专利名称:乙醇酸的酶促生产的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物学和分子生物学领域。更具体地说，提供了一种使用具有改善的腈水解酶活性的突变的腈水解酶，由乙醇腈酶促生产乙醇酸的方法。
背景技术：
乙醇酸(H0CH2C00H ；CAS登记号为79-14-1)是羧酸的a -羟基酸家族的最简单成员。其特性使之理想地广泛用于消费和工业用途，包括用于水井修复、皮革工业、油气工业、洗衣和纺织工业、在聚乙醇酸(PGA)制备中作为单体、以及作为个人护理产品成分。在多个行业中，乙醇酸还是的清洁剂的主要成分(乳制品和食品加工设别清洁剂、家用和机构用清洁剂、工业清洁剂[用于运输设备、砖石建筑、印刷电路板、不锈钢锅炉和加工设备、冷却塔/热交换器]、以及金属加工[用于金属酸洗、铜抛光、蚀刻、电镀、电解抛光])。最近，已报道聚乙醇酸作为阻气性材料(即显示高阻氧特性)用于包装食品及汽水(W02005/106005A1)。然而，乙醇酸的传统化学合成产生了大量的杂质，在用于制备作为阻气性材料的聚乙醇酸之前必须除去。商业化生产乙醇酸的新技术，特别是一种以高纯度及低成本生产乙醇酸的技术，将是工业上所渴望获得的。
已知多种使用相应的a-羟基腈作为原料以及微生物作为催化剂用于制备a-羟基酸的方法。所产生的a-羟基酸的例子包括乙醇酸、乳酸、2-羟基异丁酸、2-羟基-2-苯丙酸、苦杏仁酸、2-羟基-3，3- 二甲基-4- 丁内酯和4-甲硫丁酸。这些产物是使用微生物合成的，例如属于诺卡氏菌属(Nocardia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、金杆菌属(Aureobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳酪杆菌属(Caseobacter)、产喊杆菌属(Alcaligenes)、不动杆菌属(Acinetobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、埃希氏杆菌属(Escherich ia)、微球菌属(Micrococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、黄杆菌属(Flavobacterium)、气单胞菌属(Aeromonas)、枝动杆菌属(Mycoplana)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、假丝酵母属(Candida)、无芽孢杆菌属(Bacteridium)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、镰孢菌属(Fusarium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、细杆菌属(Microbacterium)、Obsumbacterium和戈登氏菌属(Gordona)的那些微生物(相应于 US 5，223，416 的 JP-A-4-99495、JP-A-4-99496 和 JP-A-4-218385 ;相应于 US5，234，826 的 JP-A-4-99497 ;相应于 US 5，296，373 的 JP-A-5-95795 ； JP-A-5-21987 ；相应于 US 5，326，702 的 JP-A-5-192189 ;相应于 EP-A-0610048 的 JP-A-6-237789 ;相应于EP-A-0610049 的 JP-A-6-284899 ;相应于 US 5，508，181 的 JP-A-7-213296)。
然而，大多数已知的上述由相应的a -羟基腈制备a _羟基酸的方法并不产生并以足够高的浓度积聚产物，以满足商业上的需要。经常的结果是在反应初期酶就失活。US5，756，306教导了“当使用腈水解酶或腈水合酶酶促水解或水合a-羟基腈以产生羟基酸或a-羟基酰胺时，所出现的问题是在短时间内酶失活。因此，难以以高浓度和高产率获得a -羟基酸或a -羟基酰胺”(第I栏，第49-54行)。维持反应混合物中醛浓度(由a-羟基腈解离为醛和氰化氢所形成的)和/或a-羟基腈浓度在规定的范围内是一种避免该问题的方法。
US 5，508，181提出了涉及酶快速失活的更多困难。特别是，U. S. 5，508，181提及根据解离平衡，a-羟基腈化合物部分解离为相应的醛。这些醛通过与蛋白结合，在短时间内失活酶，因此很难由a-羟基腈以高产率获得高浓度的a-羟基酸或a-羟基酰胺(第2栏，第16-29行)。阻止由于醛积聚所引起的酶失活的解决方案是将磷酸盐或次磷酸盐离子添加到反应混合物中。US 5，326，702使用亚硫酸盐、二亚硫酸盐或连二亚硫酸盐离子来螯合醛并阻止酶失活。然而，即使通过使用上述这样的添加剂，所产生和积聚的a-羟基酸 的浓度仍然是不高的。
U. S. 6，037，155教导了 a -羟基酸产物的低积聚与由于解离的醛积聚所引起的短时间内酶失活相关。这些发明人提出在水中a-羟基腈部分解离所产生的氰化氢(Agricultural Biological Chemistry, Vol. 46, pages 1165 (1982))以及相应的醒或酮(Chemical Reviews, Vol. 42, pages 189 (1948))存在下，酶活性受抑制。本发明人通过使用微生物解决了醛诱导的酶失活问题，所述微生物酶活性能通过将氰化物添加到反应混合物中而得到改善。氰化物的添加限制了 a-羟基腈解离为醛和氰化氢。
具体就乙醇酸生产来说，已知乙醇腈能可逆解离为氰化氢和甲醛，两者都可失活酶活性。US 3，940，316描述了一种由相应的腈制备有机酸的方法，使用了具有“腈水解(nitrilasic) ”活性的细菌，并列出乙醇腈作为底物。具体来说，该专利描述了对于该目的使用芽孢杆菌属、无芽孢杆菌属、微球菌属和短杆菌属细菌。虽然被描述具有腈水解活性，但是短杆菌R312 (Brevibacterium R312)是在US 3，940，316所有实施例中使用的唯一菌株。已知短杆菌R312具有腈水合酶和酰胺酶活性，但没有腈水解酶活性(Toumeix等，Antonie van Leeuwenhoek, 52 :173-182(1986))。
一种通过利用属于棒状杆菌(Corynebacterium spp.)的微生物制备乳酸、乙醇酸和2-羟基异丁酸的方法披露于日本专利公开号昭61-56086中。JP 09028390披露了一种通过红球菌属或戈登氏菌属水解酶起作用，由乙醇腈制备乙醇酸的方法。报道了对乙醇酸的选择性几乎为100%，没有乙醇酸酰胺生成。US 6，037，155披露了由a -羟基腈产生包括乙醇酸的a-羟基酸的方法的例子。该公开内容承认由于前述问题之故并非所有的微生物催化剂都能产生高浓度的乙醇酸，并教导应当进行筛选研究以便发现在工业上有益的微生物。US 6, 037, 155具体鉴定了抗a-轻基腈或a -轻基酸抑制效应的Variovorax spp.和节杆菌(Arthrobacter spp.)微生物,具有持久的活性,并能在高浓度下产生期望的产物。
敏捷食酸菌(Acidovoraxfacilis) 72W(ATCC 55746)具有脂族腈水解酶(EC
3.5. 5. 7)活性，以及腈水合酶(EC 4. 2. I. 84)和酰胺酶(EC 3. 5. I. 4)活性组合的特征。US5，814，508披露了于35-701，在适合的缓冲液中加热敏捷食酸菌721(4了0 55746)悬浮液一段短时间以钝化全细胞催化剂不需要的腈水合酶和酰胺酶活性，不产生明显减少的期望的腈水解酶活性。
已克隆并重组表达了编码敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的基因((相应于 US 6, 870, 038 的 W 01/75077)和 Chauhan 等，Appl Microbiol Biotechnol,61 118-122(2003))。敏捷食酸菌72W腈水解酶能以高产率将a-羟基腈转化为相应的a-羟基羧酸(US 6，383，786)，包括乙醇酸(US 6，416，980)。然而，对于降低工业生产成本，用于以高达100%转化的高产率将乙醇腈转化为乙醇酸的具有改善的腈水解酶活性的突变的腈水解酶应当是十分有用的。
一种使用酶催化剂经济地生产乙醇酸的方法需要利用能以高浓度将乙醇腈转化为乙醇酸，并具有高催化剂生产率(公斤乙醇酸/公斤酶催化剂)和容积生产率(乙醇酸克数/升/小时)的催化剂。酶催化剂可用于多步连续分批反应(multiple consecutivebatch reactions)中，或用于恒量添加乙醇腈并移除乙醇酸的连续反应中；在任何一种操作方式中，催化剂活性和寿命应以致于获得高容积生产率和催化剂生产率，并且在分批反应情况下，催化剂应当在多个反应循环中得到利用，而不在连续分批反应之间明显损失酶 活性。具有改善的用于乙醇腈水解的腈水解酶活性的突变的腈水解酶能提供改善的容积生产率。鉴于在乙醇腈反应混合物中游离甲醛(以及可能的其他杂质)的失活效应会不同程度地消极影响所有腈水解酶催化剂的事实，还需要在用于乙醇腈水解的反应条件下稳定酶活性的改善(产生相对增加的催化剂生产率)。
待解决的问题是提供一种利用具有明显改善的用于乙醇腈水解的腈水解酶活性的酶催化剂增加乙醇酸体积生产率的方法。待解决的额外问题是提供一种增加用于乙醇酸生产的酶催化剂生产率和稳定性，由此降低酶催化剂成本和生产总成本的方法。
发明内容
本发明提供了由乙醇腈酶促生产乙醇酸的方法。提供了一种由乙醇腈生产乙醇酸的方法，包括
a)将适合的含水反应混合物中的乙醇腈与包含具有腈水解酶活性的多肽的酶催化剂接触，所述多肽具有SEQ ID NO :6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个选自以下的氨基酸取代
(I)在氨基酸残基第168位用赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或缬氨酸取代；和
(2)在氨基酸残基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或苏氨酸取代；
由此产生乙醇酸；和
b)以盐或酸的形式回收(a)中产生的乙醇酸；其中当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述酶催化剂提供了至少I. 5倍腈水解酶活性的增加。
在本发明的另一方面，提供了一种编码具有腈水解酶活性的多肽的分离的核酸分子，所述核酸分子编码具有SEQ ID NO :6的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有至少一个选自以下的氨基酸取代
a)在氨基酸残基第168位用甲硫氨酸或苏氨酸取代；和[0023]b)在氨基酸残基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或苏氨酸取代；
其中当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述多肽提供了至少I. 5倍腈水解酶活性的增加。
在又一方面，提供了一种当将乙醇腈转化为乙醇酸时，显示明显改善的腈水解酶活性的分离的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个选自以下的氨基酸取代
a)在氨基酸残基第168位用甲硫氨酸或苏氨酸取代；和
b)在氨基酸残基第201位用谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸或苏氨酸取代；其中当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述多肽提供了至少I. 5倍腈水解酶活性的增加。
序列表和牛物学保藏简沭
以下序列描述和附于此的序列表符合37C. F. R. § I. 821-1. 825所列的指导专利申请中核苷酸和/或氨基酸序列披露的规定。序列描述包含符合Nucleic Acids Research
13:3021-3030(1985)和 Biochemical Journal 219 (No. 2) :345-373 (1984)(它们在此并入作为参考)中所述的IUPAC-IYUB标准规定的对于核苷酸序列字符的单字母编码和对于氨基酸的三字母编码。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式符合37C. F. R. § I. 822的规定。
SEQ ID NO :1是用于扩增敏捷食酸菌72W腈水解酶编码序列的引物165的核苷酸序列。随后，将所扩增的PCR产物克隆入pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA ；GenBank L09137)以创建质粒 pSWl38。
SEQ ID NO :2是用于扩增敏捷食酸菌72W腈水解酶编码序列的引物166的核苷酸序列。随后，将所扩增的PCR产物克隆入pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA ；GenBank L09137)以创建质粒 Pswi38。
SEQ ID NO :3是用于扩增敏捷食酸菌72W腈水解酶的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO 4是用于扩增敏捷食酸菌72W腈水解酶的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO :5是敏捷食酸菌72W腈水解酶编码序列的核苷酸序列，包含由TTG至ATG的起始密码子改变以利于在大肠杆菌中重组表达。
SEQ ID NO 6是推断的由SEQ ID NO 5的核苷酸序列编码的敏捷食酸菌72W腈水解酶的氨基酸序列，所述核苷酸序列包含由TTG至ATG的起始密码子改变以利于在大肠杆菌中重组表达。
SEQ ID NO :7是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第201位产生单个氨基酸取代(L201Q ；Leu — GIn)。
SEQ ID NO :8是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO 7)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第201位包含单个氨基酸取代(Leu201 — GIn)。
SEQ ID NO :9是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第201位产生单个氨基酸取代(L201A ；Leu — Ala)。
SEQ ID NO : 10是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO 9)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第201位包含单个氨基酸取代(Leu201 — Ala)。
SEQ ID NO : 11是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第201位产生单个氨基酸取代(L201C ；Leu — Cys)。
SEQ ID NO: 12是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO 11)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第201位包含单个氨基酸取代(Leu201 — Cys)。
SEQ ID NO : 13是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第201位产生单个氨基酸取代(L201T ；Leu — Thr)。
SEQ ID NO: 14是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO 13)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第201位包含单个氨基酸取代(Leu201 — Thr)。
SEQ ID NO : 15是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第201位产生单个氨基酸取代(L201G ；Leu — Gly)。
SEQ ID NO: 16是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO 15)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第201位包含单个氨基酸取代(Leu201 — Gly)。
SEQ ID NO : 17是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第201位产生单个氨基酸取代(L201H ；Leu — His)。
SEQ ID NO :18是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO 17)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第201位包含单个氨基酸取代(Leu201 — His)。
SEQ ID NO :19是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第201位产生单个氨基酸取代(L201K ；Leu — Lys)。
SEQ ID NO :20是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO 19)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第201位包含单个氨基酸取代(Leu201 — Lys)。
SEQ ID NO :21是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第201位产生单个氨基酸取代(L201N ；Leu — Asn)。
SEQ ID NO :22是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO 21)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第201位包含单个氨基酸取代(Leu201 — Asn)。
SEQ ID NO :23是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第201位产生单个氨基酸取代(L201S ；Leu — Ser)。
SEQ ID NO :24是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO 23)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第201位包含单个氨基酸取代(Leu201 — Ser)。
SEQ ID NO :25是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第168位产生单个氨基酸取代(F168K ；Phe — Lys)。
SEQ ID NO :26是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO 25)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第168位包含单个氨基酸取代(Phe 168 — Lys)。
SEQ ID NO :27是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第168位产生单个氨基酸取代(F168M ；Phe — Met)。
SEQ ID NO :28是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO 27)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第168位包含单个氨基酸取代(Phe 168 — Met)。
SEQ ID NO :29是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第168位产生单个氨基酸取代(F168T ；Phe — Thr)。[0060]SEQ ID NO :30是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO 29)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第168位包含单个氨基酸取代(Phe 168 — Thr)。
SEQ ID NO :31是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第168位产生单个氨基酸取代(F168V ；Phe — Val)。
SEQ ID NO :32是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO 31)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第168位包含单个氨基酸取代(Phe 168 — Val)。
SEQ ID NO :33是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第168位产生单个氨基酸取代(T210A ；Thr — Ala)。
SEQ ID NO :34是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO 33)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第210位包含单个氨基酸取代(Thr210 — Ala)。SEQ ID NO :35是包含密码子改变的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体的核苷酸序列，其在残基第168位产生单个氨基酸取代(T210C ；Thr — Cys)。
SEQ ID NO :36是推断的突变的腈水解酶(SEQ ID NO 35)的氨基酸序列，在敏捷食酸菌72W腈水解酶的残基第210位包含单个氨基酸取代(Thr210 — Cys)。
SEQ ID NO 37 是在大肠杆菌 SS1001 (ATCC PTA-1177 ；US 6，870，038，在此并入作为参考)中表达的敏捷食酸菌72W腈水解酶基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO :38是推断的在大肠杆菌SS1001 (ATCC PTA-1177)中表达的敏捷食酸菌72W腈水解酶(SEQ ID NO 33)的氨基酸序列。
业已依据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约条款的规定进行了以下生物学保藏
保藏人识别参考国际保藏编号保藏日
敏捷食酸菌72WATCC 557461996年3月8日
大肠杆菌 SS1001 ATCC PTA-1177 2000 年 I 月 I I 日
如本文所使用的，“ATCC”指美国典型培养物保藏中心，位于ATCC，10801University Blvd. ,Manassas,VA 20110-2209，USA的国际保藏机构。“国际保藏编号”是在ATCC保藏的培养物的保藏号。
所列的保藏物应当在所指明的国际保藏机构保藏至少三十(30)年，并且公众在得到披露其的专利授权之后可以获得。保藏物的可利用性并不构成对实施本发明的许可，这种实施会破坏通过政府行为授予的专利权。
具体实施方式
已通过提供了一种利用具有改善的腈水解酶活性的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体，以高产率及在高浓度下由相应的乙醇腈制备乙醇酸的方法解决了所述问题。该解决所述问题的方法包括1)利用具有改善的腈水解酶活性和/或改善的用于将乙醇腈转化为乙醇酸的催化剂生产率的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体，和2)在用于将乙醇腈转化为乙醇酸的反应条件下，改善催化剂稳定性和/或生产率的方法。该在用于将乙醇腈转化为乙醇酸的反应条件下，改善催化剂稳定性/生产率的方法，包括I)利用添加剂来稳定酶催化剂活性，2)在基本上无氧的条件下运行反应，和3)控制乙醇腈到反应混合物中的进料速度，以便保持乙醇腈的目标浓度。
定义
在本文中，使用了许多术语和缩写。除非另作明确说明，否则使用以下定义。
如本文所使用的，术语“包含”表示如权利要求
中所提及的规定的特征、整体、步骤或组分的存在，但其并不排除一个或多个其他特征、整体、步骤、组分或它们的组的存在或添加。
如本文所使用的，修饰所使用的本发明成分或反应物的数量的术语“约”指数量上的变化，所述变化可例如通过用于在真实世界中制备浓缩物或使用溶液的标准量度和液体处理工序；通过在这些工序中的疏忽过失；通过用于制造组合物或执行方法的产品、原料或配料纯度的差异等产生。术语“约”还包含由于由特定的初始混合物产生的组合物的不同的平衡条件之故所相异的量。无论是否为术语“约”所修饰，权利要求
包括相等的量。在 一个实施方案中，术语“约”表示在所报告的数值的10%之内，优选在所报告的数值的5%之内。
如本文所使用的，术语“回收”表示分离、纯化或转移利用本发明方法所生成的产物。分离和纯化来自反应混合物的产物的方法是本领域众所周知的，可包括但不限于选择性沉淀、结晶、过滤、反应性溶剂萃取、离子交换、电渗析、聚合、蒸馏、热分解、醇解以及它们的组合。在一个实施方案中，术语“回收”还可包括将反应混合物(通常在滤除酶催化剂之后)转移到另一种反应中以产生一种或多种额外的产物。
如本文所使用的，术语“酶催化剂”或“微生物细胞催化剂”指具有用于将乙醇腈转化为乙醇酸和氨的腈水解酶活性特性的催化剂(即包含至少一种具有腈水解酶活性的多肽)。酶催化剂可以完整的微生物细胞、透化处理的微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞成分、部分纯化的酶或纯化的酶的形式存在。酶催化剂可以是游离的(未固定的)或固定在可溶性或不溶性支持物中或其上。如本文所使用的，“再循环的酶催化剂”指在分批反应中被再生为酶催化剂的酶催化剂。
如本文所使用的，术语“催化剂生产率”和“酶催化剂生产率”指每克催化剂产生的产物总量。在本发明中，所述催化剂是腈水解酶(EC3. 5. 5. 7)，所产生的产物是乙醇酸和/或乙醇酸铵(取决于反应的pH)。一般而言，在基本上pH中性的条件下进行本发明方法，以便所产生的乙醇酸主要以乙醇酸相应的盐(即乙醇酸铵)的形式存在。一般来说，在具有催化剂再循环的分批反应中，随每一次循环反应催化剂活性而降低(酶失活)。
如本文所使用的，术语“敏捷食酸菌(Acidovorax facilis) ”和“敏捷食酸菌(A. facilis)”可交换地使用，并指保藏在美国典型培养物保藏中心(国际保藏机构)，具有保藏号55746( “ATCC 55746”)的敏捷食酸菌72W。
如本文所使用的,术语“大肠杆菌(Escherichia coli)”和“大肠杆菌(E. coli) ”可交换地使用。一些适合用于重组表达的大肠杆菌菌株描述于此，包括但不限于具有国际保藏编号ATCC 47076的大肠杆菌MG1655、具有国际保藏编号ATCC 53911的大肠杆菌FM5、具有国际保藏编号ATCC 27325的大肠杆菌W3110、具有国际保藏编号ATCC 35695的大肠杆菌MC4100和具有国际保藏编号ATCC 12435的大肠杆菌W1485。在一个实施方案中，适合的大肠杆菌菌株包括大肠杆菌FM5 (ATCC 53911)和大肠杆菌MG1655 (ATCC 47076)。
如本文所使用的，术语“大肠杆菌SS1001”或“SS1001”指表达敏捷食酸菌72W腈水解酶的转化的大肠杆菌菌株，具有ATCC登记号PTA-1177 (US 6，870, 038 ;其全文在此并入作为参考)。与野生型72W腈水解酶序列(SEQ ID NO :6)相比，重组表达的大肠杆菌SS1001腈水解酶(SEQ ID NO 38)含有2个小的序列改变。起始密码子由GTG变为ATG以利于重组表达，并在克隆过程中导入在C-末端附近引起单个氨基酸改变(Pro367[CCA] — Ser[TCA])的人工序列。
如本文所使用的，术语“乙醇腈”缩写为“GLN”，并且与羟基乙腈、2-羟基乙腈、羟基甲腈以及CAS登记号107-16-4的所有其他异名同义。
如本文所使用的，术语“乙醇酸”缩写为“GLA”，并且与羟基乙酸(hydroxyaceticacid)、轻基醋酸(hydroxyethanoic acid)以及CAS登记号79_14_1的所有其他异名同义。经本发明方法产生的乙醇酸可以质子化的羧酸和/或相应的铵盐的形式存在。
如本文所使用的，术语“乙醇酸铵”缩写为“NH4GLA”。如本文所使用的，术语“乙交酯”指CAS登记号502-97-6的化合物。
如本文所使用的，术语“适合的含水乙醇腈反应混合物”和“适合的含水反应混合物，，指其中乙醇腈和酶催化剂得到接触的物质和水。
如本文所使用的，术语“腈水解酶催化剂”指具有腈水解酶活性(EC3. 5. 5. 7)特性的酶催化剂。腈水解酶直接将脂族腈转化为相应的羧酸，不形成作为中间体的相应的酰胺(方程式I)。
方程式I.
权利要求
1.一种由乙醇腈生产乙醇酸的方法，包括 a)将适合的含水反应混合物中的乙醇腈与包含具有腈水解酶活性的多肽的酶催化剂接触，由此产生乙醇酸，所述多肽如SEQ ID NO: 18所示；和 b)以盐或酸的形式回收(a)中产生的乙醇酸；其中当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于敏捷食酸菌72W腈水解酶的腈水解酶活性，所述酶催化剂提供了至少I. 5倍腈水解酶活性增加。
2.权利要求
I的方法，其中酶催化剂是当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的活性提供了至少约2倍腈水解酶活性改善的改良的腈水解酶催化剂。
3.权利要求
I的方法，其中酶催化剂是当在相同的反应条件下将乙醇腈转化为乙醇酸时，相对于敏捷食酸菌72W(ATCC 55746)腈水解酶的活性提供了至少约4倍腈水解酶活性改善的改良的腈水解酶催化剂。
4.权利要求
I的方法，其中酶催化剂以完整的微生物细胞、透化处理的微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种成分、部分纯化的酶或纯化的酶的形式存在。
5.权利要求
4的方法，其中所述完整的微生物细胞是重组表达所述多肽的转化的微生物宿主细胞。
6.权利要求
4的方法，其中转化的微生物宿主细胞选自丛毛单胞菌、棒状杆菌、短杆菌、红球菌、固氮菌、柠檬酸杆菌、肠杆菌、梭状芽孢杆菌、克雷白氏杆菌、沙门氏菌、乳酸杆菌、曲霉、糖酵母、接合酵母、毕赤酵母、克鲁维酵母、假丝酵母、汉森氏酵母、杜氏藻、德巴利氏酵母、毛霉菌、球拟酵母、甲基杆菌、芽孢杆菌、埃希氏杆菌、假单胞菌、根瘤菌和链霉菌。
7.权利要求
6的方法，其中转化的微生物宿主细胞是大肠杆菌。
8.权利要求
7的方法，其中转化的微生物宿主细胞是选自大肠杆菌MG1655和大肠杆菌FM5的大肠杆菌菌株。
9.权利要求
1-8任一项的方法，其中酶催化剂固定在可溶性或不溶性的支持物中或支持物上。
10.权利要求
I的方法，其中在含水反应混合物中产生的乙醇酸铵的浓度为约0.02wt% 至约 90 wt %。
11.权利要求
10的方法，其中在含水反应混合物中产生的乙醇酸铵的浓度为约0.02wt % 至约 40 wt %。
12.权利要求
9的方法，其中含水反应混合物中乙醇腈的浓度为约5mM至约I M。
13.权利要求
12的方法，其中通过连续或等分物添加保持含水反应混合物中的乙醇腈浓度。
14.权利要求
I的方法，其中含水反应混合物中pH保持在约5.5至约7. 7。
15.权利要求
I的方法，其中在基本上无氧的条件下进行乙醇腈酶促转化为乙醇酸。
16.权利要求
I的方法，其中含水反应混合物进一步包含小于5wt %浓度的选自硫代硫酸钾和连二亚硫酸钠的稳定剂。
17.权利要求
I的方法，其中酶催化剂是再循环的酶催化剂。
18.权利要求
I的方法，其中酶催化剂提供了每克酶催化剂细胞干重产生至少300克乙醇酸的催化剂生产率。
19.权利要求
18的方法，其中酶催化剂提供了每克酶催化剂细胞干重产生至少450克乙醇酸的催化剂生产率。
20.权利要求
19的方法，其中酶催化剂提供了每克酶催化剂细胞干重产生至少1000克乙醇酸的催化剂生产率。
专利摘要
本发明涉及乙醇酸的酶促生产。具体地，提供了由乙醇腈酶促生产乙醇酸的多种方法。这些方法包括1)利用具有改善的用于将乙醇腈转化为乙醇酸的腈水解酶活性的敏捷食酸菌72W腈水解酶突变体，和2)改善催化剂稳定性和/或生产率的方法。该改善催化剂稳定性和/或生产率的方法包括利用反应稳定剂，在基本上无氧的条件下运行反应以及控制反应混合物中底物的浓度。
文档编号C12R1/19GKCN102796769SQ201210290815
公开日2012年11月28日 申请日期2005年12月21日
发明者R.迪科西莫, M.S.佩恩, A.帕诺瓦, D.P.奥基夫, J.S.汤普森 申请人:纳幕尔杜邦公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan