专利名称:一种以菊芋块茎及茎叶为原料发酵生产2,3-丁二醇的方法
技术领域：
本发明属于生物化工技术领域：
，涉及一种发酵生产2，3_ 丁二醇的方法，尤其是涉及一种以菊芋块茎及茎叶为原料经微生物发酵生产2，3- 丁二醇的方法。
背景技术：
2，3-丁二醇(英文名2，3-Butanediol，简称2，3_BD)是一种极其重要的化工原料，具有广泛的应用领域。它是极具价值的液体燃料，其燃烧值为27198J/g，可与甲醇(22081J/g)、乙醇(29005J/g)相媲美(Flichinger M C, Biotechnol Bioengng, 1980, 22:27-48) ；2，3-BD经催化脱氢可得到乙偶姻和二乙酰化合物，用来制作高价值香料和食品添加剂；2，3-BD可以用来制造重要的工业有机溶剂甲乙酮，还可以用来生产2-丁烯和1，3_ 丁二烯等人造橡胶单体；酯化形式的2，3-BD是合成聚亚胺的前体，可应用于药物、化妆品、洗涤液等；2，3-BD自身也可以作为单体用来合成高分子化合物；左旋形式的2，3-BD由于其较低的凝固点可用作抗冻剂；其它潜在的用途包括用于制作墨水、增塑齐U、湿润剂等。另外，2，3-BD的可生物降解性是其吸引人的一个突出特点(Syu M J，Appl MicrobiolBiotechnol, 2001, 55 :10_18 ；Garg S K，Jain A，Bioresource Technology, 1995,51 103-109) 0现在，随着石油资源的日益减少及人们对环境问题的不断关注使得发展各种可再生清洁能源成为世界各国关注的焦点。因此，用生物转化法生产2，3-BD，并对其及其衍生物进行开发应用逐渐引起了人们的关注。
目前，生物转化法生产2，3_BD的常用底物是碳水化合物，最主要的是葡萄糖(Olson BH, Johnson M J, Bacterial, 1948, 55 209~222 ；Α.-P. Zeng et al，Appl MicrobiolBiotechnol, 1991，34 :463_468)，另外还有木糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖等，但用后几种糖做底物发酵获得的2，3-BD浓度不高，达不到工业化要求，而使用葡萄糖又存在价格较高且与人争粮、与粮争地等问题，因此寻找一种廉价的可再生的原料来发酵生产2，3-BD已成为目前亟待解决的问题。
菊芋(Jerusalem artichoke)作为一种可再生资源，在我国分布广泛。菊芋适应性和抗病能力都很强，尤其适合在贫瘠的山地和不适宜种植粮食作物的废弃土地上种植， 不用施任何肥料，但长势旺盛、产量高，并且一年种植后可每年收获，可以连收4-5年。菊芋地下块茎产量一般为3-4吨/亩，地上茎叶产量也可达3吨/亩。因此，将菊芋块茎及茎叶作为发酵生产2，3-BD的原料，可以提高菊芋的综合利用价值。
菊芋块茎含有一种贮存性多糖抓菊粉，约占菊芋肥大块茎干重的70%以上。菊粉又叫菊糖，是由D-呋喃果糖分子以？(2-1)糖苷键连接而成的一种果聚糖，每个菊糖分子末端再以？(1-2)糖苷键连接一个葡萄糖残基。菊糖经稀酸或菊糖酶水解得到的水解液(果糖和少部分葡萄糖)可用来作为发酵生产2，3-BD的底物。而菊芋的茎叶含有木质纤维素(纤维素、半纤维素、木质素)，约占茎叶干重的80% (薛崇昀等，China Pulp&Paperlndustry, 2007, 28 (2) 67-70)。纤维素经水解后生成葡萄糖，半纤维素经水解后主要生成木糖以及少量阿拉伯糖，半乳糖，甘露糖，这些单糖同样可用来作为发酵生产2，3-BD的底物。另外菊芋块茎中还含有一定数量的蛋白质、脂肪、维生素、淀粉、尼克酸、粗纤维、硒、铁、钙等各种营养成分，这些成分的存在很可能对2，3-BD发酵起到促进作用(王风等，中国蔬菜，2008 (9) :8-9)。目前，以菊芋为原料发酵生产燃料乙醇得到了广泛研究(TOYOHIKONAKAMURA et al，JOURNAL OF FERMENTATION ANDBIOENGINEERING，1996， 81(6) 564-566 ；J. P. Guiraud et al, European J Appl MicrobiolBiotechnol,1982,14 81-85 ；中国专利公开号CN101265485A ；中国专利公开号CN1952163A)。而在以菊芋块茎为原料发酵生产2，3-BD的过程中，Jacques Fages等人通过批式发酵方式来生产2，3_BD， 在最佳培养条件下得到的2，3-BD浓度为44g/L(Jacques Fageset al, Appl Microbiol Biotechnol, 1986,25(3) 197-202)；大连理工大学通过分步糖化发酵或同步糖化发酵两种工艺来生产2，3-BD，得到2，3-BD与乙偶姻的最终浓度之和为60_115g/L(中国专利公开号CN101289680A)。在这些2，3-BD的生产研究中，都没有考虑到菊芋茎叶的利用，造成资源的浪费，而本发明的突出特点是将菊芋块茎及茎叶综合利用到2，3-BD的发酵生产中，在降低生产成本的基础上，实现资源的合理利用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种综合利用菊芋块茎及茎叶为原料发酵生产 2,3-BD的方法，实现资源的综合利用。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下
(1)原料准备菊芋块茎及茎叶经干燥、粉碎后，将得到的粉末调制成菊芋浆；或将菊芋块茎及茎叶粉末水解，得到还原糖液。具体操作如下
制作预处理液菊芋茎叶经稀酸预处理，选用的酸为硫酸、盐酸、硝酸、磷酸、甲酸或乙酸，优选硫酸；在利用稀硫酸进行菊芋茎叶的预处理时，硫酸浓度为0. 5% -5%，料液比为 1 4-1 20(w/w)，在 100-300°C下保温 1-4 小时;
制作菊芋浆向预处理液中加入菊芋块茎粉末后，用碱调节PH5. 0-7. 0，选用的碱为氨水、氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化钙，优选氨水；
制作还原糖液将预处理液冷却后过滤，向滤液中加入菊芋块茎粉末，在 70-100°C下保温20-80分钟，调节pH5. 0-7. 0，得到较高浓度的还原糖液A ；滤渣经稀释调浆，调节PH5. 0-7. 0后，添加纤维素酶和木聚糖酶，加酶量分别为20-400U/g茎叶干重和 10-200U/g茎叶干重，在37-60°C，pH5. 0-7. 0条件下，水解12-72小时，得到还原糖液B ； 向B液中加入菊芋块茎粉末，同时添加菊糖酶，加酶量为10-100U/g块茎干重，在37-60°C， pH5. 0-7. 0条件下，水解2-30小时，得到还原糖液C。
(2)菌种采用的菌种通常为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、芽孢杆菌属 (Bacillus)或肠杆菌属(Enterobacter)0
(3)种子液准备将⑴中已灭菌的还原糖液A、B或C与已灭菌的无机盐营养成分混合得到种子培养基，无机盐营养成分包括(NH4)2HPO4 6. 0g/l、KCl 1. 8g/l、EDTA0. 51g/ UMgSO4. 7H20 0. 6g/l、柠檬酸0. 21g/l和柠檬酸钠0. 294g/l。将活化后的菌种接种到种子培养基中，在35-38°C，150-250rpm条件下培养12-24小时，作为后续发酵的种子液。
(4)发酵培养将(1)中已灭菌的菊芋浆或菊芋水解糖液与已灭菌的无机盐营养成分混合得到发酵培养基，无机盐营养成分包括KH2PO4 1.36g/l、(NH4)2SO4 6.61g/l、 MgCl2. 6H20 0. 26g/l和柠檬酸0. 428g/l。将上述种子液按2_10 %的接种量接种到发酵培养基中，在 pH5. 0-7. 0、35-45°C、150-300rpm、0. 01-0. 5vvm 通空气条件下培养 24-96 小时， 结束发酵，将发酵液中的2，3-BD分离出来。
发酵方式采用分步糖化或同步糖化发酵方式。
分步糖化间歇发酵以菊芋还原糖液A和B或A和C为初始底物，即在菊芋还原糖液A和B或A和C的发酵培养基(还原糖浓度范围为50-200g/l)中，按2-10% (V/V)接种,在 pH5. 0-7. 0、35-45°C、150-300rpm、0. 01-0. 5vvm 通空气条件下培养 24-96 小时，结束发酵，将发酵液中的2，3-BD分离出来；
分步糖化批式流加发酵以菊芋还原糖液A为初始底物，即在菊芋还原糖液A的发酵培养基(还原糖浓度范围为50-200g/l)中，按2-10% (V/V)接种，在pH5. 0-7. 0、 35-45°C、150-300rpm、0. 01-0. 5vvm通空气条件下培养12小时以上，补加还原糖液C，这时还原糖浓度达到40-100g/l，继续培养24-96小时，结束发酵，将发酵液中的2，3_BD分离出来；
分步糖化连续发酵以菊芋还原糖液A为初始底物，即在菊芋还原糖液A的发酵培养基(还原糖浓度范围为50-200g/l)中，按2-10% (V/V)接种，在pH5. 0-7. 0、35_45°C、 150-300rpm、0. 01-0. 5vvm通空气条件下培养12小时以上，以一定的速度向发酵罐内添加含有还原糖液A或C的新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，维持发酵罐内的液量恒定，继续培养24-96小时，结束发酵，将发酵液中的2，3-BD分离出来；
同步糖化间歇发酵以菊芋浆为初始底物，即在菊芋浆的发酵培养基中，加入 20-400U/g茎叶干重的纤维素酶、10-200U/g茎叶干重的木聚糖酶和10_100U/g块茎干重的菊糖酶，按 2-10% (V/V)接种，在 pH5. 0-7. 0、35_45°C、150_300rpm、0. 01-0. 5vvm 通空气条件下培养24-96小时，结束发酵，将发酵液中的2，3-BD分离出来；
同步糖化批式流加发酵以菊芋浆为初始底物，即在菊芋浆的发酵培养基中，加入 20-400U/g茎叶干重的纤维素酶、10-200U/g茎叶干重的木聚糖酶和10_100U/g块茎干重的菊糖酶，按 2-10% (V/V)接种，在 pH5. 0-7. 0、35_45°C、150_300rpm、0. 01-0. 5vvm 通空气条件下培养12小时以上，补加菊芋块茎粉末和10-100U/g块茎干重的菊糖酶，继续培养24-96 小时，结束发酵，将发酵液中的2，3-BD分离出来。
本发明的效果和益处是将菊芋块茎及茎叶综合利用到2，3_BD的发酵生产中，在降低生产成本的基础上，实现资源的合理利用，具有巨大的经济效益和社会效益。
图1是克雷伯氏杆菌CICC 10011在500ml三角瓶中以菊芋块茎及茎叶为原料间歇发酵生产2，3-BD时发酵液中底物及目标产物浓度变化曲线图。
图2是克雷伯氏杆菌CICC 10011在500ml三角瓶中以菊芋块茎及茎叶为原料批式流加发酵生产2，3-BD时发酵液中底物及目标产物浓度变化曲线图。
图3是克雷伯氏杆菌CICC 10011在51发酵罐中以菊芋块茎及茎叶为原料批式流加发酵生产2，3-BD时发酵液中底物及目标产物浓度变化曲线图。
具体实施方式
以下结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施例。
本实施例中的原料准备过程如下将菊芋块茎清洗，切片，放入45°C烘箱中烘干， 经粉碎机粉碎后，过60目筛，收集细粉，粗粉继续粉碎、过筛，得到的菊芋块茎细粉作为发酵的原料；菊芋茎叶经自然风干后，再 经粉碎机粉碎，得到菊芋茎叶细粉，作为发酵的原料。 将两种细粉分别进行酸水解及酶水解，得到还原糖液。
本实施例中所用菌种为克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)，中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)保藏，保藏号CICC No. 10011。
本实施例中摇瓶发酵培养基的无机盐营养成分与种子培养基中的无机盐营养成分相同。
实施例1 ；
(1)糖液制备称取IOg菊芋茎叶细粉，按料液比1 14(w/w)加入稀硫酸， 在130°C下保温1. 5小时，冷却后过滤，得到糖液及滤渣。向滤液中加入26g菊芋块茎细粉， 90°C保温30分钟，用氨水调节pH5. 8，得到浓度为130. 7g/l的还原糖液A ；滤渣用水稀释调浆，调节PH5. 0后，添加纤维素酶和木聚糖酶，加酶量分别为40U/g茎叶干重和28U/g茎叶干重，在50°C、pH5. 0条件下，水解48小时，得到浓度为31. 84g/l的还原糖液B。
(2)种子液准备将20ml还原糖液A与20ml无机盐营养成分，分别在115°C条件下灭菌15min，冷却后混合得到种子培养基。将活化后的菌种接种到种子培养基中，在37°C， 200rpm条件下培养21小时，作为后续发酵的种子液。
(3)摇瓶发酵培养将IlOml还原糖液A、70ml还原糖液B和40ml无机盐营养成分，分别在115°C条件下灭菌15min，冷却后混合得到摇瓶发酵培养基。将上述种子液按5% 的接种量接种到220ml摇瓶发酵培养基中，在37°C、200rpm条件下，发酵培养24小时，此时，发酵液中2，3-BD的浓度为26. 34g/l，2，3-BD与乙偶姻的浓度之和为27. 78g/l。
实施例2
(1)糖液制备称取IOg菊芋茎叶细粉，按料液比1 14(w/w)加入稀硫酸， 在130°C下保温1. 5小时，冷却后过滤，得到糖液及滤渣。向滤液中加入26g菊芋块茎细粉， 90°C保温30分钟，用氨水调节pH5. 8，得到浓度为131. 7g/l的还原糖液A ；滤渣用水稀释调浆，调节PH5. 0后，添加纤维素酶和木聚糖酶，加酶量分别为40U/g茎叶干重和28U/g茎叶干重，在50°C、pH5. 0条件下，水解48小时后，加入菊芋块茎细粉，同时添加菊糖酶，加酶量为20U/g块茎干重，继续水解28小时，得到浓度为158. 76g/l的还原糖液C。
(2)种子液准备将20ml还原糖液A与20ml无机盐营养成分，分别在115 条件下灭菌15min，冷却后混合得到种子培养基。将活化后的菌种接种到种子培养基中，在 370C，200rpm条件下培养21小时，作为后续发酵的种子液。
(3)摇瓶发酵培养将IlOml还原糖液A与IlOml无机盐营养成分，分别在115°C 条件下灭菌15min，冷却后混合得到摇瓶发酵培养基。将上述种子液按5%的接种量接种到 220ml摇瓶发酵培养基中，在37°C、200rpm条件下，发酵培养16小时后，补加90ml还原糖液 C，继续进行发酵，发酵培养到47小时，发酵液中2，3-BD的浓度为30. 37g/l，2，3-BD与乙偶姻的浓度之和为35. 52g/l。
实施例3 [0038](1)糖液制备称取200g菊芋茎叶细粉，按料液比1 8(w/w)加入稀硫酸，在 130°C下保温1. 5小时，冷却后过滤，得到糖液及滤渣。向滤液中加入300g菊芋块茎细粉， 90°C保温40分钟，用氨水调节pH5.8，得到浓度为180g/l的还原糖液A ；滤渣用水稀释调浆，调节PH5. 0后，添加纤维素酶和木聚糖酶，加酶量分别为40U/g茎叶干重和28U/g茎叶干重，在50°C，pH5. 0条件下，水解48小时后，加入菊芋块茎细粉，同时添加菊糖酶，加酶量为20U/g块茎干重，继续水解28小时，得到浓度为330g/l的还原糖液C。
(2)种子液准备将40ml还原糖液A与40ml无机盐营养成分，分别在115°C条件下灭菌15min，冷却后混合得到种子培养基。将活化后的菌种接种到种子培养基中，在37°C ， 200rpm条件下培养22小时，作为后续发酵的种子液。
(3)发酵培养将IOOOml还原糖液A与500ml无机盐营养成分，分别在115°C条件下灭菌15min，冷却后混合得到发酵培养基。将上述种子液按5%的接种量接种到1. 51发酵培养基中，在37°C、200rpm、pH5. 8、通气量为0. Ivvm条件下进行发酵培养，当残糖浓度低于50g/l时，补加170ml还原糖液C，继续进行发酵，发酵培养到72小时，发酵液中2，3-BD 的浓度为62. lg/l，2，3-BD与乙偶姻的浓度之和为73. 2g/l，生产强度为1. 02g/(lh)。
权利要求
1.一种以菊芋块茎及茎叶为原料发酵生产2，3_ 丁二醇的方法，其特征在于以下步骤(1)原料准备菊芋块茎及茎叶经干燥粉碎后，分别得到菊芋块茎粉末和菊芋茎叶粉末，将得到的粉末调制成菊芋浆或将菊芋块茎粉末和菊芋茎叶粉末经稀酸预处理、酶解获得菊芋还原糖液；具体操作如下制作预处理液菊芋茎叶粉末经稀酸预处理得到预处理液；选用的酸为硫酸、盐酸、硝酸、磷酸、甲酸或乙酸；在利用稀硫酸进行菊芋茎叶粉末的预处理时，硫酸浓度为 0. 5% -5%，料液比为 1:4-1: 20(w/w)，在 100_300°C下保温 1-4 小时；制作菊芋浆向前述的预处理液中加入菊芋块茎粉末后，用碱调节PH5. 0-7. 0，得到菊芋浆，选用的碱为氨水、氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化钙；制作还原糖液将前述的预处理液冷却后过滤，向滤液中加入菊芋块茎粉末，在 70-10(TC下保温20-80分钟，调节pH 5. 0-7. 0,得到还原糖液A ；滤渣经稀释调浆，调节pH 5. 0-7. 0后，添加纤维素酶和木聚糖酶，加酶量分别为20-400U/g茎叶干重和10_200U/g茎叶干重，在37-60°C，pH 5. 0-7. 0条件下，水解12-72小时，得到还原糖液B ；向B液中加入菊芋块茎粉末，同时添加菊糖酶，加酶量为10-100U/g块茎干重，在37-60°C，pH5. 0-7. 0条件下，水解2-30小时，得到还原糖液C ；(2)菌种采用的菌种为克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)CICC 10011 ；(3)种子液准备将(1)中已灭菌的还原糖液A、B或C与已灭菌的无机盐营养成分混合得到种子培养基，将活化后的菌种接种到种子培养基中，在35-38°C，150-250rpm条件下培养12-24小时，作为后续发酵的种子液；(4)发酵培养将(1)中已灭菌的菊芋浆或菊芋还原糖液与已灭菌的无机盐营养成分混合得到发酵培养基，将上述种子液按2-10%的接种量接种到发酵培养基中，在 pH5. 0-7. 0、35-45°C、150-300rpm、0. 01-0. 5vvm 通空气条件下培养 24-96 小时，结束发酵， 将发酵液中的2，3_ 丁二醇分离出来；发酵采用的方式为分步糖化或同步糖化发酵方式。
2.根据权利要求
1所述的方法，其特征还在于分步糖化间歇发酵是以菊芋还原糖液A和B或A和C为初始底物，进行发酵培养；分步糖化批式流加发酵是以菊芋还原糖液A为初始底物，发酵培养12小时以上，补加还原糖液C，继续进行发酵；分步糖化连续发酵是以菊芋还原糖液A为初始底物，发酵培养12小时以上，向发酵罐内添加含有还原糖液A或C的新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，维持发酵罐内的液量恒定，继续进行发酵；同步糖化间歇发酵是以菊芋浆为初始底物，加入20-400U/g茎叶干重的纤维素酶、 10-200U/g茎叶干重的木聚糖酶和10-100U/g块茎干重的菊糖酶后再接种，进行发酵培养；同步糖化批式流加发酵是以菊芋浆为初始底物，加入20-400U/g茎叶干重的纤维素酶、10-200U/g茎叶干重的木聚糖酶和10-100U/g块茎干重的菊糖酶后再接种，发酵培养12 小时以上，补加菊芋块茎粉末和10-100U/g块茎干重的菊糖酶，继续进行发酵。
专利摘要
本发明公开了一种综合利用菊芋块茎及茎叶为原料发酵生产2，3-丁二醇的方法，属于生物化工技术领域：
。其特征是将菊芋块茎及茎叶经干燥、粉碎后，将得到的粉末调制成菊芋浆；或将菊芋块茎及茎叶粉末水解，得到还原糖液；将已灭菌的菊芋浆或还原糖液与已灭菌的无机盐营养成分混合，接入产2，3-丁二醇的菌种，在氧气存在的条件下，发酵生产2，3-丁二醇，发酵结束后，2，3-丁二醇的最终浓度为40-105g/l，2，3-丁二醇与乙偶姻的最终浓度之和为50-115g/l。本发明将廉价非粮原料菊芋的块茎及茎叶综合利用到2，3-丁二醇的发酵生产中，在降低生产成本的基础上，实现资源的有效利用，具有巨大的经济效益和社会效益。
文档编号C12P7/18GKCN101619328 B发布类型授权 专利申请号CN 200910302837
公开日2012年2月15日 申请日期2009年6月2日
发明者修志龙, 戴建英, 李丹 申请人:大连理工大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3), 非专利引用 (6),