专利名称:鉴定阿胶真伪的引物、试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及医药检测领域，特别涉及鉴定阿胶真伪的引物以及试剂盒，还包括该试剂盒的检测方法。
背景技术：
胶类药材是指用动物的皮、鳞、骨骼等，经过熬制后以胶入药的一类中药，常用的有阿胶，黄明胶，龟甲胶，鹿角胶，新阿胶，鱼鳞胶等。胶类药材是中国所特有的，并有悠久的应用历史，多有补血止血，滋阴润燥等补益功效。然而，各种胶类药材原料来源不同，加之用药部位的不同，因此各种胶类药材在成分、药理作用、临床应用上亦有各自的特点。然而目前不仅存在胶类药材混用，还存在胶类药材掺杂、掺假的现象，尤其以阿胶最为严重。
2002年2月28日，卫生部发布了《关于进一步规范保健食品原料管理的通知》，规定了阿胶被列为既是食品又是药品。由此，在国家药监局进行注册的药品使用的阿胶类药品有10种，而大大小小的阿胶类食品和保健品，也应运而生，导致阿胶长久以来作为药品的这一定位开始发生改变——作为食品。阿胶在《中国药典2010》有相关质量规定:以驴皮熬制的胶为阿胶正品，但作为食品和保健品，目前还没有国家标准。
当前市场上阿胶的制备原料鱼龙混杂，其中不乏使用驴的近亲源物种马及骡子的皮熬制的胶，加之由于保健品没有相关国家标准，阿胶的监管目前并不明朗，而作为食品阿胶的标准，则由企业自行制定，这也给阿胶造假提供了较大的空间。由于驴、马、骡同是马科动物，其皮成胶需经过长时间的煮制，加之制作工艺中会加入其他辅料，导致这些使用驴近亲源性动物皮冒充驴皮熬制的胶类药材从外观上较难辨认，造成检测难度极大。另一方面，由于目前驴皮原料的短缺，并且骡子皮熬制的胶在外观上与驴皮熬制的阿胶极为相近，骡子皮成为了许多阿胶产品的掺假原料。
近年来，公开号为CN1605868A的中国专利采用PCR-RFLP方法鉴定包括驴皮等动物皮，但该方法适合用于DNA保存完好，或者轻度破坏样品的PCR鉴定。阿胶经过高温高压长时间作用，其DNA含量极少，片段极短，很难扩增出长片段的PCR产物。另外，公开号为CN101974635A的中国专利公开了 PCR方法鉴别阿胶的真伪和公开号为CN101812509A的中国专利公开了鉴定中药中马种源性成分的PCR鉴定方法。但这些方法未能鉴别与驴亲源性最近的骡子皮掺假的阿胶。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供鉴定阿胶真伪的引物的引物，其特异性好，灵敏度高，能适应较宽的温度范围。
为实现上述发明目的，技术方案为:
鉴定阿胶真伪的引物，所述引物由上游引物和下游引物组成，所述上游引物如SEQID N0.1所示核苷酸序列，所述下游引物如SEQ ID N0.2所示核苷酸序列。
本发明的目的之二在于提供鉴定阿胶真伪的试剂盒，技术方案为:[0010]含有所述引物为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所述核苷酸序列的PCR检测试剂盒。
本发明的试剂盒中还包含有PCR聚合酶、dNTPs、缓冲液、MgCl2和双蒸水。
本发明的目的之三在于提供鉴定阿胶真伪的方法，鉴定方法简单，技术方案为:
利用所述试剂盒鉴定阿胶真伪的方法，包括如下步骤:
a.取阿胶样品，提取DNA，备用；
b.根据马线粒体DNA序列设计引物，然后以步骤a制备的DNA为模板进行PCR扩增，得PCR扩增产物；
c.将步骤b所得PCR扩增产物进行电泳鉴定，如果PCR扩增产物呈阳性，表明阿胶含有近亲源性动物皮。
优选的，所述步骤b中，所述引物由上游引物和下游引物组成，所述上游引物如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列，所述下游引物如SEQ ID N0.2所示核苷酸序列。
优选的，所述步骤c中，所述近亲源性动物皮为马皮或骡子皮。
优选的，所述步骤b中，所述PCR扩增的退火温度为45_58°C。
更优选的，所述PCR扩增的条件为:94 °C预变性6 min ；94 °C变性30 s, 45-58°C退火30 S，72 °C延伸30 S，35个循环；然后在72 °C后延伸7 min。
本发明有益效果在于:本发明公开了鉴定阿胶真伪的引物，特异性好，灵敏度高，PCR反应体系中DNA终浓度为10_2ng/μ L能检测到，并且能适应较宽的温度范围，在45°C _48°C范围内均能特异扩增，使用方便，不需要特殊试剂，利用该引物与PCR试剂组成试剂盒，使用方便；准确度高，能够准确快速的鉴定出阿胶商品中是否添加有近亲源性动物皮，特别是马皮和骡子皮，该方法即适用于新鲜熬制的样品，也适合于久存的样品。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中:
图1是梯度PCR的扩增产物电泳图(M =DNA标记物；1:45 °C、2:45.6 °C、3:47.6°C>4:50.1 °C>5:53.2 °C>6:55.8°C>7:57.3°C ；8:58°C )。
图2是为PCR扩增产物的电泳图(M =DNA标记物；1:马皮胶DNA ；2:驴皮胶DNA ；
3:骡子皮胶DNA ；4:阴性对照)。
图3是不同DNA浓度扩增电泳图(M:DNA标记物；1:10ng/μ L ;2:5 ng/μ L ；3:
2.5 ng/ μ L ；4:1 ng/ μ L ；5:10_1 ng/ μ L ；6:1CT2 ng/ μ L:7:1CT3 ng/ μ L ；8:1CT4 ng/ μ L ；9:1CT5 ng/ μ L)。
图4是对不同产家阿胶产品提取DNA进行PCR反应获得的扩增产物的电泳图(M:DNA标记物；a:阳性对照；b:阴性对照；c:太极天胶；1:产家一 ；2:产家二 ；3:产家三；
4:产家四；5:产家五；6:产家六；7:产家七；8:产家八；9:产家九；10:产家十；11:产家
i^一)。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。[0028]实施例1
1.材料和试剂
试剂:Taq预混酶Premix Ex-Taq Hot Start Version试剂盒、DNA标记物为分子量标准20bp DNA Ladder Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA荧光染料GelRedTMNuleic Acid Gel Stain IOOOOXin water 购自 Biotium 公司(Cat.N0.41003);丙烯酸胺和N，N-甲叉双丙烯酰胺购自北京鼎国生物技术有限责任公司；5XTBE缓冲液、上样缓冲液6XGlycerol DNA Loading Buffer够自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
材料:马皮胶、驴皮胶和骡皮胶分别由马皮、驴皮和骡子皮煮制获得。
2.检测方法
取马皮胶、驴皮胶和骡皮胶分别提取DNA，得检测用的DNA提取液，稀释至浓度为0.5 μ g/ μ L 10 μ g/ μ L,为DNA稀释液，备用。由于骤为马和驴后代，因此根据马的基因序列(GenBank N0.NC_001640 )设计能够特异扩增马和骡子的线粒体DNA，但不能扩增驴的线粒体DNA的引物序列。根据序列比对和筛选获得检测引物如下:上游引物为 5’ -tccacctagctggggtgtcc-3’ (SEQ ID N0.1),下游引物为:5’-gatcccctcctcctgcgggg-3’ (SEQ ID N0.2)。
以马皮胶提取的DNA为模板(终浓度为IOng/μ L)，SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示核苷酸序列为引物进行梯度PCR，梯度PCR的退火温度设置45-58°C梯度，温度分别为45 0C >45.6 0C >47.6 °C >50.1 °C >53.2 °C、55.8°C、57.3°C 和 58°C，PCR 扩增具体条件为:94 °C预变性 6 min ；94 °C变性 30 s，45 °C _58°C退火 30 s，72 °C延伸 30 s，35 个循环；然后在72 C后延伸7 min ;最后于4 C保存。PCR反应结束后,用8%的聚丙稀酸胺凝月父(PAGE)电泳检测，取 2.5 μ L PCR 产物与 0.5 μ L 6Χ Glycerol DNA Loading Buffer 混合均匀，上样后，100 V电泳40 min，取出凝胶，置于10 mL Gel Red溶液(45 mL蒸馏水，力口入 5 mL lmol/L NaCl 溶液，加 10 μ LGe I Red Nuleic Acid Gel Stain 10000 X in water混合均匀)中在摇床上振摇30 min后，用蒸馏水冲洗凝胶，置于凝胶成像仪下观察，结果如图1所示。由图1可知，在退火温度为45°C-58°C范围内均能扩增出目的条带，表明了此引物能够适应较宽的温度范围。
实施例2
以提取的马皮胶、驴皮胶和骡皮胶分别提取DNA为模板(终浓度为IOng/ μ L)，SEQID N0.1和SEQ ID N0.2所示核苷酸序列为引物进行PCR扩增。上、下游引物均用无菌水稀释至100 μ Μ,分装为5 μ L/管,于-20 °C保存,用之前稀释至10 μ M。加样前将上、下游引物制成混合液，具体为4 μ L 10 μ M上游引物和4 μ L 10 μ M下游引物,加入52 μ L无菌水，混勻。PCR反应体系为10 μ L,具体加样情况如下:Premix Εχ-Taq Hot StartVersion:2.5 μ L，引物混合液:1.5 μ L，提取DNA稀释液I μ L。PCR扩增条件为:94 V预变性6 min ；94 °C变性30 s，45 °C退火30 s，72 °C延伸30 s，35个循环；然后在72 V后延伸7 min ;最后于4 C保存。
PCR反应结束后，用8%的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳检测，取2.5 μ L PCR产物与 0.5 μ L 6X Glycerol DNA Loading Buffer 混合均勻，上样后，100 V 电泳 40 min,取出凝胶，置于10 mL Gel Red溶液(45 mL蒸懼水,加入5 mL lmol/L NaCl溶液,加10μ LGe I Red Nuleic Acid Gel Stain 10000 X in water 混合均勻)中在摇床上振摇 30 min后，用蒸馏水冲洗凝胶，置于凝胶成像仪下观察，结果如图2所示。由图2可知，泳道I和泳道3有两条带(命长片段为I号条带，短片段为II号条带)，泳道I和泳道3分别为马皮胶和骡皮胶的PCR扩增产物，为阳性。泳道2号为驴皮胶的PCR扩增产物，未见条带，因此为阴性；泳道4为阴性对照(以蒸馏水为模板)。
由PCR检测结果可知，SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2能够特异扩增马皮胶和骡皮胶的线粒体DNA，而不能扩增驴皮胶的线粒体DNA，因此可以用此引物检测中药阿胶中是否掺杂有马皮和骡子皮。
将扩增获得I号条带和II号条带，切胶回收，然后送生工生物工程(上海)股份有限公司，测序结果表明，I号条带含有234bp的核苷酸序列，序列如SEQ ID N0.3所示。II号条带长度为120-130bp的核苷酸序列，其测序结果表明为混合物，该条带为非特异性扩增条带，因此只要电泳检测结果出现I号条则为阳性。
实施例3
以马皮胶提取的DNA为模板，终浓度分别为lOng/yLj ng/yL,2.5 ng/yLUng/ μ LUCT1 ng/ μ L、1CT2 ng/ μ L、1CT3 ng/ μ L、1CT4 ng/ μ L和 ICT5 ng/ μ L,将 PCR 的退火温度设置为45°C，其余条 件同实施例2，进行PCR扩增。PCR反应结束后，用8%的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳检测，取2.5 μ L PCR产物与0.5 μ L 6Χ Glycerol DNA Loading Buffer混合均匀，上样后，100 V电泳40 min，取出凝胶，置于10 mL Gel Red溶液(45 mL蒸馏水，加入 5 mL lmol/L NaCl 溶液，加 10 μ LGe I Red Nuleic Acid Gel Stain 10000 X in water混合均匀)中在摇床上振摇30 min后，用蒸馏水冲洗凝胶，置于凝胶成像仪下观察，结果如图3所示。由图3可知，在DNA模板的浓度大于10_2 ng/yL都能检测到，表明该引物用于检测灵敏度高。
实施例4
1.材料和试剂
材料:取市售12个阿胶商品(其中一个样品为重庆太极实业(集团)股份有限公司生产的太极天胶)，分别提取DNA后，稀释5倍得DNA稀释液(均稀释5倍)。
本实施例中试剂的购买途径与实施例1相同。
2.检测方法
取12个阿胶商品的DNA液稀释为模板，以SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列为引物，进行PCR扩增。引物稀释、加样体系和PCR扩增条件同实施例1。
PCR反应结束后，用8 %的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳检测，2.5 μ L PCR产物与 0.5 μ L 6X Glycerol DNA Loading Buffer 混合均勻，上样后，100 V 电泳 40 min,取出凝胶，置于10 mL Gel Red溶液(45 mL蒸懼水,加入5 mL lmol/L NaCl溶液,加10 μ LGelRedTM Nuleic Acid Gel Stain 10000 X in water 混合均勻)中在摇床上振摇 30 min后，用蒸馏水冲洗凝胶，置于凝胶成像仪下观察PCR产物的情况，如果结果呈阴性，为正品阿胶，结果呈阳性，表明阿胶中掺杂有马皮胶和骡皮胶。
结果如图4所示。由图4 (A和B)可知，除太极天胶外，市售的阿胶产品中均呈阳性，表明市售的阿胶产品中含有马皮胶或骡皮胶。
利用本发明公开的以马的保守序列设计特异引物，通过PCR的方法能够检测出阿胶是否由马皮胶或骡皮胶，或者添加有马皮胶或骡皮胶，因此能够鉴别阿胶中是否掺杂有亲源性近的动物皮，能够鉴别阿胶的真伪。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变， 而不偏离所附权利要求
书所限定的本发明。
权利要求
1.鉴定阿胶真伪的引物，所述引物由上游引物和下游引物组成，其特征在于:所述上游引物为SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，所述下游引物为SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
2.含有权利要求
1所述引物的PCR检测试剂盒。
3.鉴定阿胶真伪的方法，其特征在于，包括如下步骤: a.取阿胶样品，提取DNA，备用； b.根据马线粒体DNA序列设计上游引物和下游引物，然后以步骤a制备的DNA为模板进行PCR扩增，得PCR扩增产物；所述上游引物为SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，所述下游引物为SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列； c.将步骤b所得PCR扩增产物进行电泳鉴定，如果PCR扩增产物呈阳性，表明阿胶含有近亲源性动物皮。
4.根据权利要求
3所述的方法，其特征在于:所述步骤c中，所述近亲源性动物皮为马皮或骡子皮。
5.根据权利要求
3-4任一项所述的方法，其特征在于:所述步骤b中，所述PCR扩增的退火温度为45-58 °C。
6.根据权利 要求5所述的方法，其特征在于:所述PCR扩增的条件为:94°C预变性6min ；94 °C变性30 s，45_58°C退火30 S，72 °C延伸30 S，35个循环；然后在72 °C后延伸7 min。
专利摘要
本发明公开了鉴定阿胶真伪的引物，具体鉴定阿胶中是否掺杂近亲源性动物皮，引物由上游引物和下游引物组成，上游引物如SEQIDNO.1所示核苷酸序列，下游引物如SEQIDNO.2所示核苷酸序列；该引物特异性好，灵敏度高，并且能适应较宽的温度范围，该引物能够鉴定阿胶中是否掺杂有近亲源性动物皮，如马皮和骡皮，方法简单，具有广泛的应用前景。
文档编号C12N15/11GKCN102747167 B发布类型授权 专利申请号CN 201210271014
公开日2013年8月28日 申请日期2012年7月31日
发明者赵洁, 左华丽, 白礼西 申请人:重庆太极实业(集团)股份有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3),