一种生产高纯度γ-氨基丁酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种符合新资源食品公告工艺规定的生产高纯度γ-氨基丁酸方法。
【背景技术】
[0002]y-氨基丁酸(Gamma aminobutyric acid，简称 GABA)于 1883 年作为一种化学物质被合成，1950年弗洛瑞和罗伯特在哺乳类动物脑萃取液中首次发现GABA，在人体内，脑组织中的GABA含量最高，大约为0.1-0.6mg/克组织。1979年发现人体消化道内也可作为神经传导物质，在人体组织内的存在也被证实。GABA是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经传达物质。具有许多重要的生理功能，如抗焦虑、抗抑郁、改善睡眠、降血压、营养脑神经细胞、健肝利肾等。但是年龄增长和精神压力加大使GABA的积累困难。目前，我国的食品法规中，GABA有2处与食品相关，一是用作新资源食品，一是作为食品添加剂中用作合成各类香精的香料原料。γ-氨基丁酸的生产有四种方法:化学合成法、大肠杆菌发酵法、植物富集法和乳酸菌发酵法(包括希氏乳杆菌、短乳杆菌、植物乳杆菌等多种乳酸菌发酵法)。
[0003]化学合成法是目前最主要的生产方法，产量最大。其工艺是以化工产品吡咯烷酮(剧毒物质)为原料，在碱性条件下，保持一定温度和压力，吡咯烷酮开环加水合成GABA，成本极低，得率很高，纯度也很高。达到99.5%以上，目前市场价格仅为60-100元/kg。由于化学合成GABA的原料为剧毒物质吡咯烷酮，当反应结束，产品GABA与未完全反应的残留原料吡咯烷酮混合在一个体系中，尽管进行了多个单元操作的GABA的分离提取、以及结晶纯化，产品GABA中残留的吡咯烷酮是必然的，不可用于食品中。
[0004]大肠杆菌发酵法，是以谷氨酸钠为原料经大肠杆菌发酵生产获得GABA。此方法属于生物合成方法，但是，此方法生产的GABA也不能作为食品食用，不符合食品法规。此法生产的氨基丁酸也不被人们接受，因为大肠杆菌属于人畜肠道菌，在于人畜排泄物中。如果产品中带有的大肠杆菌含量超标，人体食用后会引起肠胃腹泻，发烧，长期食用会引起更为严重的疾病。此方法不是主要的GABA生成方法。全国范围内生产厂家未曾报道。
[0005]植物富集法，可来源于一些特定植物食物，例如茶叶和糙米。对茶叶进行一些物理方法的处理，或将糙米进行发芽处理，植物本身所含的GABA大量增加。绿茶起始GABA1.74-17.4mg/100g，制备过程中如果经过二氧化碳等嫌气处理，GABA可达200mg/100g左右。该方法原料安全可靠，没有毒副作用。然而该方法生产GABA产量和产品纯度很低，以mg级为计量单位，无法获得高纯度的氨基丁酸产品，不能满足人体对GABA的量的需求。
[0006]乳酸菌发酵法。乳酸菌是一类细菌的统称，包括多个种类。目前，科技期刊文献和专利中报道了多种乳酸菌发酵生产GABA，例如希氏乳杆菌、短乳杆菌、植物乳杆菌等。从国家食品法规严格意义上讲，根据中华人民共和国卫生部新资源食品公告规定，只有以希氏乳杆菌发酵L-谷氨酸钠生产的GABA才可作为新资源食品。尽管有些乳酸菌来源于食品泡菜等，例如短乳杆菌，也能催化L-谷氨酸钠生成GABA。
[0007]2001年，日本最早批准GABA作为食品使用，在台湾于2005年被批准作为食品使用。在我国，中华人民共和国卫生部于2009年09月27日公告中(2009年第12号)批准为新资源食品，并规定的使用范围为:饮料、可可制品、巧克力和巧克力制品、糖果、焙烤食品、膨化食品，但不包括婴幼儿食品。从此可用于一般营养食品和功能食品的开发。但是新资源食品GABA，必须是按公告中规定的工艺生产，即以L-谷氨酸钠为原料经希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)发酵、加热杀菌、冷却、活性炭处理、过滤、加入调配辅料(淀粉)、喷雾干燥等步骤生产而成。产品GABA含量多20%。这意味着使用化学合成的GABA作为食品或食品原料，则不符合食品法规，属于非食用物质的食品添加。
[0008]专利“一种高效生产γ -氨基丁酸的发酵方法”(申请号201010045843.5)，该发明公开了一种高效生产γ-氨基丁酸的发酵方法，其特征是方法步骤为:将短乳杆菌活化后，以10%的接种量接种于发酵培养基，32°C培养36-84h ;并于12h和24h分别补入1.5mol和0.7mol的L-谷氨酸钠；整个发酵过程用1N的硫酸控制pH5.0即可。
[0009]专利“γ-氨基丁酸的高效制备工艺”(申请号201110092472.0)，该发明公开了一种γ -氨基丁酸的高效制备工艺。利用希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)经过改良优化的MRS培养基分级扩大培养后，离心浓缩菌液，再与谷氨酸钠的悬浊液混合，采用细胞转化法，获得γ-氨基丁酸。用电渗析脱盐法进行纯化，离心分离菌体，即可获得γ-氨基丁酸溶液，含量达到10-25%，再纯化即得γ-氨基丁酸产品，白色粉末状，纯度98%以上，利用糊精制备20 %含量的成品。本专利符合食品法规，但是扩大培养菌体后离心收集菌体，工艺繁琐，规模化生产实现比较困难。另外电渗析脱盐法进行纯化，成本较高。
[0010]专利“一种利用食果糖乳杆菌生产γ-氨基丁酸的方法”(申请号201110202922.7)，该发明公开了一种利用食果糖乳杆菌生产γ-氨基丁酸的方法，包括(I)活化:将食果糖乳杆菌菌块溶解后接种于MRS液体培养基上培养活化；(2)发酵:活化后的食果糖乳杆菌接种于含I %谷氨酸钠的MRS培养基中，在30?35°C、pH3.0?4.0条件下发酵培养2?10天，所得培养液中即含有γ -氨基丁酸。
[0011]专利“谷氨酸钠生物固相酶催化合成γ -氨基丁酸的方法”(申请号201210171992.5)，该发明公开了本发明提供了一种谷氨酸钠生物固相酶催化合成γ-氨基丁酸的方法。主要工艺包括:(I)将底物谷氨酸钠溶液与固相酶催化合成生成γ-氨基丁酸，再通过离心分离生物固相酶与反应液；(2)反应液经过阳离子交换树脂，除去反应液中的氯化钠，生成纯化γ-氨基丁酸；(3) Y-氨基丁酸水溶液活性炭脱色后，真空薄膜浓缩得γ-氨基丁酸浓溶液；(4) γ-氨基丁酸浓溶液加入95%酒精，析出γ-氨基丁酸白色沉淀结晶，离心分离，真空干燥得白色γ -氨基丁酸粉末。
[0012]专利“利用重组钝齿棒杆菌以葡萄糖为底物一步法合成γ-氨基丁酸的方法”(申请号201310043508.5)，该发明公布了利用重组钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatumSYP，保藏编号CCTCC NO:M208133)以葡萄糖为底物一步法合成γ-氨基丁酸的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明应用基因工程方法，将钝齿棒杆菌SYPA5-5基因argB敲除，获得能够积累谷氨酸的安全菌株钝齿棒杆菌EOl ;从上.Plantarum GB01-21克隆谷氨酸脱羧酶基因于钝齿棒杆菌EOl中表达，获得以葡萄萄糖为底物直接合成γ-氨基丁酸的重组钝齿棒杆菌C.crenatum EOl/pGAD。重组菌发酵液γ _氨基丁酸积累量达13.98g/L。
[0013]专利“一株产谷氨酸脱羧酶的菌株及用其生产γ-氨基丁酸的方法”(申请号201310276458.5)，该发明公布了一株产谷氨酸脱羧酶的菌株及用其生产γ_氨基丁酸的方法，属于食品生物技术领域。本发明提供了一株从泡菜中筛选而来的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) SK30.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013250，并提供了一种利用该菌株发酵生产γ -氨基丁酸的方法，该方法包括:(a)在发酵培养基中对该菌株进行培养，以得到该植物乳杆菌菌体；(b)用植物乳杆菌菌体转化谷氨酸钠生成γ -氨基丁酸；(C) γ -氨基丁酸的分离纯化。
[0014]专利“一种发酵生产γ -氨基丁酸的方法”(申请号201410291576.8)，该发明公布了一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，属于微生物发酵工程领域。本发明采用一株产γ-氨基丁酸的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis SYFS1.009)为菌种，在加有15g/L谷氨酸钠的MRS培养基中与酿酒酵母W303-1A(Saccharomyces cerevisiae W303-1A)混菌培养，同时接种，36h发酵液中γ -氨基丁酸含量是乳酸菌单菌培养条件下的4.7倍。
[0015]专利“一种利用乳酸菌静息细胞发酵生产γ-氨基丁酸工艺”(申请号201410295837.3)，该发明公布了本