制备花生四烯酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及花生四烯酸，尤其是涉及制备花生四烯酸的方法。
【背景技术】
[0002] 花生四稀酸（ArachidonicAcid，简称ARA，即5,8,11，14-二十碳四稀酸）属于 ?-6系列长链多不饱和脂肪酸，由于人体内不具备相应的酶系统来合成特定的不饱和双 键，因此被认为是人体必需脂肪酸，是许多二十碳衍生物如前列腺素E2(PGE2)、前列环素 (PGI2)、血栓烷A2(TXA2)、白三烯LeukotireneB4(LTB4)*C4(LTC4)的直接前体。ARA还具 有调节体内多种离子通道作用，控制细胞膜的通透性，维持机体保水性等许多重要的生理 功能。同时研宄表明，花生四烯酸对婴儿的大脑发育和视觉功能的完善有着极为重要的意 义，花生四烯酸对高血压、高血脂、糖尿病、病毒感染等疾病的预防与治疗也有显著的效果 (Rogeretal.BiotechnologyBioengineering，2010, 9 (20): 245-257)。因此，花生四稀酸 既是一种营养强化剂，又是人类重要的保健品。ARA作为人体必需脂肪酸发挥着无可替代的 作用，应用前景广阔。
[0003] ARA主要来源有植物、动物组织、鱼油以及微生物和微藻类等，但ARA在动物组织 中含量低，来源也有限，而微生物发酵法则为生产ARA开辟了新途径，它具有不受原材料及 气候限制、生长周期短、培养工艺简单、ARA含量高等特点，近年来已成为国内外研宄的热 点。国际上开展产多不饱和脂肪酸（PFUAs)的微生物研宄主要集中在以下几个方面：（1)产 PFUAs菌种的分离与选育；（2)培养条件及发酵工艺的优化；（3)培养方式的研宄（包括批 式、补料、连续培养工艺等）；(4)PFUAs的分离纯化及结构鉴定。目前，人们仅发现接合菌纲 是比较具有研宄价值的的一个纲，而且普遍看好被孢霉，认为它是生产ARA、EPA、DHA最有 潜力的菌种。目前，日本、美国等国家已经先后问世了ARA的发酵产品，国内在这一领域的 研宄起步晚，虽对微生物发酵生产ARA方面作了一些研宄，但还存在着生物量偏低，油脂含 量较低等问题，离大规模的工业化生产仍有一定的距离。
[0004] 中国专利CN101613724公开一种利用高山被孢霉菌丝体制备花生四烯酸的方法， 包括有下述步骤：首先在恒温摇床中将高山被孢霉接种量的深层培养；再转接于装有发酵 培养基的器皿中，培养后获得发酵醪液，其中生长培养基或/和发酵培养基的氮源以高山 被孢霉菌柏代替部分常用氮源，高山被孢霉菌柏中的氮源替代比以质量百分比计为10%? 90% ;发酵醪液经过滤，收集的霉菌生物体，经洗涤、干燥、粉碎，采用非极性溶剂进行浸提 或压榨，收获油脂，收获的油脂经进一步处理获得目标产品，霉菌生物体经非极性溶剂浸提 后剩余固体物质，即为可循环使用的高山被孢霉菌柏，该发明利用高山被孢霉发酵生产花 生四烯酸过程中产生的废弃物得到循环利用，避免了环境污染物的排放。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供制备花生四烯酸的方法。
[0006] 本发明包括以下步骤：
[0007] 1)通过摇瓶实验对高山被孢霉产ARA的培养条件进行优化，所述优化的方法为取 4mL种子液接入装有50mL基础培养基（葡萄糖40g/L;酵母粉5g/L;MgS04-7H20 0.lg/L; KH2P040. 5g/L;CaC030. 05g/L;ZnS04-7H20 0?lg/L;pH6. 0)的 250mL三角瓶，28 °C、150rpm 培养5?6d，得到优化培养基：葡萄糖60g/L;酵母粉或玉米浆lOg/L;谷氨酸1.Og/L; MgS04-7H200.lg/L;KH2P042.Og/L;CaC030 . 05g/L;ZnS04-7H20 0?lg/L;混合微量元素lmL/L; 混合维生素lmL/L;pH调至6. 0 ;
[0008] 2)对高山被孢霉在优化培养基中以玉米浆和酵母粉为混合氮源进行培养，将步骤 1)中的优化培养基中的氮源替换为玉米浆和酵母粉，得混合氮源优化培养基；
[0009] 3)对高山被孢霉在混合氮源优化培养基中进行2L分批发酵，在2L发酵罐中装入 混合氮源优化培养基，培养168h后收获干菌体、油脂和ARA。
[0010] 在步骤1)中，所述混合微量元素可包括FeCl3 ? 6H20,、H3B03、MnCl2 ? 4H20、 CoC12 ? 6H20、CuS04 ? 5H20、NiS04 ? 6H20等；所述混合维生素可包括维生素B12、生物素、维生 素&、泛酸钙等。
[0011] 在步骤2)中，所述培养的方法可与步骤1)中的培养方法相同；所述玉米浆和酵母 粉的质量比可为3 : 8。
[0012] 在步骤3)中，所述混合氮源优化培养基的加入量可为1. 5L;所述混合氮源优化培 养基中葡萄糖的初始浓度为60g/L，接种量10%，初始pH用25%氨水控制在6. 0?6. 5,温 度28°C、转速250rpm;所述干菌体可得36g/L，油脂可得16g/L，ARA可得6. 5g/L。
[0013] 所述高山被孢霉可以接种适量的被孢霉至载有培养基的摇瓶中，置于摇床上培 养，转速为100?300rpm，较好的为150?200rpm。
[0014] 本发明涉及的培养基的组成成分，例如碳源、氮源可以有所不同。碳源可以使用 蔗糖、麦芽糖、糊精、淀粉等，葡萄糖是较适宜的碳源，来源简单，价格低廉，使用量为30? 80g/L。对于摇瓶种子培养，一般将使用量降低至10?30g/L，可根据培养的时间及所要求 的生物量密度来选择用量。具体合适的用量选择，本领域的技术人员可以通过相关操作确 定碳源的种类及合适用量。同时，可视微生物的生长情况，选择一次性加入全部碳源或者分 批补入。氮源可以选择酵母粉、玉米浆、蛋白胨、大豆粉等中的至少一种，酵母粉或者玉米浆 被认为是比较好的氮源，添加浓度在5?15g/L，本领域的技术人员可以通过相关实验操作 确定氮源的种类及用量。
[0015] 可选择使用单一氮源或混合氮源，更好的结果是使用混合氮源（玉米浆、酵母粉） 为发酵罐培养的适宜氮源，且二者的质量比例对于油脂的积累影响较大，可利用响应面分 析等统计方法进一步优化碳氮源的组合，较好的两种氮源比例为3:8 (w/w)。
[0016] 温度低于20°C高山被孢霉将会开始大量产生EPA，而培养要求得到较高含量的 ARA，同时尽量减低或避免产生EPA，培养温度通常保持在25?30°C。微生物发酵生产 PUFAs，其最高产量一般是在对数期后期或稳定期前期，因此要在最短的时间内获得最大可 能的生物量及总脂肪酸的含量，一般来说，最适收获ARA的时间是在第5?6天。
[0017] 真菌生长的pH范围较广，更偏好于在偏酸环境中生长，pH在4. 0至8. 0之间均可 以正常生长，本发明的实施过程中发现，初始pH6. 0?6. 5,培养过程中pH在7?8之间有 利于ARA的积累；pH4?5之间有利于生物量的积累，在培养过程中可分阶段的调节pH水 平以适应所要求的生长环境。
[0018] 接种量可以在2%至14% (V/V)，接种量低，生物量达不到所要求的水平，接种量 高，在生物量积累到一定程度将会抑制菌体的继续生长，在摇瓶培养中，接种控制在3%? 5% (V/V)，而在发酵罐培养中，接种量控制在8%?10% (V/V)能得到较好的结果。
[0019] 培养基中碳氮比影响真菌油脂的积累，碳氮比在10 : 1至