面中，细胞是经培养细胞，并且所述经培养细胞可以是经培养细胞系，其可以包括3t3，697，10t1/2，1321n1，a549，ahr77，b-lcl，b16，b65，ba/f3，bhk，c2c12，c6，caco-2，cap，caski，chago-k-1，cho，cos，dg75，dld-1，el4，h1299，hacat，hap1，hct116，hek，hela，hepg2，hl60，hos，ht1080，ht29，huh-7，huvec，ins-1/grinch，jurkat，k46，k562，kg1，khyg-1，l5278y，l6，lncap，ls180，mcf7，mda-mb-231，me-180，mg-63，min-6，molt4，nalm6，nd7/23，neuro2a，nk92，ns/0，p3u1，panc-1，pc-3，pc12，per.c6，pm1，ramos，raw 264.7，rbl，renca，rle，sh-sy5y，sk-br-3，sk-mes-1，sk-n-sh，sk-ov-3，sp2/0，sw403，thp-1，u2os，u937，vero，yb2/0，或其衍生物。细胞可以包括脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、角质形成细胞、肌细胞、神经元、骨细胞、外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell，pbmc)、脾细胞、干细胞或胸腺细胞。在一些方面中，pbmc是外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte，pbl)，其可以是自然杀伤(natural killer，nk)细胞、t细胞或b细胞。在一些方面中，pbmc是单核细胞，其可以是巨噬细胞或树突细胞，并且巨噬细胞可以是小胶质细胞。在一些方面中，干细胞是脂肪干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞或神经干细胞。

39、在一些方面中，药剂的加载效率为至少50％、60％、70％、80％或90％。

40、在一些方面中，细胞生存力在第二电脉冲之后12至96小时可以为至少50％；在第二电脉冲之后12至96小时可以为至少60％；在第二电脉冲之后12至96小时可以为至少70％；在第二电脉冲之后12至96小时可以为至少80％；或者在第二电脉冲之后12至96小时可以为至少90％。

41、在一些方面中，经电穿孔细胞在第二电脉冲之后12至96小时有约50％至90％有生存力；在第二电脉冲之后12至72小时有约50％至90％有生存力；在第二电脉冲之后12至48小时有约50％至90％有生存力；在第二电脉冲之后24小时有约50％至90％有生存力；在第二电脉冲之后12至96小时有约60％至90％有生存力；在第二电脉冲之后12至72小时有约60％至90％有生存力；在第二电脉冲之后12至48小时有约60％至90％有生存力；或者在第二电脉冲之后24小时有约60％至90％有生存力。

42、本公开内容的一些方面还涉及电穿孔系统，其具有包含指令的非暂态计算机可读介质，所述指令当由处理器执行时引起所述处理器进行以下：选择与具有第一场强和第一脉冲持续时间的第一电脉冲相关的第一方案；根据第一方案，使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受由第一方案限定的第一电脉冲，所述第一电脉冲足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂；选择与具有第二场强和第二脉冲持续时间的第二电脉冲相关的第二方案；以及根据第二方案，使样品经受由第二方案限定的第二电脉冲，所述第二电脉冲足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂；其中第一场强和/或第一脉冲持续时间不同于第二场强和/或第二脉冲持续时间。

43、本公开内容的一些方面还包括使用本文中所述的任何方法产生的或者使用任何具有包含指令的非暂态计算机可读介质的电穿孔系统产生的经电穿孔的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡，所述指令当由处理器执行时引起所述处理器执行本文中所述的任何方法。

44、本公开内容的另一些方面包括治疗患有或疑似患有疾病或病症的对象的方法，其包括以减轻疾病或病症的量施用任何所述方法的产品。在某些方面中，所述方法的产品是药物递送载剂，并且考虑了广泛多种已知药物可以通过由所述方法产生的加载颗粒来递送。疾病或病症可以包括适于通过使用电穿孔方法制备(例如加载)的脂质体颗粒、细胞颗粒或类似递送载剂来递送药物或药剂的任何疾病或病症。

45、本公开内容的又一些方面包括通过施用有效量的包含在通过所述方法产生的颗粒中的药物、生物分子或其他生物活性分子来治疗患有或疑似患有疾病或病症的对象的方法。在某些方面中，疾病是感染性疾病，包括但不限于细菌感染、真菌感染、寄生虫感染或病毒感染。在另一方面中，细菌感染是分枝杆菌(mycobacterial)感染。在又一方面中，病毒感染是逆转录病毒感染，包括但不限于hiv感染。在另一方面中，疾病是炎性疾病或癌症或血管闭塞性疾病。

46、本公开内容的一些方面包括被配置成进行任何所述方法的电穿孔系统。

47、还公开了本公开内容的以下方面1至201。

48、方面1是电穿孔方法，其包括：根据第一方案，使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；以及根据第二方案，使所述样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。

49、方面2是电穿孔方法，其包括：根据第一方案，使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；允许所述样品恢复至少24小时；以及根据第二方案，使所述样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间。

50、方面3是电穿孔方法，其包括：根据第一方案，使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；允许所述样品恢复至少24小时；以及根据第二方案，使所述样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。

51、方面4是连续编辑细胞基因的方法，其包括：根据第一方案，使包含一个或更多个完整细胞的样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使所述细胞加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；以及根据第二方案，使所述样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使所述细胞加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。

52、方面5是连续编辑细胞基因的方法，其包括：根据第一方案，使包含一个或更多个完整细胞的样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使所述细胞加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；允许所述样品恢复至少24小时；以及根据第二方案，使所述样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使所述细胞加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间。

53、方面6是连续编辑细胞基因的方法，其包括：根据第一方案，使包含一个或更多个完整细胞的样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使所述细胞加载有第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；允许所述样品恢复至少24小时；以及根据第二方案，使所述样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使所述细胞加载有第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。

54、方面7是方面1至6所述的方法，其中所述第一药剂和第二药剂是相同的药剂。方面8是方面1至7所述的方法，其中所述第一药剂和第二药剂是不同的药剂。方面9是方面1至8所述的方法，其中所述第一药剂和第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面10是方面1至9所述的方法，其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子，并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面11是方面1至10所述的方法，其中所述第一药剂是核酸，并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面12是方面1至10所述的方法，其中所述第一药剂是多肽，并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面13是方面1至10所述的方法，其中所述第一药剂是蛋白质，并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面14是方面1至10所述的方法，其中所述第一药剂是小分子，并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面15是方面1至14所述的方法，其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子，并且其中所述第二药剂是核酸。方面16是方面1至14所述的方法，其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子，并且其中所述第二药剂是多肽。方面17是方面1至14所述的方法，其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子，并且其中所述第二药剂是蛋白质。方面18是方面1至14所述的方法，其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子，并且其中所述第二药剂是小分子。方面19是方面1至18所述的方法，其中所述核酸是rna，并且其中所述rna是mrna、mirna、shrna、sirna或反义寡核苷酸。方面20是方面1至19所述的方法，其中所述核酸是dna，并且其中所述dna是反义寡核苷酸、载体或双义线性dna。方面21是方面1至20所述的方法，其中所述蛋白质是核糖核蛋白。方面22是方面1至21所述的方法，其中所述核糖核蛋白包含cas9蛋白和指导rna。

55、方面23是电穿孔方法，其包括：(a)根据第一方案，使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含rna的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；(b)允许所述细胞样品恢复至少24小时；以及(c)根据第二方案，使所述细胞样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含rna的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。

56、方面24是电穿孔方法，其包括：(a)根据第一方案，使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含dna的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；(b)允许所述细胞样品恢复至少24小时；以及(c)根据第二方案，使所述细胞样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含dna的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。

57、方面25是电穿孔方法，其包括：(a)根据第一方案，使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含一种或更多种蛋白质的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；(b)允许所述细胞样品恢复至少24小时；以及(c)根据第二方案，使所述细胞样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含一种或更多种蛋白质的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。

58、方面26是连续编辑细胞的方法，其包括：(a)根据第一方案，使包含一个或更多个完整细胞的细胞样品经受第一电脉冲，所述第一电脉冲具有足以使细胞加载有包含核糖核蛋白的第一药剂的第一场强和第一脉冲持续时间；(b)允许所述细胞样品恢复至少24小时；以及(c)根据第二方案，使所述细胞样品经受第二电脉冲，所述第二电脉冲具有足以使细胞加载有包含核糖核蛋白的第二药剂的第二场强和第二脉冲持续时间；其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。

59、方面27是方面23至26所述的方法，其中所述第一药剂和第二药剂是相同的药剂。方面28是方面23至26所述的方法，其中所述第一药剂和第二药剂是不同的药剂。方面29是方面23至28所述的方法，其中所述第一药剂和第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面30是方面23至29所述的方法，其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子，并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面31是方面23至30所述的方法，其中所述第一药剂是核酸，并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面32是方面23至30所述的方法，其中所述第一药剂是多肽，并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面33是方面23至30所述的方法，其中所述第一药剂是蛋白质，并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面34是方面23至30所述的方法，其中所述第一药剂是小分子，并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面35是方面23至34所述的方法，其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子，并且其中所述第二药剂是核酸。方面36是方面23至34所述的方法，其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子，并且其中所述第二药剂是多肽。方面37是方面23至34所述的方法，其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子，并且其中所述第二药剂是蛋白质。方面38是方面23至34所述的方法，其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子，并且其中所述第二药剂是小分子。方面39是方面23至38所述的方法，其中所述核酸是rna，并且其中所述rna是mrna、mirna、shrna、sirna或反义寡核苷酸。方面40是方面23至39所述的方法，其中所述核酸是dna，并且其中所述dna是反义寡核苷酸、载体或双义线性dna。方面41是方面23至40所述的方法，其中所述蛋白质是核糖核蛋白。方面42是方面23至41所述的方法，其中所述核糖核蛋白包含cas9蛋白和指导rna。

60、方面43是方面1至42所述的方法，其还包括在所述第一电脉冲和/或第二电脉冲之后的静置步骤。方面44是方面1至43所述的方法，其还包括在所述第一电脉冲和/或第二电脉冲之后的静置步骤，其中所述静置步骤包括将所述样品孵育10至30分钟。方面45是方面1至44所述的方法，其还包括在所述第一电脉冲和/或第二电脉冲之后的静置步骤，其中所述静置步骤包括在25℃至50℃下孵育所述样品。方面46是方面1至45所述的方法，其还包括在所述第一电脉冲和/或第二电脉冲之后的静置步骤，其中所述静置步骤包括在3％至8％co2下孵育所述样品。方面47是方面1至46所述的方法，其中所述样品在所述第一电脉冲和/或第二电脉冲之后不经受静置步骤。方面48是方面1至47所述的方法，其中所述第一场强等于所述第二场强，并且其中所述第一脉冲持续时间长于所述第二脉冲持续时间。方面49是方面1至47所述的方法，其中所述第一场强等于所述第二场强，并且其中所述第一脉冲持续时间短于所述第二脉冲持续时间。方面50是方面1至47所述的方法，其中所述第一场强小于所述第二场强，并且其中所述第一脉冲持续时间等于所述第二脉冲持续时间。方面51是方面1至47所述的方法，其中所述第一场强大于所述第二场强，并且其中所述第一脉冲持续时间等于所述第二脉冲持续时间。方面52是方面1至47所述的方法，其中所述第一场强小于所述第二场强，并且其中所述第一脉冲持续时间长于所述第二脉冲持续时间。方面53是方面1至47所述的方法，其中所述第一场强大于所述第二场强，并且其中所述第一脉冲持续时间长于所述第二脉冲持续时间。方面54是方面1至47所述的方法，其中所述第一场强小于所述第二场强，并且其中所述第一脉冲持续时间短于所述第二脉冲持续时间。方面55是方面1至47所述的方法，其中所述第一场强大于所述第二场强，并且其中所述第一脉冲持续时间短于所述第二脉冲持续时间。方面56是方面1至55所述的方法，其中所述第一场强和第一脉冲持续时间产生第一总施加电能并且所述第二场强和第二脉冲持续时间产生第二总施加电能，并且其中所述第一总施加电能不同于所述第二总施加电能。方面57是方面1至56所述的方法，其中所述第一场强和第一脉冲持续时间产生第一总施加电能并且所述第二场强和第二脉冲持续时间产生第二总施加电能，其中所述第一总施加电能不同于所述第二总施加电能，并且其中所述第一总施加电能大于所述第二总施加电能。方面58是方面1至57所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数。方面59是方面1至58所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数，并且其中所述电脉冲的电压幅值为0.001伏特至10,000伏特、0.01伏特至10,000伏特、0.1伏特至10,000伏特、1伏特至10,000伏特、1伏特至9,000伏特、1伏特至8,000伏特、1伏特至7,000伏特、1伏特至6,000伏特、1伏特至5,000伏特、1伏特至4,000伏特、1伏特至3,000伏特、1伏特至2,000伏特、或1伏特至1,000伏特。方面60是方面1至59所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数，并且其中所述电脉冲的电压幅值为100伏特至900伏特。方面61是方面1至60所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数，并且其中所述样品的电导率是这样的参数的函数，所述参数包括电穿孔缓冲液的离子组成、待被加载到所述细胞中的药剂的浓度、细胞密度、温度和压力。方面62是方面1至61所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数，并且其中所述样品的电导率为0.01西门子/米至10西门子/米、0.01西门子/米至1西门子/米、0.1西门子/米至10西门子/米、0.1西门子/米至1西门子/米、或1西门子/米至10西门子/米。方面63是方面1至62所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数，并且其中所述样品的电导率为1.0至3.0西门子/米。方面64是方面1至63所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数，并且其中所述第一场强和第二场强还是电穿孔室的几何形状的函数。方面65是方面1至64所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数，其中所述第一场强和第二场强还是电穿孔室的几何形状的函数，并且其中所述电穿孔室包含0.001cm至10cm、0.001cm至1cm、0.01cm至10cm、0.01cm至1cm、0.1cm至10cm、0.1cm至1cm、或1cm至10cm的电极间隙。方面66是方面1至65所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数，其中所述第一场强和第二场强还是电穿孔室的几何形状的函数，并且其中所述电穿孔室包含0.01cm至1cm的电极间隙。方面67是方面1至66所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强为0.01kv/cm至10kv/cm、0.01kv/cm至1kv/cm、0.1kv/cm至10kv/cm、0.1kv/cm至1kv/cm、或1kv/cm至10kv/cm。方面68是方面1至67所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强为0.3kv/cm至3kv/cm。方面69是方面1至68所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一脉冲持续时间和第二脉冲持续时间为10-6秒至10秒、10-6秒至1秒、10-3秒至10秒、或10-3秒至1秒。方面70是方面1至69所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一脉冲持续时间和第二脉冲持续时间为1微秒至100毫秒。方面71是方面1至70所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征。方面72是方面1至71所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，并且其中所述脉冲数为1个脉冲至1000个脉冲、1个脉冲至900个脉冲、1个脉冲至800个脉冲、1个脉冲至700个脉冲、1个脉冲至600个脉冲、1个脉冲至500个脉冲、1个脉冲至400个脉冲、1个脉冲至300个脉冲、1个脉冲至200个脉冲、1个脉冲至100个脉冲、1个脉冲至90个脉冲、1个脉冲至80个脉冲、1个脉冲至70个脉冲、1个脉冲至60个脉冲、1个脉冲至50个脉冲、1个脉冲至40个脉冲、1个脉冲至30个脉冲、1个脉冲至20个脉冲、或1个脉冲至10个脉冲。方面73是方面1至72所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，并且其中所述脉冲数为1个脉冲至130个脉冲。方面74是方面1至73所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，并且其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数。方面75是方面1至74所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数，并且其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数。方面76是方面1至75所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数，其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数，并且其中所述样品的电阻为1欧姆至10000欧姆、1欧姆至9000欧姆、1欧姆至8000欧姆、1欧姆至7000欧姆、1欧姆至6000欧姆、1欧姆至5000欧姆、1欧姆至4000欧姆、1欧姆至3000欧姆、1欧姆至2000欧姆、1欧姆至1000欧姆、1欧姆至900欧姆、1欧姆至800欧姆、1欧姆至700欧姆、1欧姆至600欧姆、1欧姆至500欧姆、1欧姆至400欧姆、1欧姆至300欧姆、1欧姆至200欧姆、1欧姆至100欧姆、1欧姆至90欧姆、1欧姆至80欧姆、1欧姆至70欧姆、1欧姆至60欧姆、1欧姆至50欧姆、1欧姆至40欧姆、1欧姆至30欧姆、1欧姆至20欧姆、或1欧姆至10欧姆。方面77是方面1至76所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数，其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数，并且其中所述样品的电阻为1欧姆至1000欧姆。方面78是方面1至77所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数，其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数，并且其中所述电源电容为1μf至1,000,000μf、1μf至100,000μf、1μf至10,000μf、1μf至1,000μf、或1μf至100μf。方面79是方面1至78所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数，其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数，并且其中所述电源电容为1000μf至5000μf。方面80是方面1至79所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，并且其中所述脉冲形状是方波脉冲或指数衰减波脉冲。方面81是方面1至80所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，并且其中所述脉冲模式包括与所述第一脉冲或第二脉冲的持续时间相对应的单脉冲。方面82是方面1至81所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，并且其中所述脉冲模式包括多脉冲，其中所述多脉冲的组合持续时间与所述第一脉冲或第二脉冲的持续时间相对应。方面83是方面1至82所述的方法，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，并且其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的极性为正或负。方面84是方面1至83所述的方法，其中在所述样品经受所述第一脉冲之后至少12小时至至少48小时使所述样品经受所述第二电脉冲。方面85是方面1至84所述的方法，其中在所述样品经受所述第一脉冲之后至少24小时使所述样品经受所述第二电脉冲。方面86是方面1至85所述的方法，其中所述方法通过具有包含指令的非暂态计算机可读介质的电穿孔系统进行，所述指令当由处理器执行时引起所述处理器执行所述第一方案和第二方案以对所述样品进行电穿孔。方面87是方面1至86所述的方法，其中所述电穿孔系统包含流式电穿孔设备。方面88是方面1至87所述的方法，其中所述电穿孔系统包含流式电穿孔设备，并且其中当所述样品在所述流式电穿孔设备内流动时使所述样品经受所述电脉冲。方面89是方面1至88所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。方面90是方面1至89所述的方法，其中所述细胞是人细胞、鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞或灵长类细胞。方面91是方面1至90所述的方法，其中所述细胞是原代细胞。方面92是方面1至91所述的方法，其中所述细胞是经培养细胞。方面93是方面1至92所述的方法，其中所述细胞是经培养细胞，并且其中经培养细胞是经培养细胞系。方面94是方面1至93所述的方法，其中所述细胞是经培养细胞系，并且其中所述经培养细胞系包括3t3，697，10t1/2，1321n1，a549，ahr77，b-lcl，b16，b65，ba/f3，bhk，c2c12，c6，caco-2，cap，caski，chago-k-1，cho，cos，dg75，dld-1，el4，h1299，hacat，hap1，hct116，hek，hela，hepg2，hl60，hos，ht1080，ht29，huh-7，huvec，ins-1/grinch，jurkat，k46，k562，kg1，khyg-1，l5278y，l6，lncap，ls180，mcf7，mda-mb-231，me-180，mg-63，min-6，molt4，nalm6，nd7/23，ncuro2a.nk92，ns/θ，p3u1，panc-1，pc-3，pci2，per.c6，pm1，ramos，raw 264.7，rbl，renca，rle，sh-sy5y，sk-br-3，sk-mes-1，sk-n-sh，sk-ov-3，sp2/0，sw403，thp-1，u2os，u937，vero，yb2/0，或其衍生物。方面95是方面1至94所述的方法，其中所述细胞包括脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、角质形成细胞、肌细胞、神经元、骨细胞、外周血单个核细胞(pbmc)、脾细胞、干细胞或胸腺细胞。方面96是方面1至95所述的方法，其中所述细胞包括pbmc，并且其中所述pbmc是外周血淋巴细胞(pbl)。方面97是方面1至95所述的方法，其中所述细胞包括pbmc，其中所述pbmc包括pbl，并且其中所述pbl是自然杀伤(nk)细胞、t细胞或b细胞。方面98是方面1至95所述的方法，其中所述细胞包括pbmc，并且其中所述pbmc是单核细胞。方面99是方面1至95所述的方法，其中所述细胞包括pbmc，其中所述pbmc是单核细胞，并且其中所述单核细胞是巨噬细胞或树突细胞。方面100是方面1至95所述的方法，其中所述细胞包括pbmc，其中所述pbmc是单核细胞，其中所述单核细胞是巨噬细胞或树突细胞，并且其中所述巨噬细胞是小胶质细胞。方面101是方面1至95所述的方法，其中所述细胞包括干细胞，并且其中所述干细胞是脂肪干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞或神经干细胞。方面102是方面1至101所述的方法，其中所述药剂的加载效率为至少50％、60％、70％、80％或90％。方面103是方面1至102所述的方法，其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少50％。方面104是方面1至103所述的方法，其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少60％。方面105是方面1至104所述的方法，其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少70％。方面106是方面1至105所述的方法，其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少80％。方面107是方面1至106所述的方法，其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少90％。方面108是方面1至107所述的方法，其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至96小时有约50％至90％有生存力。方面109是方面1至108所述的方法，其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至72小时有约50％至90％有生存力。方面110是方面1至109所述的方法，其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至48小时有约50％至90％有生存力。方面111是方面1至110所述的方法，其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后24小时有约50％至90％有生存力。方面112是方面1至111所述的方法，其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至96小时有约60％至90％有生存力。方面113是方面1至112所述的方法，其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至72小时有约60％至90％有生存力。方面114是方面1至113所述的方法，其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至48小时有约60％至90％有生存力。方面115是方面1至114所述的方法，其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后24小时有约60％至90％有生存力。

61、方面116是使用方面1至115所述的方法产生的经电穿孔的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡。

62、方面117是电穿孔系统，其具有包含指令的非暂态计算机可读介质，所述指令当由处理器执行时引起所述处理器进行以下：选择与具有第一场强和第一脉冲持续时间的第一电脉冲相关的第一方案；根据所述第一方案，使包含一个或更多个完整的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡的样品经受由所述第一方案限定的所述第一电脉冲，所述第一电脉冲足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第一药剂；选择与具有第二场强和第二脉冲持续时间的第二电脉冲相关的第二方案；以及根据所述第二方案，使所述样品经受由所述第二方案限定的所述第二电脉冲，所述第二电脉冲足以使所述细胞、细胞颗粒或脂质囊泡加载有第二药剂；其中所述第一场强和/或所述第一脉冲持续时间不同于所述第二场强和/或第二脉冲持续时间。方面118是方面117所述的电穿孔系统，其中所述第一场强等于所述第二场强，并且其中所述第一脉冲持续时间长于所述第二脉冲持续时间。方面119是方面117所述的电穿孔系统，其中所述第一场强等于所述第二场强，并且其中所述第一脉冲持续时间短于所述第二脉冲持续时间。方面120是方面117所述的电穿孔系统，其中所述第一场强小于所述第二场强，并且其中所述第一脉冲持续时间等于所述第二脉冲持续时间。方面121是方面117所述的电穿孔系统，其中所述第一场强大于所述第二场强，并且其中所述第一脉冲持续时间等于所述第二脉冲持续时间。方面122是方面117所述的电穿孔系统，其中所述第一场强小于所述第二场强，并且其中所述第一脉冲持续时间长于所述第二脉冲持续时间。方面123是方面117所述的电穿孔系统，其中所述第一场强大于所述第二场强，并且其中所述第一脉冲持续时间长于所述第二脉冲持续时间。方面124是方面117所述的电穿孔系统，其中所述第一场强小于所述第二场强，并且其中所述第一脉冲持续时间短于所述第二脉冲持续时间。方面125是方面117所述的电穿孔系统，其中所述第一场强大于所述第二场强，并且其中所述第一脉冲持续时间短于所述第二脉冲持续时间。方面126是方面117至方面125所述的电穿孔系统，其中所述第一场强和第一脉冲持续时间产生第一总施加电能并且所述第二场强和第二脉冲持续时间产生第二总施加电能，并且其中所述第一总施加电能不同于所述第二总施加电能。方面127是方面117至方面126所述的电穿孔系统，其中所述第一场强和第一脉冲持续时间产生第一总施加电能并且所述第二场强和第二脉冲持续时间产生第二总施加电能，其中所述第一总施加电能不同于所述第二总施加电能，并且其中所述第一总施加电能大于所述第二总施加电能。方面128是方面117至方面127所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数。方面129是方面117至方面128所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数，并且其中所述电脉冲的电压幅值为0.001伏特至10,000伏特、0.01伏特至10,000伏特、0.1伏特至10,000伏特、1伏特至10,000伏特、1伏特至9,000伏特、1伏特至8,000伏特、1伏特至7,000伏特、1伏特至6,000伏特、1伏特至5,000伏特、1伏特至4,000伏特、1伏特至3,000伏特、1伏特至2,000伏特、或1伏特至1,000伏特。方面130是方面117至方面129所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数，并且其中所述电脉冲的电压幅值为100伏特至900伏特。方面131是方面117至方面130所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数，并且其中所述样品的电导率是这样的参数的函数，所述参数包括电穿孔缓冲液的离子组成、待被加载到细胞中的药剂的浓度、细胞密度、温度和压力。方面132是方面117至方面131所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数，并且其中所述样品的电导率为0.01西门子/米至10西门子/米、0.01西门子/米至1西门子/米、0.1西门子/米至10西门子/米、0.1西门子/米至1西门子/米、或1西门子/米至10西门子/米。方面133是方面117至方面132所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数，并且其中所述样品的电导率为1.0至3.0西门子/米。方面134是方面117至方面133所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数，并且其中所述第一场强和第二场强还是电穿孔室的几何形状的函数。方面135是方面117至方面134所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数，其中所述第一场强和第二场强还是电穿孔室的几何形状的函数，并且其中所述电穿孔室包含0.001cm至10cm、0.001cm至1cm、0.01cm至10cm、0.01cm至1cm、0.1cm至10cm、0.1cm至1cm、或1cm至10cm的电极间隙。方面136是方面117至方面135所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强是所述电脉冲的电压幅值、所述电脉冲的持续时间和所述样品的电导率的函数，其中所述第一场强和第二场强还是电穿孔室的几何形状的函数，并且其中所述电穿孔室包含0.01cm至1cm的电极间隙。方面137是方面117至方面136所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强为0.01kv/cm至10kv/cm、0.01kv/cm至1kv/cm、0.1kv/cm至10kv/cm、0.1kv/cm至1kv/cm、或1kv/cm至10kv/cm。方面138是方面117至方面137所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一场强和第二场强为0.3kv/cm至3kv/cm。方面139是方面117至方面138所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一脉冲持续时间和第二脉冲持续时间为10-6秒至10秒、10-6秒至1秒、10-3秒至10秒、或10-3秒至1秒。方面140是方面117至方面139所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的所述第一脉冲持续时间和第二脉冲持续时间为1微秒至100毫秒。方面141是方面117至方面140所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征。方面142是方面117至方面141所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，并且其中所述脉冲数为1个脉冲至1000个脉冲、1个脉冲至900个脉冲、1个脉冲至800个脉冲、1个脉冲至700个脉冲、1个脉冲至600个脉冲、1个脉冲至500个脉冲、1个脉冲至400个脉冲、1个脉冲至300个脉冲、1个脉冲至200个脉冲、1个脉冲至100个脉冲、1个脉冲至90个脉冲、1个脉冲至80个脉冲、1个脉冲至70个脉冲、1个脉冲至60个脉冲、1个脉冲至50个脉冲、1个脉冲至40个脉冲、1个脉冲至30个脉冲、1个脉冲至20个脉冲、或1个脉冲至10个脉冲。方面143是方面117至方面142所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，并且其中所述脉冲数为1个脉冲至130个脉冲。方面144是方面117至方面143所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，并且其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数。方面145是方面117至方面144所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数，并且其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数。方面146是方面117至方面145所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数，其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数，并且其中所述样品的电阻为1欧姆至10000欧姆、1欧姆至9000欧姆、1欧姆至8000欧姆、1欧姆至7000欧姆、1欧姆至6000欧姆、1欧姆至5000欧姆、1欧姆至4000欧姆、1欧姆至3000欧姆、1欧姆至2000欧姆、1欧姆至1000欧姆、1欧姆至900欧姆、1欧姆至800欧姆、1欧姆至700欧姆、1欧姆至600欧姆、1欧姆至500欧姆、1欧姆至400欧姆、1欧姆至300欧姆、1欧姆至200欧姆、1欧姆至100欧姆、1欧姆至90欧姆、1欧姆至80欧姆、1欧姆至70欧姆、1欧姆至60欧姆、1欧姆至50欧姆、1欧姆至40欧姆、1欧姆至30欧姆、1欧姆至20欧姆、或1欧姆至10欧姆。方面147是方面117至方面146所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数，其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数，并且其中所述样品的电阻为1欧姆至1000欧姆。方面148是方面117至方面147所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数，其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数，并且其中所述电源电容为1μf至1,000,000μf、1μf至100,000μf、1μf至10,000μf、1μf至1,000μf、或1μf至100μf。方面149是方面117至方面148所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，其中所述脉冲宽度是指数衰减率的函数，其中所述指数衰减率是所述样品的电阻和用于实现电穿孔的电源的电容的函数，并且其中所述电源电容为1000μf至5000μf。方面150是方面117至方面149所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，其中所述脉冲形状是方波脉冲或指数衰减波脉冲。方面151是方面117至方面150所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲还包含与脉冲数、宽度、形状、模式或极性相关的特征，其中所述脉冲模式包括与所述第一脉冲或第二脉冲的持续时间相对应的单脉冲。方面152是方面117至方面150所述的电穿孔系统，其中所述脉冲模式包括多脉冲，其中所述多脉冲的组合持续时间与所述第一脉冲或第二脉冲的持续时间相对应。方面153是方面117至方面152所述的电穿孔系统，其中所述第一电脉冲和第二电脉冲的极性为正或负。方面154是方面117至方面153所述的电穿孔系统，其中在所述样品经受所述第一脉冲之后至少12小时至至少48小时使所述样品经受所述第二电脉冲。方面155是方面117至方面154所述的电穿孔系统，其中在所述样品经受所述第一脉冲之后至少24小时使所述样品经受所述第二电脉冲。方面156是方面117至方面155所述的电穿孔系统，其中所述电穿孔系统包含流式电穿孔设备。方面157是方面117至方面156所述的电穿孔系统，其中所述电穿孔系统包含流式电穿孔设备，并且其中当所述样品在所述流式电穿孔设备内流动时使所述样品经受所述电脉冲。方面158是方面117至方面157所述的电穿孔系统，其中所述细胞是哺乳动物细胞。方面159是方面117至方面158所述的电穿孔系统，其中所述细胞是人细胞、鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞或灵长类细胞。方面160是方面117至方面159所述的电穿孔系统，其中所述细胞是原代细胞。方面161是方面117至方面160所述的电穿孔系统，其中所述细胞是经培养细胞。方面162是方面117至方面161所述的电穿孔系统，其中所述细胞是经培养细胞，并且其中所述经培养细胞是经培养细胞系。方面163是方面117至方面162所述的电穿孔系统，其中所述细胞是经培养细胞系，并且其中所述经培养细胞系包括3t3，697，10t1/2，1321n1，a549，ahr77，b-lcl，b16，b65，ba/f3，bhk，c2c12，c6，caco-2，cap，caski，chago-k-1，cho，cos，dg75，dld-1，el4，h1299，hacat，hap1，hct116，hek，hela，hepg2，hl60，hos，ht1080，ht29，huh-7，huvec，ins-1/grinch，jurkat，k46，k562，kg1，khyg-1，l5278y，l6，lncap，ls180，mcf7，mda-mb-231，me-180，mg-63，min-6，molt4，nalm6，nd7/23，neuro2a，nk92，ns/0，p3u1，panc-1，pc-3，pc12，per.c6，pm1，ramos，raw 264.7，rbl，renca，rle，sh-sy5y，sk-br-3，sk-mes-1，sk-n-sh，sk-ov-3，sp2/0，sw403，thp-1，u2os，u937，vero，yb2/0，或其衍生物。方面164是方面117至方面163所述的电穿孔系统，其中所述细胞包括脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、角质形成细胞、肌细胞、神经元、骨细胞、外周血单个核细胞(pbmc)、脾细胞、干细胞或胸腺细胞。方面165是方面117至方面164所述的电穿孔系统，其中所述细胞包括pbmc，并且其中所述pbmc是外周血淋巴细胞(pbl)。方面166是方面117至方面164所述的电穿孔系统，其中所述细胞包括pbmc，其中所述pbmc是pbl，并且其中所述pbl是自然杀伤(nk)细胞、t细胞或b细胞。方面167是方面117至方面164所述的电穿孔系统，其中所述细胞包括pbmc，并且其中所述pbmc是单核细胞。方面168是方面117至方面164所述的电穿孔系统，其中所述细胞包括pbmc，其中所述pbmc是单核细胞，并且其中所述单核细胞是巨噬细胞或树突细胞。方面169是方面117至方面164所述的电穿孔系统，其中所述细胞包括pbmc，其中所述pbmc是单核细胞，其中所述单核细胞是巨噬细胞或树突细胞，并且其中所述巨噬细胞是小胶质细胞。方面170是方面117至方面164所述的电穿孔系统，其中所述细胞包括干细胞，其中所述干细胞是脂肪干细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞或神经干细胞。方面171是方面117至方面170所述的电穿孔系统，其中所述第一药剂和第二药剂是相同的药剂。方面172是方面117至方面170所述的电穿孔系统，其中所述第一药剂和第二药剂是不同的药剂。方面173是方面117至172所述的方法，其中所述第一药剂和第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面174是方面117至173所述的方法，其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子，并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面175是方面117至174所述的方法，其中所述第一药剂是核酸，并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面176是方面117至174所述的方法，其中所述第一药剂是多肽，并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面177是方面117至174所述的方法，其中所述第一药剂是蛋白质，并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面178是方面117至174所述的方法，其中所述第一药剂是小分子，并且其中所述第二药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子。方面179是方面117至178所述的方法，其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子，并且其中所述第二药剂是核酸。方面180是方面117至178所述的方法，其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子，并且其中所述第二药剂是多肽。方面181是方面117至178所述的方法，其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子，并且其中所述第二药剂是蛋白质。方面182是方面117至178所述的方法，其中所述第一药剂是核酸、多肽、蛋白质或小分子，并且其中所述第二药剂是小分子。方面183是方面117至182所述的方法，其中所述核酸是rna，并且其中所述rna是mrna、mirna、shrna、sirna或反义寡核苷酸。方面184是方面117至183所述的方法，其中所述核酸是dna，并且其中所述dna是反义寡核苷酸、载体或双义线性dna。方面185是方面117至184所述的方法，其中所述蛋白质是核糖核蛋白。方面186是方面117至185所述的方法，其中所述核糖核蛋白包含cas9蛋白和指导rna。方面187是方面117至186所述的方法，其中所述药剂的加载效率为至少50％、60％、70％、80％或90％。方面188是方面117至187所述的方法，其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少50％。方面189是方面117至188所述的方法，其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少60％。方面190是方面117至189所述的方法，其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少70％。方面191是方面117至190所述的方法，其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少80％。方面192是方面117至191所述的方法，其中细胞生存力在所述第二电脉冲之后12至96小时为至少90％。方面193是方面117至192所述的方法，其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至96小时有约50％至90％有生存力。方面194是方面117至193所述的方法，其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至72小时有约50％至90％有生存力。方面195是方面117至194所述的方法，其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至48小时有约50％至90％有生存力。方面196是方面117至195所述的方法，其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后24小时有约50％至90％有生存力。方面197是方面117至196所述的方法，其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至96小时有约60％至90％有生存力。方面198是方面117至197所述的方法，其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至72小时有约60％至90％有生存力。方面199是方面117至198所述的方法，其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后12至48小时有约60％至90％有生存力。方面200是方面117至199所述的方法，其中经电穿孔细胞在所述第二电脉冲之后24小时有约60％至90％有生存力。

63、方面201是使用方面117至200所述的电穿孔系统产生的经电穿孔的细胞、细胞颗粒或脂质囊泡。

64、在本技术通篇，如涉及电穿孔靶标或用于递送药剂、药物或治疗剂的载剂的术语“细胞”或“递送载剂”意指包括生物学意义上的人或动物细胞。

65、本文中使用的术语“能/能量”是指在向样品施加电脉冲(或组合脉冲)期间产生的热，并且其与在电脉冲(或组合脉冲)期间向样品施加的场强和脉冲持续时间(或组合脉冲持续时间)二者均成比例。因此，为了向样品施加“高能量”脉冲，对变量包括场强和脉冲持续时间(或组合脉冲持续时间)的比例进行修改，使得与当向样品施加“中等能量”或“低能量”电脉冲(或组合脉冲)时相比，在电脉冲(或组合脉冲)期间产生更大量的热，前提是缓冲液组成、处理组件和样品体积保持恒定。相反地，为了向样品施加“低能量”脉冲，对变量包括场强和脉冲持续时间(或组合脉冲持续时间)的比例进行修改，使得与当向样品施加“高能量”或“中等能量”电脉冲(或组合脉冲)时相比，在电脉冲(或组合脉冲)期间产生更少量的热，前提是缓冲液组成、处理组件和样品体积保持恒定。

66、在本技术通篇，术语“约”、“基本上”和“大约”用于指示这样的值，所述值包括用于测量或定量方法的误差的固有变化。

67、当与术语“包含/包括”结合使用时，没有数量词修饰的名词的使用可意指“一个/种”，但是其也符合“一个/种或更多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义。

68、短语“和/或”意指“和”或者“或”。为了举例说明，a、b和/或c包括：单独的a、单独的b、单独的c、a和b的组合、a和c的组合、b和c的组合、或a、b和c的组合。换言之，“和/或”作为包含性的或来使用。

69、组合物及其使用方法可以“包含/包括”在本说明书通篇公开的任何成分或步骤、“基本上由其组成”或“由其组成”。“基本上由”任何公开的成分或步骤组成的组合物和方法将权利要求书的范围限制在不实质影响本公开内容的基本特征和新特征的特定材料或步骤。如在本说明书和权利要求书中使用的，词语“包含(comprising)”(及其任何形式，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(及其任何形式，例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(及其任何形式，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(及其任何形式，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包含性的或开放式的，并且不排除另外的未记载的要素或方法步骤。预期在术语“包含/包括”的背景下的本文中所述的一些方面也可以在术语“由......组成”或“基本上由......组成”的背景下实施。

70、特别预期了关于本公开内容的一个方面所讨论的任何限制均可应用于本公开内容的任何其他方面。此外，本公开内容的任何组合物均可用于本公开内容的任何方法中，并且本公开内容的任何方法均可用于产生或利用本公开内容的任何组合物。在实例中阐述的方面中的一些方面也是可以在不同实例中的其他地方或在本技术的其他地方(例如在
技术实现要素：
、具体实施方式、权利要求书和附图说明中)讨论的方面的背景下实施的方面。

71、根据以下详细描述，本公开内容的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应当理解，详细描述和具体实例虽然指示了本公开内容的一些具体方面，但仅通过举例说明的方式给出，因为根据该详细描述，在本公开内容的精神和范围内的多种改变和修改对于本领域技术人员将变得明显。