一种细胞毒素衍生物及制备方法与应用与流程

本发明涉及细胞毒素——海兔毒素衍生物，特别是一种单甲基奥瑞他汀e的衍生物及制备方法与应用。

背景技术：

1、海兔毒素dolastatin 10是从印度洋海兔中提取并分离得到的具有抗肿瘤活性的直链肽类化合物，具有显著的抗癌活性和独特的化学结构。海兔毒素dolastatin 10属于微管类抑制剂，其作用机理是能够与微管蛋白结合，通过破坏肿瘤细胞的细胞骨架结构并干扰有丝分裂来杀死肿瘤细胞。

2、单甲基奥瑞他汀e（monomethyl auristatin e，mmae）是海兔毒素10（dolastatin10）的合成衍生物，海兔毒素10的合成衍生物除了mmae，还有单甲基奥瑞他汀f（mmaf），具体化学结构式如下：。

3、上述二者均被用于抗体药物偶联物(antibody drug conjugate，简称adc)的载荷成分，即adc毒素。抗体药物偶联物adc是一类新型的抗肿瘤药物，它结合了抗体的靶向能力和细胞毒素的抗癌能力，其原理是将细胞毒素连接在抗体上，通过抗体对癌细胞表面特定抗原的识别，经过内吞作用进入癌细胞，从而将细胞毒素传递到靶点，达到靶向性治疗恶性肿瘤的目的。与传统治疗肿瘤的小分子化学药物相比，adc具有精准靶向的特点，降低了小分子药物的脱靶毒性，具有更好的临床安全性。结构上，adc包括三个不同的组成部分，即抗体、连接子和细胞毒素。抗体具有高特异性和高亲和力，负责将adc引导至癌细胞。连接子一端连接抗体，另一端连接细胞毒素，连接子在血液转运过程中要保持相对稳定，而到达肿瘤细胞后，可以释放细胞毒素以发挥对癌细胞的杀伤作用。细胞毒素根据目前临床上作用机制的不同，可以分为微管类抑制剂（microtubule inhibitors），dna损伤剂（dna damagingagents），rna聚合酶抑制剂（rna polymerase inhibitors）等。

4、目前，全球申请上市的15款adc药物中，已有5款选用mmae，1款选用mmaf作为毒素部分，总占比40.0%，据相关报道，临床阶段的adc药物中，选择mmae作为毒素的临床adc研究项目中，其占比也排在前列，由此可见，mmae已广泛应用于adc药物与研究中。

5、对于mmae的多样性研究结果表明，其结构改造主要集中在n端，如专利cn105143199a，对中间部位的多样性研究较少，因此，开展对其中间部位的多样性修饰具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种海兔毒素的衍生物及其制备方法与应用。

2、本技术首次提出一种新型抗体药物偶联物毒素，其可以作为细胞毒素分子，用于adc药物。

3、一种细胞毒素衍生物，其具有如下结构式（i）：（i）；其中，r选自1-6个碳原子的烷基。

4、烷基的非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基、2-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、环戊基、1-甲基戊基、3-甲基戊基、2-乙基戊基、4-甲基-2-戊基、正己基、1-甲基己基、2-乙基己基、2-丁基己基、环己基、4-甲基环己基、4-叔丁基环己基。

5、进一步的，r选自甲基。

6、作为具体化合物，所述衍生物选自以下结构式：。

7、所述衍生物的制备方法，由脱保护制得。进一步的，由发生取代反应或缩合反应得到；其中，r2选自h或*表示连接位点；r选自1-6个碳原子的烷基；g表示保护基，选自叔丁氧羰基boc、三氯乙氧羰基troc、烯丙氧羰基alloc、9-芴甲氧羰基fmoc。特别地，g选自boc或fmoc。

8、进一步的，所述化合物d由脱保护得到；所述化合物c由发生取代或缩合反应得到；r1选自h或，*表示连接位点；g的含义如上所述。

9、具体的，当r2选自h时，生成化合物f反应为缩合反应；当r2选自时，生成化合物f为取代反应。

10、具体的，当r1选自h时，生成化合物c反应为缩合反应；当r1选自时，生成化合物c为取代反应。

11、作为总结，所述衍生物可通过如下路线制备：。

12、当发生缩合反应时，反应底物在溶剂中，使用缩合剂得到。溶剂可选自二氯甲烷、四氢呋喃或1,4-二氧六环；缩合剂选自2-溴-1-乙基吡啶四氟硼酸盐、o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n′,n′-四甲基脲六氟磷酸酯、三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐、1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n′,n′-四甲基脲六氟磷酸酯或三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐。

13、当发生取代反应时，反应底物在溶剂中，所述溶剂可以选自n,n-二甲基乙酰胺、n,n-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或二氯甲烷。

14、具体的，生成化合物c的缩合反应条件如下：化合物a-1和b溶于溶剂中，降温至0~5℃，在缩合试剂存在的条件下，发生缩合反应；溶剂可以选自二氯甲烷、四氢呋喃、1,4-二氧六环，缩合试剂选自2-溴-1-乙基吡啶四氟硼酸盐、o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n′,n′-四甲基脲六氟磷酸酯或三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐。

15、具体的，生成化合物f的缩合反应条件如下：生成化合物f的缩合反应包括如下条件：化合物e-2和化合物d在溶剂中，加入缩合试剂后降温至0~5℃，之后加入碱，升温至室温，发生缩合反应；溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃、1,4-二氧六环；碱选自三乙胺或n,n-二异丙基乙胺；缩合试剂选自1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n′,n′-四甲基脲六氟磷酸酯或三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐。

16、具体的，生成化合物c取代反应条件如下：化合物a-2和化合物b在溶剂中，降温至0~5℃，加入碱，发生取代反应；其中，溶剂可以选自二氯甲烷、四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺，碱可以选自n,n-二异丙基乙胺、三乙胺、n-甲基吗啡啉。

17、具体的，生成化合物f的取代反应条件如下：化合物e-2和化合物d在溶剂中，发生取代反应；其中，溶剂可以选自n,n-二甲基乙酰胺、n,n-二甲基甲酰胺、四氢呋喃。

18、进一步的，当化合物a中r1选自时，可通过制备。

19、当化合物e中r2选自时，可通过制备。

20、更进一步的，化合物a-1或化合物e-1在溶剂中，加入活化试剂和缩合试剂，发生缩合反应得到。溶剂可以选自二氯甲烷、四氢呋喃、1,4-二氧六环，缩合试剂可以选自n,n'-二环己基碳二亚胺、n, n'-二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。活化试剂选自n-羟基丁二酰亚胺。

21、生成化合物a-2的反应条件如下：化合物a-1溶于溶剂中，加入活化试剂，降温至0~5℃，加入缩合试剂，升温至室温，发生缩合反应后，过滤，浓缩；溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃、1,4-二氧六环，缩合试剂选自n,n'-二环己基碳二亚胺、n, n'-二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；活化试剂选自n-羟基丁二酰亚胺。

22、生成化合物e-2的反应条件：化合物e-1溶于溶剂中，加入活化剂，加入缩合剂，发生缩合反应，过滤，浓缩；溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃、1,4-二氧六环，缩合试剂选自n,n'-二环己基碳二亚胺、n, n'-二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；活化试剂选自n-羟基丁二酰亚胺。

23、进一步的，上述合成路线中，生成化合物d与化合物（i）为通过脱除氨基保护基g得到。以g选自boc为例，脱boc条件为：在酸性条件下，将化合物c或化合物f溶解在溶剂中，发生脱保护反应，得到反应产物。所述酸性条件可以选用三氟乙酸、盐酸，甲酸，对甲苯磺酸。所述溶剂，选自二氯甲烷、四氢呋喃、1,4-二氧六环、n,n-二甲基甲酰胺。

24、进一步的，化合物a的合成方法如下所示：。

25、具体的，化合物a2通过如下方法制备：在0~5℃，将化合物a1在溶剂中，与缩合试剂，在催化剂条件下，发生缩合反应；溶剂选自二氯甲烷、丙酮、苯、甲苯、四氢呋喃；催化剂选自对甲苯磺酸一水合物、三氟化硼乙醚；缩合试剂选自2,2-二甲氧基丙烷。

26、具体的，化合物a3通过如下方法制备：在0~5℃，在格式试剂溶液中，加入化合物a2的溶剂，发生格式反应，反应时间1~2h后，降温至-10~0℃，经过淬灭，萃取，纯化后得到化合物a3；溶剂选自乙醚、四氢呋喃，格式试剂选自甲基碘化镁乙醚溶液、甲基溴化镁乙醚溶液、甲基氯化镁乙醚溶液。

27、具体的，化合物a4通过如下方法制备：化合物a3在溶剂中，与脱水剂存在的条件下，发生消除反应；溶剂选自甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃，脱水剂选自burgess reagent或在碱性条件下使用甲基磺酰氯或氯化亚砜，碱选自三乙胺、吡啶。更具体的，当使用burgessreagent做脱水剂时，化合物a3加入溶剂和burgess reagent后，升温至45~55℃反应1~3h后，降温至室温，之后洗涤，干燥，过滤浓缩。当在碱性条件下使用甲基磺酰氯或氯化亚砜时，化合物a3加入溶剂后，降温至0~5℃，加入碱与甲基磺酰氯或碱与氯化亚砜后升至室温，之后洗涤，干燥，过滤浓缩。

28、具体的，化合物a通过如下方法制备：将化合物a4溶于溶剂，降温至0~5℃，在酸性条件下加入氧化剂后，升至室温反应4-6h，发生脱保护氧化反应；溶剂选自丙酮、甲醇、n,n-二甲基甲酰胺，所述酸性条件为加入盐酸、硫酸、三氟乙酸或对甲苯磺酸，氧化试剂可以选自jones reagent、重铬酸吡啶盐、高碘酸与三氧化铬混合物。

29、化合物b的合成路线如下：

30、。

31、上述合成路线中，基于本领域技术人员熟知，为缩合反应，脱保护反应，在此不做详细描述实验步骤和方法。

32、本发明与现有技术相比，其显著优点是：本发明提供的单甲基奥瑞他汀e（monomethyl auristatin e，mmae）的衍生物，在val片段上将其中一个甲基变成了烯基，形成了全新的化合物，经体外细胞活性实验表明，所述化合物对肿瘤细胞具有较好的抑制作用，具有潜在成药的可能性。与mmae传统的n端连接子连接方式不同，本发明提供的衍生物分子结构中存在的双键，可以与adc的连接子进行连接，新连接位点的结合形成连接子—毒素部分，在adc分子空间结构中表现出差异性，对药物在体内传递吸收起到优化调节作用。作为adc的药物中常用的“弹头”分子，本发明提供的衍生物可以为adc药物提供细胞毒素的多样性，为药物研究和开发提供更多选择。