将培养好的斜面菌种转接斜面培养基，30°C ± 1培养8d，备用。
[0049] 1. 2. 2孢子悬液的制备
[0050] 将培养好的斜面菌种用无菌水洗下孢子，转入带有玻璃珠和无菌水的无菌三角瓶 中，充分振荡，制成终浓度为3 X 106cfu的均一孢子悬液。
[0051] 1.2.3种子液的制备
[0052] 将孢子悬液按10 % (v/v)接种于装有200ml种子培养基的500ml摇瓶中， 30°C ± 1，180r/min振荡培养80h，制备得到发酵种子液。
[0053] 1. 2. 4发酵培养
[0054] 将发酵种子液按8 % (v/v)接种于装有150ml发酵培养基的1000ml摇瓶中， 30°C ±l°C，180rpm振荡培养4d;然后27°C ±1°C静止培养6d发酵终止。
[0055] 将发酵产物从摇瓶中取出，30°C烘干，磨粉至80目，得到发酵样品。
[0056] 实施例2
[0057] 1. 1培养基的制备
[0058] (1)、斜面培养基：麦芽糖5g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂20g，葡萄糖20g，水 1000ml，pH自然。121°C灭菌20min，冷却待用。
[0059] (2)、种子培养基：麦芽糖5g，蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，加水定容至 1000ml，pH自然。121°C灭菌20min，冷却待用。
[0060] (3)、发酵培养基
[0061] 添加有金钗石斛的培养基：35g米粉，金钗石斛汁（称取60g新鲜的金钗石斛，加 400ml水，打浆机打成混合浆液），蛋白胨10g，加水定容至1000ml，121 °C灭菌20min，冷却待 用。
[0062] 不添加金钗石斛的发酵培养基：35g米粉，蛋白胨10g，加水定容至1000ml，121°C 灭菌20min，冷却待用。
[0063] 1. 2发酵培养工艺
[0064] 1. 2. 1菌种活化
[0065] 本发明所用红曲霉为红曲霉（Monascus anka)菌株3. 4577,购自中国普通微生 物菌种保藏中心；红曲霉也可购买自其它厂家。将保存的红曲霉菌种转接斜面培养基， 30°C ± 1培养5d取出；再将培养好的斜面菌种转接斜面培养基，30°C ± 1培养8d，备用。
[0066] 1. 2. 2孢子悬液的制备
[0067] 将培养好的斜面菌种用无菌水洗下孢子，转入带有玻璃珠和无菌水的无菌三角瓶 中，充分振荡，制成终浓度为5 X 106cfu的均一孢子悬液。
[0068] 1. 2. 3种子液的制备
[0069] 将孢子悬液按8% (v/v)接种于装有200ml种子培养基的500ml摇瓶中，30°C ±1， 200r/min振荡培养75h，制备得到发酵种子液。
[0070] 1. 2. 4发酵培养
[0071] 将发酵种子液按10% (v/v)接种于装有180ml发酵培养基的1000ml摇瓶中， 30°C ±l°C，200rpm振荡培养4d;然后27°C ±1°C静止培养5d发酵终止。
[0072] 将发酵产物从摇瓶中取出，40°C烘干，磨粉至150目，得到发酵样品。
[0073] 实施例3
[0074] 1. 1培养基的制备
[0075] (1)、斜面培养基：麦芽糖6g，蛋白胨llg，酵母膏6g，琼脂19g，葡萄糖19g，水 1000ml，pH自然。121°C灭菌20min，冷却待用。
[0076] (2)、种子培养基：麦芽糖6g，蛋白胨llg，酵母膏6g，葡萄糖19g，加水定容至 1000ml，pH自然。121°C灭菌20min，冷却待用。
[0077] (3)、发酵培养基
[0078] 添加有金钗石斛的培养基：20g米粉，金钗石斛汁（称取4_5g干的金钗石斛，加 250ml水，打浆机打成混合浆液），蛋白胨1 lg，加水定容至1000ml，121 °C灭菌20min，冷却待 用。
[0079] 不添加金钗石斛的发酵培养基：20g米粉，蛋白胨llg，加水定容至1000ml，12rC 灭菌20min，冷却待用。
[0080] 1. 2发酵培养工艺
[0081] 1. 2. 1菌种活化
[0082] 本发明所用红曲霉为红曲霉（Monascus anka)菌株3. 4577,购自中国普通微生 物菌种保藏中心；红曲霉也可购买自其它厂家。将保存的红曲霉菌种转接斜面培养基， 30°C ± 1培养6d取出；再将培养好的斜面菌种转接斜面培养基，30°C ± 1培养7d，备用。
[0083] 1. 2. 2孢子悬液的制备
[0084] 将培养好的斜面菌种用无菌水洗下孢子，转入带有玻璃珠和无菌水的无菌三角瓶 中，充分振荡，制成终浓度为7 X 106cfu的均一孢子悬液。
[0085] 1. 2. 3种子液的制备
[0086] 将孢子悬液按6% (v/v)接种于装有200ml种子培养基的500ml摇瓶中，30°C ±1， 250r/min振荡培养72h，制备得到发酵种子液。
[0087] 1. 2. 4发酵培养
[0088] 将发酵种子液按11 % (v/v)接种于装有200ml发酵培养基的1000ml摇瓶中， 30°C ±l°C，210rpm振荡培养3d;然后27°C ±1°C静止培养4d发酵终止。
[0089] 将发酵产物从摇瓶中取出，50°C烘干，磨粉至200目，得到发酵样品。
[0090] 实验例1
[0091]多糖的测定
[0092] 分别取定量发酵样品，分别加10倍体积水、10倍体积90%乙醇，60°C浸提12h， 1200〇1'/111；[11，离心15111；[11，取上清液101111于501111离心管中，加入40111195%乙醇，混勾后醇 沉处理12h，经4000r/min离心lOmin后，弃上清液，再加5ml蒸馏水于沉淀中，待沉淀完全 溶解后加0. lg活性炭，去掉色素6h，离心得上清液。吸取上清液0. 1?0. 5ml于比色管中 (使最终稀释液吸光值落在0. 1?0. 9范围内），以蒸馏水补至2ml，加入lml 6%的苯酚溶 液摇匀后沿管壁缓慢注入浓硫酸5ml，立即摇匀，然后置于沸水浴中保温15min，冷却至室 温后于490nm测OD值，然后以标准曲线（y = 4. 9214A2-0. 0022, R2= 0. 993)计算多糖含 量。标准样品中多糖含量的计算公式：y = 4. 9214A2-0. 0022*2*5/V2*200/10 ;
[0093]式中：y_试样中多糖的含量，单位为毫克/每克（mg/g);
[0094] A2-苯酚-硫酸法测样品所得OD值；
[0095] V2-吸取去色素后的上清液的体积，单位为ml。
[0096]同时，测定金钗石斛汁中的多糖含量。结果如表1所示。
[0097] 表1多糖含量
[0098]
【主权项】
1. 一种石斛红曲制备方法，其特征在于，将红曲霉在添加有金钗石斛的培养基培养，得 到的培养产物即为石斛红曲。
2. 根据权利要求1所述的石斛红曲制备方法，其特征在于，所述红曲霉在添加有金钗 石斛的培养基培养前，先将红曲霉培养成发酵种子液，将所述发酵种子液接种于添加有金 釵石斛的培养基培养。
3. 根据权利要求1所述的石斛红曲制备方法，其特征在于，每升所述添加有金钗石斛 的培养基含有以下成分：20-50g米粉，由金钗石斛制成的金钗石斛汁，蛋白胨9-llg，加水 定容。
4. 根据权利要求3所述的石斛红曲制备方法，其特征在于，所述由金钗石斛制成的金 钗石斛汁为：由50-60g新鲜金钗石斛或4-5g干的金钗石斛制成的金钗石斛汁。
5. 根据权利要求3所述的石斛红曲制备方法，其特征在于，所述金钗石斛汁由以下方 法制备：称取50-60g新鲜或4-5g干的金钗石斛，加水250-400ml，打成混合浆液即得。
6. 根据权利要求2所述的石斛红曲制备方法，其特征在于，所述发酵种子液按体积百 分比为8% -11%进行接种于添加有金钗石斛的培养基培养。
7. 根据权利要求2所述的石斛红曲制备方法，其特征在于，所述发酵种子液由以下方 法制备： 将浓度为3\106-7父106(^11的红曲霉孢子悬液按体积百分比为6-10%接种于种子培 养基，30°C ± 1，180-250r/min振荡培养72-80h，制备得到发酵种子液； 每升所述种子培养基包括以下成分：麦芽糖4-6g，蛋白胨9-llg，酵母膏4-6g，葡萄糖 19-21g，加水定容。
8. 根据权利要求7所述的石斛红曲制备方法，其特征在于，所述孢子悬液在制备前先 进行活化； 所述活化优选为：将保存的红曲霉菌种转接斜面培养基，30°C ±1培养4-6d取出； 再将培养好的斜面菌种转接斜面培养基，30°C ± 1培养7-8d，即可。
9. 根据权利要求8所述的石斛红曲制备方法，其特征在于，每升所述斜面培养基包括 以下成分：麦芽糖4-6g，蛋白胨9-llg，酵母膏4-6g，琼脂19-21g，葡萄糖19-21g，加水定 容。
10. 根据权利要求1-9任一项所述的石斛红曲制备方法，其特征在于，所述将红曲霉在 添加有金钗石斛的培养基培养的条件具体为： 30°C ±l°C，180-210rmp振荡培养3-4d;然后27°C ±1°C静止培养4-6d发酵终止。
【专利摘要】本发明涉及发酵领域，特别涉及一种石斛红曲制备方法，是将红曲霉在添加有金钗石斛的培养基培养，得到的培养产物即为石斛红曲。本发明提供的石斛红曲制备方法，结合中草药和微生物源性生成抗氧化活性物质的共同特点，利用抗氧化作用疗效确切的金钗石斛与已有研究报道具有生成抗氧化性物质的红曲霉进行共同发酵培养，在红曲霉代谢转化金钗石斛的同时，金钗石斛也对红曲霉的代谢流产生影响，两者产生互补及增效的作用，得到的石斛红曲达到了非常显著的抗氧化效果，这种效果是单纯利用红曲霉发酵或金钗石斛无法达到的。
【IPC分类】C12R1-645, C12P1-02
【公开号】CN104593425
【申请号】CN201510054904
【发明人】周礼红, 侯素媛
【申请人】周礼红
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年2月3日