理盐水对抗原进行稀释，取抗原溶液，加入等体积的弗氏完全佐剂进 行乳化，待其形成良好的油包水型，向20周龄禽类进行初次免疫注射，免疫剂量为200? 800 μ g/只，初次免疫21天之后，进行4次加强免疫，间隔时间为21天，免疫剂量为200? 800 yg/只。收集免疫前后鸡蛋，75%酒精消毒，标号，4°C保存（15?60天）。
[0153] 23、IgY抗体提取与鉴定
[0154] 聚乙二醇（PEG-6000)沉淀法提取IgY抗体，操作步骤如下：
[0155] (1)分离器分离卵黄与蛋清；
[0156] (2)卵黄和PBS缓冲液（pH7. 0?7. 8) 1 : 2混合，涡旋，充分混匀；
[0157] (3)加入3. 5% (W/V，下同）的PEG-6000,涡旋混合，摇床上室温作用10?30min ;
[0158] (4)离心（10000rpm，4°C，20min，下同）后，出现分层，由上而下为黄色脂肪层、清 亮层（IgY)和半固体层；
[0159] (5)液体经滤纸过滤，弃去沉淀物，记录所得滤液体积，加8. 5 % PEG-6000，摇床上 室温作用10?30min ;
[0160] (6)离心，如上，弃去上清液，沉淀物加 IOml PBS溶解，加12% (L 2g)PEG6000,在 摇床上室温作用10?30min ;
[0161] (7)离心，如上，弃去上清液，沉淀物加 I. 2ml PBS溶解；
[0162] (8)溶解液转移到透析袋中，大容量PBS溶液中（IOOOml)透析过夜；
[0163] (9)隔天将透析器内IgY抗体液取出，标记，_20°C储存备用。
[0164] 提纯IgY抗体经SDS-PAGE电泳分析，以鉴定IgY抗体提取纯度。24、IgY抗体效 价的监测
[0165] 间接ELISA法测定抗BVDV-E2IgY抗体效价，操作步骤如下：
[0166] (1)重组蛋白使用包被缓冲液（CBS，ρΗ9· 0)进行稀释（10 μ g/ml)，100 μ L/孔进 行包被，4°C孵育过夜；
[0167] (2)PBST-20 洗涤 3 次，5min/ 次；
[0168] (3)加入封闭缓冲液（2% PBS-BSA) 200 μ L/ 孔，37°C 封闭 2h ;
[0169] (4) PBST-20 洗涤，同上；
[0170] (5) IgY抗体使用PBSM，倍比稀释1 : 1000,直至1 : 128000;非特异性IgY抗体， PBS(pH7. 2)分别作为阴性和空白对照，37°C孵育Ih ;
[0171] (6)PBST_20 洗涤，同上；
[0172] (7)加 HRP标记的山羊抗鸡的抗体（1 : 5000)，37°C孵育Ih ;
[0173] (8) PBST 洗涤，同上；
[0174] (9)每孔加入 100 μ L 显色液（IOmL 底物缓冲液，150 μ L TMB，30 μ L 的 H2O2)，37°C 作用15min ;
[0175] (10)每孔加入50 μ L的2M H2S04?行终止，读值0D450。
[0176] 25、IgY 抗体 Western blot 鉴定
[0177] SDS-PAGE电泳分离E2重组蛋白，转膜后进行Western blot鉴定，方法如上。IgY 抗体作为一抗，1 : 2000稀释，HRP标记的羊抗鸡二抗进行稀释，稀释度为1 : 6000。
[0178] 26、结果
[0179] (I)IgY抗体的提取及鉴定
[0180] 提纯IgY经SDS-PAGE电泳后，主要包括两条带，65ku和19ku，且在40ku附近出现 低分子量片段，表明用PEG-6000经过三次浓度梯度的纯化，其纯度很高。
[0181] (2) ELISA 效价测定
[0182] 抗BVDV重组E2蛋白特异性IgY抗体，使用间接ELISA测定，抗体效价在二免后，开 始升高，一周后，缓慢降低，三免加强免疫后，效价继续升高，四免后，效价达到1 : 128000。
[0183] (3) Western blot 鉴定
[0184] 重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，进行转膜，使用抗E2_IgY抗体作为一抗，检测抗体 特异性。结果表明，提取的抗E2-IgY抗体可较好地结合E2蛋白（43ku)，而与降解片段无交 叉反应。
[0185] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，本发明的保护范围不限于此，任何熟 悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简 单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白特异性IgY的制备方法，其特征在于：包括以下步 骤： (1) 牛病毒性腹泻病毒E2基因的克隆与序列分析：根据BVDV-E2基因序列，利用软件 设计一对引物，PCR扩增BVDV-E2基因，连接至pMD18T载体，转化DH5a感受态细胞，经蓝 白斑筛选后，提取质粒，酶切分析，阳性质粒测序，对测序结果进行比较分析； (2) E2蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化：pMD18T和pET-32a载体使用BamH I和Xho I 双酶切，目的片段连接，构建pET-32a-E2表达载体，转化Bal21 (DE3) pLysS感受态细菌，酶 切和PCR鉴定后，优化IPTG诱导浓度和时间，进行大量诱导表达，使用Ni+亲和层析柱对重 组蛋白进行纯化； (3) 抗E2-IgY抗体的制备：纯化的E2蛋白免疫白色来杭产蛋鸡，使用PEG6000提取特 异性IgY抗体，并进行SDS-PAGE分析。
2. 根据权利要求1所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法，其 特征在于：步骤（1)中根据GenBank报道的有关BVDV-E2基因序列，利用primer prime 5. 0 软件，设计一对引物，PCR扩增BVDV-E2基因，为1040 bp，连接至pMD18T载体，转化DH5a 感受态细胞，经蓝白斑筛选后，提取质粒，酶切分析，阳性质粒测序。
3. 根据权利要求1所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法，其 特征在于：步骤（2)中表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析后使用Ni+亲和层析柱 对重组蛋白进行纯化。
4. 根据权利要求1所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白特异性IgY的制备方法，其 特征在于：步骤（3)中，对提取特异性IgY抗体进行SDS-PAGE分析，间接ELISA测定免疫后 抗E2-IgY抗体效价，Western blotting鉴定所获抗E2-IgY的特异性。
5. 根据权利要求1所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法， 其特征在于：所述制备免疫蛋方法如下：向20周龄禽类进行初次免疫注射，免疫剂量为 200?800 y g/只，初次免疫21天之后，进行4次加强免疫，间隔时间为21天，免疫剂量为 200 ?800 y g/ 只。
6. 根据权利要求5所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白特异性IgY的制备方法，其 特征在于：所述禽类为鸡。
7. 根据权利要求1所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白特异性IgY的制备方法，其 特征在于：所述步骤（3)中提取IgY的方法如下； (1) 将所述收集的蛋进行卵黄与卵清分离，收集卵黄，将卵黄使用PBS按照体积比 1 : 1. 5?2. 5进行稀释； (2) 向稀释液加入质量体积比为2. 5?5 %的PEG-6000,充分搅拌，摇床上室温作用 20?30分钟； (3) 将混合液离心，收集上清，过滤，滤液加入质量体积比为6?9%的PEG-6000,充分 搅拌，摇床上室温作用20?30分钟； (4) 将经过搅拌后的混合液离心，弃去上清液，沉淀使用10毫升的PBS悬浮，加入质量 体积比为10?13%的PEG-6000,充分搅拌，摇床上室温作用20?30分钟，再进行离心，获 得沉淀物； (5) 将所述沉淀物使用1. 2?1. 5毫升PBS溶解后，使用透析带进行透析，使用PBS透
【专利摘要】本发明公开了一种牛病毒性腹泻病毒E2蛋白特异性IgY的制备方法，包括以下步骤：(1)根据BVDV-E2基因序列，设计一对引物，PCR扩增BVDV-E2基因，连接至pMD18T，转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，提取质粒，酶切分析，阳性质粒测序，对测序结果分析；(2)E2蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化；(3)抗E2-IgY抗体的制备：纯化的E2蛋白免疫产蛋鸡，使用PEG6000沉淀法提取特异性IgY抗体，并进行SDS-PAGE分析，ELISA效价监测，Western blotting特异性分析。本发明提取的抗E2-IgY抗体可较好地结合E2蛋白，而与降解片段无交叉反应。
【IPC分类】C07K16-02, C07K16-10
【公开号】CN104530229
【申请号】CN201410706964
【发明人】张小莺, 王媛, 任昊, 江雪梅
【申请人】西北农林科技大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月1日