后，12000rpm离心lOmin，取上清。
[0038] PCR反应体系如下：
[0039] 试剂 体积 模板 15 KL IOx缓冲液 5 JiL MgC12 (25 mmol/L) 3 pL dNTPs (2.5 mmol/L) 4 JiL 上、下游引物 P，R (20 μιηοΙ/L) 1 μ? TaqTM 酶（5 UVL) 0.25 pL 双蒸水 至50 pL
[0040] 反应参数：95°C 预变性 5min，94°C 变性 lmin，55°C 复性 lmin，72°C 延伸 lmin，35 个 循环，72°C延伸lOmin。
[0041] 3、PCR产物的回收与纯化
[0042] PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，100V，50min。凝胶呈像系统进行观察，拍照。
[0043] 紫外灯下，使用刀片切下含目的片段的凝胶，吸水纸吸干后，置于离心管中，称重。 按照北京百泰克生物技术有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒操作说明书进行操作如 下：
[0044] (1)加入三倍体积的溶胶/结合液；
[0045] (2)56°C水浴放置10min(至胶完全溶解），2-3分钟涡旋震荡数次，帮助加速溶 解；
[0046] (3)将溶解的胶溶液加入到收集管中的吸附柱，12000rpm离心30-60s ;
[0047] (4)将700 μ L漂洗液加入到吸附柱中，12000rpm离心Imin ;
[0048] (5)将吸附柱置于空收集管中，12000rpm离心2min ;
[0049] (6)将吸附柱置于1.5ml无菌离心管中，将50yL洗脱缓冲液加入到吸附膜中间， 室温放置2min，12000rpm离心lmin，收集物保存于_20°C。
[0050] 4、回收产物与pMD18-T-E2载体连接与转化
[0051] 连接
[0052] 按大连宝生物PMD18-T载体操作试剂盒说明书将PCR回收产物与pMD18-T载体连 接。连接体系如下：
[0053] pMD18-T I |〇L Vector 回收片段 4μΙ^ Solution I 5 \\L
[0054] 混匀后4°C连接过夜。
[0055] 感受态细胞的制备
[0056] (1)接种针挑取大肠杆菌（_80°C保存），在LB培养基平板划线，37°C培养；挑取单 菌落，接种于LB培养基（5ml)，振荡培养过夜；
[0057] (2)菌液接种于100ml LB (1 : 100)液体培养基，震荡培养3h，至 0D600 ^ 0. 3-0. 8 ；
[0058] (3)无菌条件下将IOOml细菌培养液转移到一个用冰预冷的50ml离心管中，冰上 放置20min ;
[0059] (4) 4°C离心，5000rpm，IOmin ;
[0060] (5)弃上清，将离心管倒置lmin，以使最后残留的痕量培养液流尽；
[0061] (6)加 IOml 预冷的 CaCl2 (0· lmol/L)溶液，冰上放置 30min ;
[0062] (7) 4°C离心，5000rpm，lOmin，弃上清；
[0063] (8)加 IOml预冷的CaCl2 (0· lmol/L)溶液重悬细胞，加入20%甘油，-80°C贮存。
[0064] 转化
[0065] (1)从_80°C取出制备的DH5a感受态细菌，置冰上，完全解冻后，加入10 μ L连接 产物，轻轻混匀，冰上放置30min ;
[0066] ⑵将混合物42°C加热45s后，置冰上Imin ;
[0067] (3)加入890 μ L LB培养基，37°C振荡培养60min ;
[0068] (4)菌液涂于含有X_gal、IPTG、Amp的LB琼脂培养基，正向放置30min后，37°C倒 置培养过夜，进行蓝白斑筛选；
[0069] (5)挑选3个白色菌落，接种于含有氨苄青霉素（100 μ g/ml)的LB液体培养基进 行培养。
[0070] 5、重组质粒的提取
[0071] 含有重组质粒的DH5 α菌在含有Amp的LB液体培养基培养后，提质粒酶切鉴定：
[0072] 参照威格拉斯质粒小量提取试剂盒，提取PMD18-T-E2质粒，操作如下
[0073] (1)收菌：取过夜培养的DH5 α细菌2ml，置于2ml离心管中，离心，12000rpm， 2min，弃上清，取沉淀；
[0074] (2)重悬：加入200 μ L Pl缓冲液，充分混悬震荡菌体沉淀10-15s，使其完全散开， 至无絮状物存在；
[0075] (3)裂解：加入200 μ L Ρ2缓冲液，轻轻点到离心管3-5次，室温放置2-3min，使细 菌完全裂解，溶液透明，裂解时间不超过5min ;
[0076] (4)中和：加入300 μ L P3缓冲液，轻轻颠倒离心管4-6次，充分混勾，室温放置 l-5min，可见白色絮状产生，离心12000rpm，8min ;
[0077] (5)柱平衡：向插入套管的离心柱内加入300 μ L PE缓冲液，12000rpm，30s ;
[0078] (6) DNA结合：中和后离心的质粒粗提物上清小心吸出，转移至经平衡液处理过的 离心柱内，离心，12000rpm，30s，弃去套管内液体，将离心柱插回套管；
[0079] (7)清洗：向离心柱内加入500 μ L PWT缓冲液，离心，12000rpm，30s，弃去套管内 废液；
[0080] (8)再清洗：加入700 μ L PW PWT缓冲液，离心，12000rpm，30s，弃去套管内废液， 再次离心2min ;
[0081] (9)收离心柱：小心取出离心柱，不要沾上套管内的废液，弃去套管；
[0082] (10)洗脱DNA :将离心柱插入一个新的I. 5ml离心管，在离心管内硅胶膜中心位置 加入100 μ L洗脱液，12000rpm，lmin，离心管中即得纯化的质粒DNA溶液，-20°C保存。
[0083] 6、重组质粒的酶切鉴定
[0084] 重组质粒使用BamH I、XhoI进行酶切鉴定，酶切体系如下。酶切产物进行琼脂糖 凝胶（〇.8%)DNA电泳，100V，50min。电泳后，凝胶置凝胶呈像系统进行观察。目的片段使 用DNA凝胶回收试剂盒回收（操作如上），-20°C保存。
[0085] BamH I I pL Xho I I pL 1〇χ缓冲液 2 pL 质粒 5 μι 加蒸馏水至 20 pL
[0086] 37°C酶切反应2h
[0087] 7、表达质粒pET_32a扩增
[0088] 取实验室保存的含pET_32a载体的Bal21 (DE3)菌株，按1 : 100接种于含有氨苄 青霉素（100 μ g/ml)的LB培养基，培养过夜。质粒使用试剂盒提取，-20°C贮存备用。
[0089] 8、重组表达质粒pET-32a_E2的构建及鉴定
[0090] 克隆载体PMD18-T-E2及表达载体pET-32a分别使用BamH I及Xho I双酶切，酶切 体系如上所述。将酶切产物进行电泳，目的片段使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，操作如上 所述。按照DNA连接试剂盒操作说明，将酶切回收片段pET-32a载体和E2片段进行连接， 连接体系如下。
[0091 ] 连接产物（10 μ L)转化DH5 α感受态细胞（转化过程如上所述），菌液涂布于含有 氨苄青霉素（1〇〇 μ g/L)的LB固体培养基，37°C培养过夜。挑取单菌落，接种于含有氨苄青 霉素（100 μ g/L)的LB培养基进行培养。提取质粒，经酶切和PCR鉴定后，阳性质粒命名为 pET-32a-E2,并将阳性质粒转化Bal21 (DE3)感受态细胞。
[0092] 连接体系如下
[0093] pET-32a 3 μ L
[0094] E2 2 μ L
[0095] Solution I 5 μ L
[0096] 4 °C连接过夜。
[0097] 9、E2基因诱导表达时间的确定
[0098] 将含有pET-32a-E2的Bal21菌接种于含有氨苄青霉素（100 μ g/mL)的LB液体培 养基，37°C振荡培养至0D600达到0. 6-1. 0时，加入IPTG(ImmoVL)诱导表达，分别收集诱 导后0h、2h、3h、4h、5h和6h菌液lml，离心，8000rpm，5min，收集沉淀，进行SDS-PAGE电泳分 析。pET-32a空载体诱导前、诱导后4h，各取lml，作为对照。
[0099] SDS-PAGE 电泳：
[0100] 制胶：洗净玻璃板，固定在制胶器上，按分离胶配方，依次加入各试剂，最后加入过 硫酸铵，上下颠倒混匀后，快速注入两玻璃板之间，胶上覆盖一层双蒸水，静置30min。倾去 上层双蒸水，吸水纸吸干残留的双蒸水，加入配置好的5%浓缩胶，水平插入梳子，静置2h。 垂直移去梳子，去掉制胶器，移入电泳槽，在内、外槽加入电泳缓冲液，电泳液没过胶孔，使 用注射器吸取电泳液，冲洗胶孔中残留胶。
[0101] 上样：样