专利名称:一种高温α-淀粉酶及其突变体的高效制备方法
技术领域：
本发明为使用芽孢杆菌宿主细胞对具有淀粉水解活性的高温α “淀粉酶及其突 变体进行高效制备的方法。本发明中的具有淀粉水解活性的高温α-淀粉酶来源于地衣芽 孢杆菌菌株，高温α-淀粉酶突变体来源于地衣芽孢杆菌菌株的α-淀粉酶人工突变体。 进一步，本发明使用特定表达载体在芽孢杆菌，特别是地衣芽孢杆菌宿主细胞中，对高温 α-淀粉酶及其突变体进行高效分泌表达与制备。本发明属发酵工程领域。
背景技术：
淀粉是由葡萄糖聚合形成的一类高分子物质。淀粉由直链淀粉和支链淀粉两部分 组成。淀粉粒一般为圆形或不规则形，大小为1-100μπι，以内部氢键维持其结构。淀粉颗粒 内部为复杂的结晶组织，由于水分损失等原因位于颗粒表面的成分形成一种结构紧密的外 膜，对外力具有较强的抵抗力。因此，淀粉颗粒不溶于水和有机溶剂。淀粉是工业上制取葡 萄糖和糊精的主要原料。传统的方法用酸将淀粉水解成小分子的糊精和葡萄糖，这种方法 目前已被α“淀粉酶和糖化酶组成的酶法水解工艺所取代。
淀粉作为原料在工业中的应用，其最主要的方式是将淀粉水解成葡萄糖、麦芽糖 或者寡糖糖浆。这些糖浆随后被用作原料用于如酒精、有机酸、氨基酸等工业生产或直接作 为产品用于其他工业领域。淀粉水解工艺过程常常包括以下两个步骤液化和糖化。在淀 粉液化过程中，淀粉颗粒在冷水中形成乳浊液，在加热到60 70°C后，淀粉颗粒吸水膨胀， 体积迅速增加，晶体结构被破坏，颗粒外膜裂开，形成一种糊状的粘稠液体(这一过程称为 糊化)。浓度较高的淀粉液糊化时，必须迅速液化，否则淀粉液的粘度急剧上升会使设备无 法运行，另外已经糊化的淀粉在温度降低后会发生老化而无法液化。因此，用于淀粉液化的 α -淀粉酶，必须至少能耐受淀粉糊化所需温度。淀粉糊化后，分子链直接暴露在酶分子的 作用之下，分子链被迅速切断，变短，最终形成低分子量的糊精，液体粘度急剧下降，这一过 程被称为液化。现行大规模工业化淀粉水解工艺中的主流工艺为瞬间高温喷射液化，液化 时淀粉醪的内部温度达到105°C以上。此外，目前绝大多数以淀粉为原料的制糖和发酵工艺 中皆采用废液回流策略，淀粉醪的PH值会因此降至5.0以下。因此，在高温和酸性条件下 具有高活性的α-淀粉酶对淀粉液化工艺的优化和简化具有极其重要的价值。
目前，高温α -淀粉酶主要来源于地衣芽孢杆菌菌株。1972年，地衣芽孢杆菌已被 大规模应用于淀粉酶的发酵生产，1981年，《食品化学品索引》(FoodChemicals Codex)将 地衣芽孢杆菌列为食品加工用淀粉酶和蛋白酶的来源。1981年，由地衣芽孢杆菌生产的淀 粉水解酶和蛋白酶被美国FDA鉴定为GRAS级。可见，地衣芽孢杆菌是生产高温α-淀粉酶 的、安全性能良好的生产菌株。
获得酸性高温α-淀粉酶的方式概括起来有两种。一种是在原有地衣芽孢杆 菌高温α-淀粉酶的基础上，通过自然筛选、基因克隆、蛋白质工程等有关手段对蛋白 质分子进行改造，以此获得耐高温、耐酸性性能提高的高温α-淀粉酶突变体(Lee et al. J Biochem,2006 ；Declerck et al.Protein Eng,2003 ；Andrew et al. Curr OpinBiotechnol, 1999)；另一种是从自然界中寻找高温酸性α -淀粉酶新型分子(Jorgenson et al, Appl Environ Microbiol, 1997 ；Richardson et al. J Biol Chem,2003), 如 Pyrococcus sp.的α -淀粉酶，但产酶水平不到2U/mL。
无论是通过哪一种方式，所获得的在高温酸性条件下具有高活性的α -淀粉酶分 子，必须经过高效和廉价制备，才会具有工业应用意义。进一步，地衣芽孢杆菌高温α-淀 粉酶(Bacillus Iicheniformis α -amylase, BLA)在工业应用中使用多年，如果能够实现 BLA及其突变体的高效和廉价制备，则一方面可以进一步降低其生产成本，为多种工业应用 用途提供廉价的不同适宜性能的高温α-淀粉酶；另一方面也可以提高相关应用工艺技术 的完善与优化，简化如燃料酒精工业生产时制糖过程的酸碱度调节工艺。
与其它几乎所有发酵工业相似，实现高温α -淀粉酶的高效和廉价制备主要依 赖1)优良生产菌株的选育；2)优秀的发酵工艺技术。
在菌种选育方面，可以通过自然筛选、人工诱变、原生质体融合等随机性较大的育 种技术，也可以通过基因克隆与重组等目的性明确的育种技术，实现对BLA生产菌株的生 产性状的遗传改良(诸葛键王正祥。中国轻工业出版社，1994)。由于酶基因通常以单拷贝 存在于生产菌株中，酶分子象其它蛋白分子一样，是由其编码基因序列中相邻三个核苷酸 组成的所谓“三联密码子”决定其氨基酸残基组成与序列的；而氨基酸残基组成与排序又决 定了酶分子的基本生化特征和酶学特性以及其工业应用属性；并且，所有生物体都存在密 码子使用偏好性(即，编码基因中的密码子如全为高频使用的密码子，则该基因的翻译速 度与效率会最高)。因此，通过提高编码基因拷贝数、增强启动子强度、优化密码子组成等可 以提高此基因的翻译水平与效率；通过改变密码子并由此改变酶分子的特定氨基酸残基组 成，则可以获得生化性能不同的新酶分子(突变体)。
在发酵工艺优化方面，可以通过培养基优化、培养与发酵条件优化与智能控制、发 酵罐性能改进、发酵液提取新技术的研究与应用等进一步完善和实现BLA的高效、低成本 和规模化制备。
目前，BLA工业生产菌株在工业化生产状态下的产酶水平维持在6 IOmg/ mL左右，与其可能达到20mg/mL以上的蛋白分泌潜力(Veith et al. J MolMicrobiol Biotechnol, 2004)尚有较大空间。因此，进一步提高BLA生产菌株的高温α -淀粉酶产酶 水平，在理论上存在巨大空间，在现实条件下也有提升的基础和实际需要。这也将对BLA及 其突变体的发酵制造成本的降低、发酵制造工艺的简化以及发酵工业环境压力的降低产生 重要作用。
发明内容
BLA是目前淀粉水解酶系的工业应用中最大宗酶制剂之一，也是目前唯一实现规 模化工业生产和工业应用的高温型α-淀粉酶。改善和提高BLA及其突变体的制造技术水 平，由此降低其制造成本以及简化其制造工艺是实现和完善其工业应用所必需。同样，在不 同环境条件下，如不同温度、不同ΡΗ，特别是在高温、低ρΗ条件下的淀粉水解中具有较高活 性的BLA突变体的商业提供，为淀粉水解与淀粉生物加工工业所期待。
本发明的目的是获得一种BLA及其突变体的高效、低成本制备方法，用于BLA及其 突变体的工业化制备，由此可降低其发酵制造成本、简化发酵制造工艺以及降低发酵工业环境压力，并为其多种工业应用提供廉价的酶制品。
本发明提供了含有BLA及其突变体编码基因的芽孢杆菌菌株。进一步，本发明提 供了含有BLA及其突变体编码基因的地衣芽孢杆菌菌株，基因的核苷酸序列与SEQ ID NO 1有75%以上的同源性；BLA及其突变体氨基酸序列与序列SEQ ID NO 2相同或具有95% 以上的同源性。含有BLA或其突变体编码基因的地衣芽孢杆菌菌株可合成并分泌18mg/mL 以上的BLA或其突变体，是目前BLA工业生产菌株的3倍以上。
本发明还提供了含有BLA或其突变体编码基因的重组地衣芽孢杆菌菌株用于BLA 及其突变体高效生产的方法。进一步，本发明提供了适合含有BLA或其突变体编码基因的 重组地衣芽孢杆菌菌株进行BLA或其突变体合成与分泌及其重组酶的回收与产品制备的 生长培养基和发酵工艺。
本发明还提供了通过纯培养含有BLA或其突变体编码基因的重组地衣芽孢杆菌 菌株获得的BLA及其突变体的方法，其氨基酸序列与SEQ ID NO :2相同或具有95%以上的 同源性。
本发明还提供了应用于BLA或其突变体编码基因在地衣芽孢杆菌菌株中分泌表 达的重组表达质粒，以及对地衣芽孢杆菌菌株特定基因进行定向突变的基因删除质粒和突 变方法。
本发明的技术方案
基因克隆通用技术与表达载体
分子克隆的常规操作(染色体DNA的提取、质粒提取、DNA限制性酶切、体外重组、 DNA 测序等)按文献方法进行(Sambrook 等。Molecular Cloning =ALaboratory Manual, 1989)。基因扩增技术(PCR)按文献方法进行(诸葛键、王正祥。
工业微生物实验技术手 册
，中国轻工业出版社，1994)。基因定点突变用Multiple Mutation试剂盒(德国Roche 公司)进行。基因全合成按文献方法(牛丹丹等。应用与环境生物学学报，2007，13(4) 515-518)进行。基因序列测定用5'-双脱氧核苷酸链终止法，由上海生工生物工程公司协 助完成。BLA及其突变体重组表达载体的构建使用表达载体pHY-WZX或pBL-WZX(王正祥， 牛丹丹。中国发明专利，ZL 200510081648. 7 ；Niu & Wang. J Ind Microbiol Biotechnol, 2007,34:357-362)。庆大霉素抗性基因片段GmK来源于文献构建的质粒(刘大伟等。微生 物学通报，2007，34 (5) :926-928)。质粒转化入地衣芽孢杆菌菌株用电穿孔法进行(徐敏 等。食品与生物技术学报，2004，23 (4) 98-100 ；王正祥，牛丹丹等。中国发明专利，公开号 CN101230329A)。
地衣芽孢杆菌高温α -淀粉酶及其突变体
地衣芽孢杆菌高温α -淀粉酶编码基因amyL通过PCR技术从地衣芽孢杆菌Β0204 菌株基因组中克隆出(牛丹丹等。微生物学报，2006，46 (4) :576-580)。经核苷酸序列测定 后，基因amyL序列如SEQ ID NOl0 SEQ ID NOl中下划线部分为编码BLA信号肽的核苷酸 序列。
基因amyL的编码产物BLA的氨基酸序列SEQ ID N02如下。SEQ ID N02中标识为 负数的部分为BLA在合成过程中的信号肽序列。
1、重组表达质粒 pHY-amyL 或 pBL-amyL、pHY-amyLc 或 pBL-amyLc、pHY-amyLl、 pHY-amyL2、pHY-amyL4、pHY-amyL8、pHY-amyLL 的获得[0024]上述amyL基因片段经限制性酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化，克隆入表达 载体pHY-WZX或pBL-WZX的EcoRI、KpnI或SmaI位点，获得相应的BLA表达质粒pHY-amyL 或pBL-amyL，如附图2所示。
以 pBL-amyL 为基础，通过网站 http//genomes, urv. es/OPTIMIZER/ 进行密码子 优化及基因全合成，获得密码子优化的BLA编码新基因amyLc，如序列SEQID NO :3。其基因 的编码产物命名为BLA-Lc，氨基酸序列与SEQ ID NO :2相同，其中的284个密码子进行了 同义密码子的替换，如附图4所示。
上述amyLc基因片段经限制性酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化，分别克 隆入表达载体pHY-WZX或pBL-WZX的EcoRI、KpnI或SmaI位点，获得相应重组表达质粒 pHY-amyLc 或 pBL-amyLc,如附图 3 所示。
以pBL-amyLc为基础，通过多点突变及人工基因全合成技术，获得BLA突变体编码 新基因 amyLl (SEQ ID NO 4)、amyL2 (SEQ ID NO 5)、amyL4 (SEQID NO 6)、amyL8 (SEQ ID NO 7)、amyLL(SEQ ID NO :8)，其新基因的编码产物分别命名为 BLA-LU BLA-L2、BLA-L4、 BLA-L8、BLA-LL。
上述BLA突变体编码新基因分别经限制性酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离纯 化，分别克隆入pHY-WZX表达载体的EcoRI、KpnI或SmaI位点，获得相应重组表达质粒 pHY_amyLl、pHY_amyL2、pHY_amyL4、pHY_amyL8、pHY_amyLL。
2、宿主细胞B0204 ( Δ amyL)的获得(Β0204 ( Δ amyL)代表Β0204中巳删除amyL基 因)。用于BLA及其突变体高效表达的宿主细胞，选择使用地衣芽孢杆菌工业菌株CICIM B0204 (牛丹丹等。微生物学报，2006,46 (4) 576-580)，对其基因组中的BLA编码基因amyL 及其上下游序列先进行删除。
以寡核苷酸序歹Ij SEQ ID NO 9和序列SEQ ID NO 10为引物，用PCR技术从B0204 基因组中扩增出约600bp的amyL上游序列Up ；以寡核苷酸序列SEQID N0:11和序列SEQ ID NO 12为引物，用PCR技术从B0204基因组中扩增出距amyL下游约3kb的、大小为800bp的 PCR产物Dn。将Dn片段用SalI、XhoI双酶切后，克隆入pBlueScript SK(-)的Sail位点， 获得质粒PSK-Dn ；将Up序列用PstI酶切后，克隆入质粒pSK_Dn的SmaI和PstI位点之间， 获得重组质粒pSK-Up-Dn。将来源于pSKsym-Gm(刘大伟等。微生物学通报，2007，34 (5) 926-928)的GmK片段克隆入pSK-Up-Dn的EcoRI位点，获得用于BLA编码基因及其上下游 序列突变的重组质粒pSK-Up-GmK-Dn。
将重组质粒pSK-Up-GmK-Dn用电穿孔法转化入地衣芽孢杆菌B0204菌株，在选择 性培养基(LB培养基中补加终浓度2μ g/mL庆大霉素和淀粉)上筛选突变株，以在选择 性培养基上生长并且淀粉水解透明圈消失作为突变株的筛选指标，筛选得到缺失amyL的 突变株 B0204 ( Δ amyL)。
3、BLA及其突变体的分泌表达
将上述获得的重组表达质粒pHY-amyL、pHY-amyLc、pHY-amyLl、pHY_amyL2、 pHY-amyL4、pHY_amyL8、pHY-amyLL用电穿孔法分别转化入地衣芽孢杆菌突变株 B0204 ( Δ amyL)，用含卡那霉素(10 μ g/mL)和四环素(50 μ g/mL)的LB平板，于37 V培 养 2 3 天。筛选获得相应重组菌 B0204A-L、B0204A-Lc、B0204A-LU B0204A-L2、 B0204 Δ -L4、B0204 Δ -L8 和 Β0204 Δ -LL。[0034]重组菌在无卡那霉素的LB培养基中每12h传代一次，培养液适度稀释后涂布LB 平板，37°C培养2 3天后的生长菌落分别点种LB平板及含卡那霉素(10yg/mL)和四环 素(50yg/mL)的LB抗性平板，以抗性平板上生长出的菌落数量占非抗性平板上生长出的 菌落数的比例确定重组菌的遗传稳定性。
在250mL三角瓶中装50mL发酵培养基(酵母膏0.5 1.5%，蛋白胨1.2 3. 6%，葡萄糖 8 20% ；pH 7. 0)，分别接种重组菌 B0204 Δ-L、B0204A-Lc、B0204A-L1、 B0204 Δ -L2.B0204 Δ -L4.B0204 Δ -L8 和 Β0204 Δ-LL，42°C、220r/min 下培养 5 7 天。发 酵试验进一步在15L全自动发酵罐(B. Brawn，瑞士)中进行，工作发酵体积10L，过程中维 持溶氧为20%以上，并用硫酸或氨水控制为pH 7.0。定时取样分析。
3、酶活测定
高温α -淀粉酶按国家行业标准QB/T2306-97进行。
4、蛋白含量按文献方法进行(Bradford。Analysis Chemistry, 1976)，葡萄糖含量 用生物传感分析仪测定(山东省科学院微生物研究所，型号SBA-40C)。
BLA及其突变体的编码基因的核苷酸序列与SEQ ID NOl具有75%以上同源性；其 编码基因通过表达载体介导，在宿主细胞中表达的蛋白氨基酸序列与SEQ ID N02具有95% 以上同源性。
宿主细胞是通过基因删除技术，删除地衣芽孢杆菌BLA编码基因及其上下游序列 获得的，其中amyL、yvdE、和mal基因被删除，宿主细胞不表达BLA和生麦芽糖α -淀粉酶。
BLA新编码基因amyLc是在对amyL密码子优化后通过基因全合成技术获得的，其 具有SEQ ID NO 3的核苷酸序列，所编码的产物BLA-Lc具有与SEQID NO 2相同的氨基酸 序列。
BLA突变体编码基因是在BLA编码基因的密码子优化后，通过定点突变或基因全 合成技术获得的，具有序列 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ IDNO :6、SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO 8的核苷酸序列；所码产物具有与序列SEQ ID NO 2的氨基酸序列99. 6%,99. 4%, 98. 3%,98. 或 95. 7%的同源性。
含有序列SEQ ID NO 3的重组菌B0204 Δ _Lc，合成和分泌3倍于原始菌株B0204 的BLA的水平。
含有序列SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7 或 SEQ ID NO 8 的重组菌合成和分泌BLA突变体的能力是原始菌株B0204合成BLA能力的197% 367%。
制备BLA及其突变体的重组菌培养方法是分批流加发酵法。
重组菌在分批流加发酵时，合成与分泌BLA或其突变体的水平为18 25mg/mL，是 原始菌株B0204合成BLA能力的332 % 448 %。
本发明的有益效果
1、本发明用于BLA及其突变体高效制备的编码基因，为经过密码子优化及定点突 变获得的新核苷酸序列，可以显著改善其在宿主细胞中的翻译水平。
2、本发明用于BLA及其突变体表达宿主细胞B0204 (AamyL)，为经过遗传改良的 地衣芽孢杆菌BLA工业生产菌株，通过分子克隆等技术获得的BLA及其突变体生产的重组 菌，可以高效、分泌表达BLA及其突变体，其合成与分泌BLA及其突变体的水平，可以达到 18 25mg/mL以上，是B0204合成和分泌BLA的3 4. 5倍。本发明有助于降低BLA及其突变体的发酵制造成本、简化发酵制造工艺以及降低发酵工业环境压力。
3、本发明的适合含有BLA或其突变体编码基因的重组菌，进行BLA或其突变体合 成与分泌，以及重组酶的回收与产品制备的生长培养基和发酵工艺，可以用于低成本、简约 化制造BLA或其突变体。
4、本发明的BLA及其突变体，为应用与淀粉水解有关的生产工业，如燃料乙醇、淀 粉糖、发酵工业等，并可降低使用成本和简化使用工艺。
5、本发明的BLA及其突变体的制造方法，可以进一步用于其它淀粉和纤维素水解 酶等大宗工业酶制剂的工业制备，如纤维素酶、半纤维素酶、植酸酶、果胶酶等，但不局限于 上述酶制剂。
6、本发明的重组菌的选育方法，经过适当修饰后，也可以用于其它类型的工业酶 制剂，特别是以枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等宿主细胞 的工业酶制剂生产菌株的选育。
图1.地衣芽孢杆菌宿主细胞突变用重组质粒物理图谱
图2.重组表达质粒pBL-amyL和pHY_amyL物理图谱
图3.重组表达质粒pBL-amyLc和pHY_amyLc物理图谱
图4. amyLc与amyL的核苷酸序列比对。其中的284个密码子进行了同义密码子 的替换。“*”代表核苷酸转换，“#”表示核苷酸颠换。
具体实施方式
实施例1 宿主细胞的选育
按上述技术方案构建出BLA编码基因的突变质粒pSK-Up-GmK-Dn (图1)，用电穿孔 法转化入地衣芽孢杆菌B0204菌株，以庆大霉素抗性和不形成明显的淀粉水解透明圈为筛 选标记，筛选获得BLA突变株，突变株被定名为B0204 ( Δ amyL)。获得的突变株的遗传特征 为amyL、yVdE、mal基因被删除。突变株B0204 ( Δ amyL)被用于后续试验的宿主细胞。
实施例2 =BLA及其突变体编码基因
BLA编码基因amyL (序列SEQ ID N0:1)(牛丹丹等。微生物学报，2006，46 (4) 576-580)通过PCR技术从地衣芽孢杆菌B0204菌株基因组中扩增出来，克隆入表达载 体 pHY-WZX，pBL-WZX(王正祥牛丹丹。中国发明专利，ZL 200510081648. 7 ；Niu & Wang. J Ind Microbiol Biotechnol，2007，34 :357_362)中，获得重组表达质粒 pHY-amyL 或 pBL-amyL (图 2)。
以 pBL-amyL 为基础，通过网站 http//genomes, urv. es/0PTIMIZER/,优化 BLA 编码基因的密码子组成，并通过全基因合成技术(牛丹丹等。应用与环境生物技术学报， 2007，13 (4) 515-518)，获得密码子优化的编码BLA的新基因amyLc (序列SEQ ID NO 3), 其基因的编码产物命名为BLA-Lc，氨基酸序列与SEQ ID N0:2相同。将amyLc克隆入上述 表达载体pHY-WZX或pBL-WZX中，获得相应重组表达质粒pHY-amyLc或pBL_amyLc (图3)。 新基因amyLc与amyL的核苷酸序列比对如图4所示，其中的284个密码子进行了同义密码 子的替换。[0063]以pBL-amyLc为基础，通过突变试剂盒(德国Roche公司)或通过人工基因全 合成，获得BLA突变体编码基因amyLl (序列SEQ ID NO 4)、amyL2 (序列SEQ ID NO 5)、 amyL4(序列 SEQ ID NO :6)、amyL8 (序列 SEQ IDNO :7)、amyLL (序列 SEQ ID NO 8)；相应 基因的编码产物命名为BLA-Ll、BLA-L2、BLA-L4、BLA-L8、BLA-LL,其氨基酸序列与序列SEQ ID N0:2的氨基酸序列有99. 6%、99. 4%、98. 3%、98. 或95. 7%的同源性。BLA突变体 的特征如表1。
表1. BLA突变体基本特征
实施例3 =BLA及其突变体的高效分泌表达
将上述实施例2中获得的重组表达质粒pHY-amyL和pHY-amyLc用电穿孔法转化 入实施例1中获得的宿主细胞B0204 (AamyL)中，在选择性平板上筛选获得转化子，分别命 名为B0204A-L和Β0204Δ-Ιχ。在250mL三角瓶(装液量50mL)中进行摇瓶发酵。发酵 在发酵培养基(酵母膏0.5 1.5%，蛋白胨1.2 3.6%，葡萄糖8 20%;pH7.0)中，于 42°C和220r/min下进行，发酵时间120h。结果总结于表2。重组菌B0204 Δ -Lc合成与分 泌BLA水平几乎是Β0204的3倍，较重组菌Β0204 Δ -L提高约73%。重组菌在无抗生素培 养基中传代75代后，质粒维持率在92%左右。
表2.摇瓶条件下地衣芽孢杆菌Β0204和重组菌的BLA合成水平
将上述实施例2中获得的BLA突变体编码基因amyLl、amyL2、amyL4、amyL8、amyLL 克隆入pHY-WZX表达载体，获得相应重组表达质粒pHY-amyLl、pHY_amyL2、pHY_amyL4、 pHY-amyL8和pHY-amyLL。
将 pHY-amyLl、pHY-amyL2、pHY-amyL4、pHY-amyL8 和 pHY-amyLL 用电穿孔法转化入 实施例1中获得的宿主细胞B0204(AamyL)中，在选择性平板上筛选获得转化子，分别命名 为 B0204 Δ -LUB0204 Δ -L2、B0204 Δ -L4、B0204 Δ -L8 和 Β0204 Δ -LL。在 250mL 三角瓶(装 液量50mL)中进行摇瓶发酵。发酵在发酵培养基(酵母膏0.5% 1.5%，蛋白胨1.2% 3. 6%，葡萄糖8% 20%;pH 7.0)中于42°C和220r/min下进行，发酵时间120h。结果总 结于表3。重组菌合成与分泌BLA突变体的水平与较B0204的BLA合成水平有大幅度提高， 提高幅度为97 % 267 %。重组菌在无抗生素培养基中传代75代后，质粒维持率在90 %以 上。
表3.摇瓶条件下宿主细胞B0204 ( Δ amyL)合成BLA突变体的水平
进一步将重组菌在15L全自动发酵罐(B. Brawn，瑞士)中进行发酵试验，发酵培养 基为酵母膏1.5% 3.5%，蛋白胨2. 4% 4.8%，葡萄糖8% 28%，pH 7. 0 ；工作发酵 体积IOL ；发酵温度为42士 1°C ；过程中维持溶氧为20%以上；发酵12h后，通过流加50% 葡萄糖溶液，维持葡萄糖浓度为5 10g/L ；发酵过程中用硫酸或氨水控制为pH 7. 0 ；发酵 时间150 180h。结果总结于表4。重组菌合成与分泌BLA或其突变体的水平达到18 25mg/mL，较B0204的BLA合成水平有大幅度提高，提高幅度为227% 348%。
表4. 15L发酵罐中宿主细胞B0204 ( Δ amyL)合成BLA突变体的水平
序列表
SEQ ID NO 1
12atgaaacaacaaaaacggctttacgcccga ttgctgacgctgttatttgc gctcatcttc60ttRctRCCtc attctgcasc agcggcggcaaatcttaatgggacgctgatgcagtatttt120gaatggtacatgcccaatgacggccaacattggaagcgtttgcaaaacgactcggcatat180ttggctgaacacggtattactgccgtctggattcccccggcatataagggaacgagccaa240gcggatgtgggctacggtgcttacgacctttatgatttaggggagtttcatcaaaaaggg300acggttcggacaaagtacggcacaaaaggagagctgcaatctgcgatcaaaagtcttcat360tcccgcgacattaacgtttacggggatgtggtcatcaaccacaaaggcggcgctgatgcg420accgaagatgtaaccgcggttgaagtcgatcccgctgaccgcaaccgcgtaatttcagga480gaacacctaattaaagcctggacacattttcattttccggggcgcggcagcacatacagc540gattttaaatggcattggtaccattttgacggaaccgattgggacgagtcccgaaagctg600aaccgcatctataagtttcaaggaaaggcttgggattgggaagtttccaatgaaaacggc660aactatgattatttgatgtatgccgacatcgattatgaccatcctgatgtcgcagcagaa720attaagagatggggcacttggtatgccaatgaactgcaettggacggtttccgtcttgat780gctgtcaaac3C3,t 1333 tttcttttttgcgggattgggttaatcatgtcagggaaaaa840acggggaaggaaatgtttacggtagctgaatattggcagaatgacttgggcgcgctggaa900aactatttgaacaaaacaaattttaatcattcagtgtttgacgtgccgcttcattatcag960ttccatgctgcatcgacacagggaggcggctatgatatgaggaaattgctgaacggtacg1020gtcgtttccaagcatccgttgaaatcggttacatttgtcgataaccatgatacacagccg1080gggcaatcgcttgagtcgactgtccaaacatggtttaagccgcttgcttacgcttttatt1140ctcacaagggaatctggataccctcaggttttctacggggatatgtacgggacgaaagga1200gactcccagcgcgaaattcctgccttgaaacacaaaattgaaccgatcttaaaagcgaga1260aaacagtatgcgtacggagcacagcatgattatttcgaccaccatgacattgtcggctgg1320acaagggaaggcgacagctcggttgcaaattcaggtttggcggcattaataacagacgga1380cccggtggggcaaagcgaatgtatgtcggccggcaaaacgccggtgagacatggcatgac1440attaccggaaaccgttcggagccggttgtcatcaattcggaaggctggggagagtttcac1500gtaaacggcgggtcggtttcaatttatgttcaaagatag1539
SEQ ID NO 2
Ala Leu Glu Asp
Trp Met lie Gly
Asp Tyr Lys Phe
Trp Ala Arg Arg Glu 185 Asp 200 Trp 215 Leu 230
Val Ser Asn Glu lie Asp Tyr Asp Gly Thr Trp Tyr Asp Ala Val Lys
Asn 190 His 205 Ala 220 His 235
Gly Pro Asn lie
Asn Asp Glu Lys
Tyr Val Leu Phe
Asp Ala Gin Ser
Tyr 195 Ala 210 Leu 225 Phe 240
CN 101457230 B说明书11/18 页
Met Lys Gin Gin Lys Arg Leu Tyr Ala Arg Leu Leu Thr Leu
20
25
29
Leu Phe Ala Leu lie Phe Leu Leu Pro His Ser Ala Ala Ala Ala
5
10
15
Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gin Tyr Phe Glu Trp Tyr Met
15
10
5
Pro Asn Asp Gly Gin His Trp Lys Arg Leu Gin Asn Asp Ser Ala
30
Trp lie Pro Pro Ala
45
25
al 40
20
Tyr Leu Ala Glu His Gly lie Thr Ala V
35
Tyr Lys Gly Thr Ser Gin Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp
60
55
50
Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe His Gin Lys Gly Thr Val Arg Thr
75
Leu 90
70
Gly Glu Leu Gin Ser Ala lie Lys Ser
65
Lys Tyr
Val lie Asn His 105
85
Gly Thr Lys 80
Ar
g Asp lie Asn Val Tyr Gly Asp V
His Ser
Ala Val Glu Val
120
al hr
100
Ala Thr Glu Asp Val T
95
115
P 110
Lys Gly Gly Ala As
130
e 5 1 3 _—_ 1
Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val lie Ser Gly Glu His Leu
125
Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Arg Gly Ser Thr Tyr
150
145
40
60
Trp 165
Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly Thr Asp
155
Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg lie Tyr Lys Phe Gin Gly Lys
80
175
70
14Val Gin Arg 483
SEQ ID NO 3
Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu
Met Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gin Asn Asp Leu Gly Ala Leu
270
265
260
Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp
285
280
275
Val Pro Leu His Tyr Gin Phe His Ala Ala Ser Thr Gin Gly Gly
300
295
290
310
Lys 315
Gly Tyr Asp Met Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser
305
His Pro Leu Lys Ser Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gin
330
325
320
Pro Gly Gin Ser Leu Glu Ser Thr Val Gin Thr Trp Phe Lys Pro
345
340
Gin 360
u Ser Gly Tyr Pro
335
Glu 355 Ly
37 G1
38
Leu Ala Tyr Ala Phe lie Leu Thr Arg
s Gly Asp Ser Gin Arg
375
390
370
Pro lie Leu Lys Ala
u 5
350
Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr
365
Glu lie Pro Ala Leu Lys His Lys lie
380
Arg Lys Gin Tyr Ala Tyr Gly Ala Gin His Asp Tyr Phe Asp His
405
400
395
le Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser Val Ala
His Asp
420
415
410
Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu lie Thr Asp Gly Pro Gly Gly Ala
435
430
425
Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gin Asn Ala Gly Glu Thr Trp His
450
445
440
Asp lie Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val lie Asn Ser Glu
465
460
455
Tyr 480
Gly Gly Ser Val Ser lie 475
Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn
470
15
atgaaacaacaaaaacgcctttacgcgcgccttcttacacttcttttcgcgcttatcttc60cttcttccgcatagcgcggcggcggcggcgaaccttaacggcacacttatgcaatacttc120gaatggtacatgccgaacgacggccaacattggaaacgccttcaaaacgacagcgcgtac180cttgcggaacatggcatcacagcggtttggatcccgccggcgtacaaaggcacaagccaa240gcggacgttggctacggcgcgtacgacctttacgaccttggcgaattccatcaaaaaggc300acagttcgcacaaaatacggcacaaaaggcgaacttcaaagcgcgatcaaaagccttcat360agccgcgacatcaacgtttacggcgacgttgttatcaaccataaaggeggcgcggacgcg420acagaagacgttacagcggttgaagttgacccggcggaccgcaaccgcgaaatcagcggc480gaagcgcttatcaaagcgtggacacatttccatttcccgggccgcggcagcacatacagc540gacttcaaatggcattggtaccatttcgacggcacagactgggacgaaagccgcaaactt600aaccgcatctacaaattccaaggcaaagcgtgggactgggaagttgacaaegaaaaegge660aactacgactaccttatgtacgcggacatcgactacgaccateeggaegttgcggcggaa720atcaaacgctggggcacatggtacgcgaacgaacttcaacttgaeggettccgccttgac780gcggttaaacatat caaat tcagcttccttcgcgactgggttaaccatgttegegaaaaa840acaggcaaagaaatgttcacagttgcggaatactggcaaaacgaccttggcgcgcttgaa900aactaccttaacaaaacaaacttcaaccatagcgttttcgacgttccgcttC 已 tt8CC￡L3960ttccatgcggcgagcacacaaggcggcggctacgacatgcgcaaacttcttaacggcaca1020gttgttagcaaacatccgcttaaaagcgttacattcgttgacaBcc已tgBcacacaaccg1080ggccaaagccttgaaagcacagttcaaacatggttcaaaccgcttgcgtacgcgttcatc1140cttacacgcgaaagcggctacccgcaagttttctacggcgacatgtacggcacaaaaggc1200gacagccaacgcgaaatcccggcgctta已已cataaa已tegaaccgatccttaaagegege1260aaacaatacgcgtacggcgcgcaacatgactacttcgaccatcBtgacBtcgttggctgg1320acacgcgaaggcgacagcagcgttgcgaacagcggccttgcggcgcttatcacagacggc1380ccgggcggcgcgaaacgcatgtacgttggccgccaaaacgegggegaaacatggcatgac1440atcacaggcaaccgcagcgaaccggttgttatcaacagcgaaggctggggcgaattccat1500gttaacggcggcagcgttagcatctacgttcaacgctag1539[0089] SEQID NO 6
atgaaacaacaaaaacgcctttacgcgcgccttcttacacttcttttcgcgcttatcttc60cttcttccgcatagcgcggcggcggcggcgaaccttaacggcacacttatgcaatacttc120gaatggtacatgccgaacgacggccaacattggaaacgccttcaaaacgacagcgcgtac180cttgcggaacatggcatcacagcggtttggatcccgccggcgtacaaaggcacaagccaa240gcggacgttggctacggcgcgtacgacctttacgaccttggcgaattccatcaaaaaggc300acagttcgcacaaaatacggcacaaaaggcgaacttcaaagcgcgatcaaaagccttcat360agccgcgacatcaacgtttacggcgacgttgttatcaaccataaaggcggcgcggacgcg420acagaagacgttacagcggttgaagttgacccggcggaccgcaaccgcgttatcagcggc480gaataccttatcaaagcgtggacacatttccatttcccgggccgcggcagcacatacagc540gacttcaaatggtactggtaccatttcgacggcacagactgggacgaaagccgcaaactt600aaccgcatctacaaattccaaggcaaatactgggactgggaagttagcaacgaaaacggc660aactacgactaccttatgtacgcggacatcgactacgaccatccggacgttgttgcggaa720atcaaacgctggggcacatggtacgcgaacgaacttcaacttgacggcttccgccttgac780gcggttaaacatatcaaattcagcttccttcgcgactgggttaaccatgttcgcgaaaaa840acaggcaaagaaatgttcacagttgcggaatactggcaaaacgaccttggcgcgcttgaa900aactaccttaSC 8-9.3,3,03. BBcttcaaccatagcgttttcgacgttccgcttcattaccaa960ttctacgcggcgagcacacaaggcggcggctacgacatgcgcaaacttcttaacgacaca1020gttgttagcaaacatccgcttaaaagcgttacattcgttgacaaccatgacacacaaccg1080ggccaaagccttgaaagcacagttcaaacatggttcaaaccgcttgcgtacgcgttcatc1140cttacacgcgaaagcggctacccgcaagttttctacggcgacatgtacggcacaaaaggc1200gacagccaacgcgaaatcccggcgcttaaacataaaatcgaaccgatccttaaagcgcgc1260aaacaatacgcgtacggcgcgcaacatgactacttcgaccatcatgacatcgttggctgg1320acacgcgaaggcgacagcagcgttgcgaacagcggccttgcggcgcttatcacagacggc1380ccgggcggcgcgaaacgcatgtacgttggccgccaaaacgcgggcgaaacatggtacgac1440atcacaggcaaccgcagcgaaccggttgttatcaacagcgaaggctggggcgaattccat1500gttaacgacggcagcgttagcatctacgttcaacgctag1539
SEQ ID NO 7
SEQ ID NO 8
权利要求
一种高温α 淀粉酶BLA及其突变体的高效制备方法，其特征是(1)重组表达质粒pHY amyL或pBL amyL、pHY amyLc或pBL amyLc、pHY amyL1、pHY amyL2、pHY amyL4、pHY amyL8、pHY amyLL的获得将amtL基因片段经限制性酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化，克隆入表达载体pHY WZX或pBL WZX的EcoRI、KpnI或SmaI位点，获得相应的BLA表达质粒pHY amyL或pBL amyL；以pBL amyL为基础，通过网站http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/进行密码子优化及基因全合成，获得密码子优化的BLA编码新基因amyLc，如序列SEQID NO3所示；基因的编码产物命名为BLA Lc；将amyLc基因片段经限制性酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化，分别克隆入表达载体pHY WZX或pBL WZX的EcoRI、KpnI或SmaI位点，获得相应重组表达质粒pHY amyLc或pBL amyLc；以pBL amyLc为基础，通过多点突变及人工基因全合成技术，获得BLA突变体编码基因amyL1如SEQ ID NO4所示、amyL2如SEQ ID NO5所示、amyL4如SEQ ID NO6所示、amyL8如SEQ ID NO7所示、amyLL如SEQ IDNO8所示；相应基因的编码产物命名为BLA L1、BLA L2、BLA L4、BLA L8、BLA LL，BLA突变体编码基因分别经限制性酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化，分别克隆入pHY WZX表达载体的EcoRI、KpnI或SmaI位点，获得相应重组表达质粒pHY amyL1、pHY amyL2、pHY amyL4、pHY amyL8、pHY amyLL；(2)宿主细胞B0204(ΔamyL)的获得用于BLA及其突变体高效表达的宿主细胞，选择使用地衣芽孢杆菌工业菌株CICIM B0204，对其基因组中的BLA编码基因amyL及其上下游序列先进行删除；以寡核苷酸序列SEQ ID NO9和序列SEQ ID NO10为引物，用PCR技术从B0204基因组中扩增出上游序列Up；以寡核苷酸序列SEQ ID NO11和序列SEQ ID NO12为引物，用PCR技术从B0204基因组中扩增出距amyL下游3kb的PCR产物Dn，将Dn片段用SalI、XhoI双酶切后，克隆入pBlueScriptSK( )的SalI位点，获得质粒pSK Dn；将Up序列用PstI酶切后，克隆入质粒pSK Dn的SmaI和PstI位点之间，获得重组质粒pSK Up Dn；将来源于pSKsym Gm的GmR片段克隆入pSK Up Dn的EcoRI位点，获得用于BLA编码基因及其上下游序列突变的重组质粒pSK Up GmR Dn；将重组质粒pSK Up GmR Dn用电穿孔法转化入地衣芽孢杆菌B0204菌株， 在LB培养基中补加终浓度2μg/mL庆大霉素和1％淀粉的选择性培养基上筛选突变株，以在选择性培养基上生长并且淀粉水解透明圈消失作为突变株的筛选指标，筛选得到缺失amyL的突变株B0204(ΔamyL)；(3)BLA及其突变体的分泌表达将上述获得的重组表达质粒pHY amyL、pHY amyLc，pHY amyL1、pHY amyL2、pHY amyL4、pHY amyL8、pHY amyLL用电穿孔法分别转化入地衣芽孢杆菌突变株B0204(ΔamyL)，用含卡那霉素10μg/mL和四环素50μg/mL的LB平板，于37℃培养2～3天，筛选获得相应重组菌B0204Δ L、B0204Δ Lc、B0204Δ L1、B0204Δ L2、B0204Δ L4、B0204Δ L8、B0204Δ LL。
2.根据权利要求
1所述的方法，其特征是BLA及其突变体的编码基因的核苷酸序列与2SEQ ID NO :1具有75%以上同源性；其编码基因通过表达载体介导，在宿主细胞中表达的 蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO :2具有95%以上同源性。
3.根据权利要求
1所述的方法，其特征是宿主细胞是通过基因删除技术，删除地衣芽 孢杆菌BLA编码基因及其上下游序列获得的，其中amyL、yvdE、和mal基因被删除，宿主细 胞不表达BLA和生麦芽糖α -淀粉酶。
4.根据权利要求
1所述的方法，其特征是BLA编码基因amyLc是在对amyL密码子优化 后通过基因全合成技术获得的，其具有SEQ ID NO :3的核苷酸序列；所编码的产物BLA-Lc 具有与SEQ ID NO :2相同的氨基酸序列。
5.根据权利要求
1所述的方法，其特征是BLA突变体编码基因是在BLA编码基因的密 码子优化后，通过定点突变或基因全合成技术获得的，具有序列SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 8的核苷酸序列；所编码的产物具有与序列 SEQ ID N0:2 的氨基酸序列 99. 6%、99. 4%、98. 3%、98. 或 95. 7%的同源性。
6.根据权利要求
1、2、3或4所述的方法，其特征是含有序列SEQID NO :3的重组菌 B0204 Δ -Lc，合成和分泌3倍于原始菌株Β0204的BLA的水平。
7.根据权利要求
1、2、3或5所述的方法，其特征是含有序列SEQID NO :4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7或SEQ ID NO 8的重组菌合成和分泌BLA突变体的能力是 原始菌株B0204合成BLA能力的197 % 367 %。
8.根据权利要求
1所述的方法，其特征是制备BLA及其突变体的重组菌培养方法是分 批流加发酵法。
9.根据权利要求
8所述的方法，其特征是，重组菌在分批流加发酵时，合成与分泌BLA 或其突变体的水平为18 25mg/mL，是原始菌株B0204的BLA合成水平的332% 448%。
专利摘要
一种高温α-淀粉酶及其突变体的高效制备方法，属于发酵工程领域。本发明提供了一种通过芽孢杆菌，特别是地衣芽孢杆菌突变菌株为宿主细胞，高效分泌表达具有α-淀粉酶活性的高温α-淀粉酶及其突变体的方法。本发明的重组菌，在分批流加发酵时合成与分泌高温α-淀粉酶或其突变体的水平达到18～25mg/mL，是原始菌株高温α-淀粉酶合成水平的3～4.5倍。本发明有助于降低工业酶制剂的发酵制造成本、简化发酵制造工艺以及降低发酵工业环境压力。
文档编号C12R1/10GKCN101457230 B发布类型授权 专利申请号CN 200810235367
公开日2010年12月1日 申请日期2008年12月8日
发明者牛丹丹, 王正祥, 石贵阳 申请人:江南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan