备
[0039] 将培养好的二级种子液（1. 5m3)，转接到装有15m3高密度培养培养基的20m3培 养罐中，调整罐压0. 〇6MPa，通风比0. 15,通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解 氧20 %，35 °C培养8小时，取培养液稀释10倍，在640nm测0D值为0. 468,菌体计数为 2. 68X108Cfu/mL，测定培养液的天冬氨酸酶活达到8084U/mL。将该培养液用于富马酸/天 冬氨酸转化生产。
[0040] 实施例2
[0041] -种大肠埃希氏菌株HY-05C的高密度培养方法，包括以下步骤：
[0042] 1、菌种活化
[0043] 将冷冻保存的大肠埃希氏菌株HY-05C接种到装有活化培养基斜面中，37°C培养 36小时，挑取培养好的斜面菌苔接入另一个活化斜面中，重复上面操作，连续转接三次，即 得活化斜面菌种。
[0044] 2、高密度培养培养基配制
[0045] 培养基按以下配方配制：富马酸8g/L;玉米干粉7g/L;酵母粉3g/L;蛋白胨6g/L; 氯化钠5g/L;磷酸二氢钾lg/L;硫酸镁0. 2g/L，将上述原料加适量水溶解，然后用氨水调节 pH至 6. 5。
[0046] 3、一级种子液的制备
[0047] 取2支新鲜活化斜面（180mmX18mm)分别接入5L的摇瓶中，培养基装液量800mL， 200rpm，37°C，摇床培养8小时，培养液稀释10倍，在640nm测OD值为0. 517,得到一级种子 液。
[0048] 4、二级种子液的制备
[0049] 将经上述培养获得的一级种子液（2X800mL)转接到装有1. 5m3高密度培养培养 基的2m3培养罐中，调整罐压0. 07MPa，通风比0. 25vvm，通过调节搅拌转速维持培养过程中 相对溶解氧40%，37°C培养9小时，取培养液稀释10倍，在640nm测OD值为0. 531，得到二 级种子液。
[0050] 5、转化用培养液的制备：
[0051] 将培养好的二级种子液（1.5m3)，转接到装有15m3高密度培养培养基的20m3 培养罐中，调整罐压〇. 〇7MPa，通风比0. 2,通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解 氧40 %，37 °C培养10小时，取培养液稀释10倍，在640nm测OD值为0. 512,菌体计数为 2. 85X108Cfu/mL，测定培养液的天冬氨酸酶活达到8513U/mL。将该培养液用于富马酸/天 冬氨酸转化生产。
[0052] 实施例3
[0053] 一种大肠埃希氏菌株HY-05C的高密度培养方法，包括以下步骤：
[0054]1、菌种活化
[0055] 将冷冻保存的大肠埃希氏菌株HY-05C接种到活化斜面上，37°C培养32小时，连续 转接三次，即得活化斜面菌种。
[0056] 2、高密度培养培养基配制
[0057] 培养基按以下配方配制：富马酸9g/L;玉米干粉8g/L;酵母粉2. 5g/L;蛋白胨8g/ L;氯化钠5g/L;磷酸二氢钾lg/L;硫酸镁0. 2g/L，将上述原料加适量水溶解，然后用氨水 调节pH至7. 0。
[0058] 3、一级种子液的制备
[0059]取2支新鲜活化斜面分别接入5L的摇瓶中，培养基装液量1000mL，200rpm，37°C， 摇床培养6小时，培养液稀释10倍，在640nm测0D值为0. 465,得到一级种子液。
[0060] 4、二级种子液的制备
[0061]将经上述培养获得的一级种子液（2XlOOOmL)转接到装有1. 5m3高密度培养培养 基的2m3培养罐中，调整罐压0. 08MPa，通风比0. 3vvm，通过调节搅拌转速维持培养过程中 相对溶解氧30%，37°C培养9小时，取培养液稀释10倍，在640nm测OD值为0. 513,得到二 级种子液。
[0062] 5、转化用培养液的制备：
[0063] 将培养好的二级种子液（1. 5m3)，转接到装有15m3高密度培养培养基的20m3培 养罐中，调整罐压0. 〇8MPa，通风比0. 25,通过调节搅拌转速维持培养过程中相对溶解 氧30 %，37 °C培养10小时，取培养液稀释10倍，在640nm测OD值为0. 506,菌体计数为 2. 73X108Cfu/mL，测定培养液的天冬氨酸酶活达到8352U/mL。将该培养液用于富马酸/天 冬氨酸转化生产。
[0064] 实施例4大肠埃希氏菌株HY-05C高密度培养基和培养条件优化
[0065] 1、L-天冬氨酸酶的酶活测定方法
[0066] 酶活定义：在45°C，pH值7. 5条件下，每小时转化1微摩尔富马酸底物的酶量定义 为一个酶活力单位U。
[0067] 底物溶液配制：称取富马酸80g，硫酸镁0.lg，加入300mL蒸馏水搅拌均匀，缓慢加 入浓氨水，搅拌，使溶液最终pH为7. 0,全部转移至500ml容量瓶中，再用蒸馏水定容至刻 度，既得16%的富马酸溶液。
[0068] 酶活测定：取16 %的富马酸溶液250mL于洁净的三角瓶中，三角瓶放入45°C水浴 锅中预热lOmin，加入菌体培养液20mL，摇勾，再放入45°C水浴锅中，立即计时，取0时和1 小时时转化液样品，按下面的方法分别测定反应液中富马酸含量。
[0069] 取1:10硫酸溶液35mL于250mL三角瓶中，加入0. 2mL转化液样品，加热至75? 80°C，用0. 02M高锰酸钾溶液滴定至微红，半分钟内不褪色，即为终点。读取消耗的高锰酸 钾体积数，0时样品消耗体积记为，反应1小时消耗体积记为V#，按以下公式计算生物转 化酶活力：
[0070]
【主权项】
1. 一种大肠埃希氏菌株HY-05C的高密度培养方法，其特征在于，将大肠埃希氏菌株 HY-05C进行液体培养，包括如下步骤： 1) 菌株HY-05C斜面菌种活化：将冷冻保存的大肠埃希氏菌株HY-05C接种到装有活化 培养基试管斜面中，35-37°C培养24-36小时，挑取培养好的斜面菌苔接入另一支活化用试 管斜面中，35-37°C培养24-36小时，再转接另一活化斜面，35-37°C培养24-36小时即得活 化斜面菌种； 2) 制备菌株HY-05C-级种子液：取步骤1)得到的大肠埃希氏菌株HY-05C活化斜面菌 种，接种到装有高密度培养培养基的三角瓶中进行培养，200rpm、35?37°C、摇床培养6-8 小时，得到一级种子液； 3) 制备菌株HY-05C二级种子液：取步骤2)得到的一级种子液以体积比1-2%。接种量 转接到装有高密度培养培养基发酵罐中进行扩大培养，控制通风比〇. 3-0. 6vvm，相对溶解 氧浓度20-40%，搅拌，罐压0. 05-0. 07MPa，35?37°C培养7-9小时，得到大肠埃希氏菌株 HY-05C二级种子液； 4) 制备菌株HY-05C转化用培养液：将步骤3)培养好的大肠埃希氏菌株HY-05C二 级种子液以体积比5-10 %接种量转接到高密度培养培养基中进行扩大培养，控制通风比 0. 15-0. 25vvm，相对溶解氧浓度20-40%，搅拌，罐压0. 05-0. 08MPa，35?37°C培养8-10小 时，制得大肠埃希氏菌株HY-05C转化用培养液。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述活化斜面培养基所必需的营 养物质包括：富马酸铵10 ;牛肉膏10 ;蛋白胨7 ;氯化钠5 ;磷酸二氢钾1 ;硫酸镁0. 2,琼脂 15 ?20, pH7. 0 ?7. 2,单位为 g/L。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的高密度培养培养基所必需 的营养物质包括：富马酸铵7?12 ;玉米干粉6?8 ;酵母粉1?4 ;蛋白胨6?8 ;氯化钠 5 ;磷酸二氢钾1 ;硫酸镁0. 2,单位为g/L。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的高密度培养培养基的优 选方案为：富马酸铵10 ;玉米干粉8 ;酵母粉2 ;蛋白胨7 ;氯化钠5 ;磷酸二氢钾1 ;硫酸镁 0? 2, pH 6. 5,单位为 g/L。
【专利摘要】本发明提供了一种大肠埃希氏菌株HY-05C高密度培养方法，通过对菌种培养培养基和培养工艺的优化，使单位体积培养液中菌体细胞浓度提高40-50％，天冬氨酸酶酶活提高70-80％，从而提高单位体积细胞培养液转化富马酸生产天冬氨酸转化效率。与原工艺相比，本发明大肠埃希氏菌株HY-05C高密度培养工艺，采用三级培养，二级种子液采用5-10％的大接种量接入最终转化用培养液，使获得的转化用培养液菌体更加整齐，酶活持续时间延长，有利于提高后续转化效率。
【IPC分类】C12R1-19, C12N1-20
【公开号】CN104593306
【申请号】CN201510057925
【发明人】姜国政, 田延军, 马秀亮, 赵祥颖, 乔君, 杨丽萍, 韩延雷, 刘建军
【申请人】烟台恒源生物股份有限公司, 山东省食品发酵工业研究设计院
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年2月4日