一种hPXR介导的双萤光素酶报告基因技术高通量药物筛选模型的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学和药理学领域，具体地说本发明涉及一种筛选人孕烷X受体激动剂和拮抗剂的方法，利用该方法可以筛选能够对PXR的靶基因——细胞色素CYP450基因产生的调控作用的活性药物配体，可应用于新药筛选。
【背景技术】
[0002]PXR属核受体NRlI亚家族，人的PXR基因含10个外显子和9个内含子，全长约35kb。1998年3个研究组分别用同源克隆和数据库技术在人和小鼠中独立地发现孕烷活化受体、类固醇及外源性物质受体PXR，因其能被高浓度的孕激素激活，故获此命名，有时也被称为类固醇与外源活性物受体(steroid xenob1tic receptor, SXR) IXR能调控的功能蛋白涉及到药物分布、代谢及转运等多个环节，包括I相的代谢酶:CYP3A、CYP2B与CYP2C ；II项代谢酶:谷胱甘肽转移酶、UDP-葡萄糖醛酸转移酶、磺基转移酶；药物转运体:多药耐药蛋白-1，多重耐药蛋白-1，有机阴离子转运体多肽_2。其所调控的CYP450酶的亚型主要是CYP3A家族，PXR对CYP3A表达的调控机制为:药物进入细胞浆的药物作为PXR的配体与其结合活化PXR，令PXR活化后，药物-PXR受体复合物再与视黄醛X受体(retinoid Xreceptor, RXR)形成异源二聚体后，作用于CYP3A的基因上游调控序列近端启动子序列和远端增强子序列中的ER-6及DR-3元件，上调CYP3A基因的表达，引发生物学效应。
[0003]近年来，越来越多的PXR天然药物激动剂被陆续发现，天然药物例如圣约翰草，银杏(Ginkgo biloba),穆库尔没药油状树脂(Commiphora mukul),五味子(Schisandrachinensis),甘草(Glycyrrhiza uralensis),丹参(Salvia milt1rrhiza)及天仙(Dutchmanspipe Vine)等具有能激活PXR的能力。因此，阐明草药-药物相互作用的分子机制来阻止不良反应的发生是尤为必要，同时对于利用PXR配体阐明某些天然药物的对疾病的治疗作用也具有极其重要的临床意义。
[0004]然而激动PXR后，由于影响代谢酶和转运体的表达即获刑，往往产生非预期的不利影响。为了改善PXR激动剂产生的不良药物相互作用级抗癌药物由于活化PXR产生的药物耐药性，一些学者发现了可以拮抗PXR激动作用的PXR拮抗剂，例如ET-743、二甲双胍、香豆雌酚及酮康唑等唑类抗真菌药。由于PXR拮抗剂可以通过拮抗配体的活化作用，来抑制配体对药物代谢酶及转运体的诱导作用，从而降低不良DDI的发生，以及逆转抗癌药的耐药性，故寻找新的PXR拮抗剂具有重要的临床意义。
[0005]目前，针对核受体包括hPXR的药物筛选手段包括:基于细胞的转录激活检测法、基于溶液的生物物理化学分析和基于计算机辅助的虚拟筛选等。相对而言，前者因基于生理状态更为有效。高通量筛选技术已成为目前药物筛选领域研究的重要课题，针对靶标的药物研发过程可以分为靶标的确立，先导化合物的发现，新药的研发。其中高通量筛选技术是先导化合物发现的关键，在药物研发过程中起重要作用，由于其具有快速、微量、高效、经济的特点，这一技术必将在未来的药物研究中发挥越来越重要的作用。而基于细胞的转录激活检测的报告基因筛选模型为高通量寻找新药提供了可能，通过将目的基因与双报告基因共转染入细胞中进行表达，配体结合到相应的受体，激活下游信号通路，报告基因响应这种信号的变化，使荧光素酶表达量发生变化。通过检测细胞中双报告基因荧光素酶的表达，来评估配体的功能和进行备选药物的高通量筛选。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是在于提供一种操作简单、特异性好的可用于筛选调控人孕烷X受体(hPXR)活性的药物的高通量筛选方法。
[0007]为实现上述目的，本发明将该方法应用于人胚肾HEK293T细胞，简历一种快速筛选hPXR激动剂和拮抗剂的方法，该方法包括如下步骤:
I)将处于对数生长期的人胚肾HEK293T细胞进行消化，将细胞吹打均匀后按适当密度接种于96孔板中；细胞种板后放入细胞培养箱中，12~16个小时后，至细胞在96孔板中覆盖率达到60~80%即可进行质粒转染。
[0008]2)筛选激动剂模式
转染4-6小时后，对已转染的细胞分别加入适量含药培养基进行孵育，设置阴性对照组、阳性激动对照组和受试药物组，孵育24~48小时后进行双荧光报告基因检测。
[0009]3)筛选拮抗剂模式
转染4-6小时后，对已转染的细胞分别加入适量含药培养基进行孵育，设置阴性对照组、阳性激动对照组、阳性拮抗组和受试药物组，孵育24~48小时后进行双荧光报告基因检测。
[0010]所诉步骤I)中的质粒为hPXR表达质粒、萤火虫萤光素酶报告基因质粒和内参比海肾萤光素酶质粒。
[0011]所诉步骤I)中质粒中的萤火虫萤光素酶报告基因质粒为含有CYP3A4启动子区域的报告基因质粒。
[0012]所诉步骤2)中的阳性激动对照组选用利福平作为阳性激动剂，优选浓度为10~50μ molL 、
[0013]所诉步骤3)中的阳性拮抗对照组选用酮康唑作为阳性拮抗剂，优选浓度为25~100μ molL 、
[0014]所诉步骤2)和步骤3)中的双萤光素酶报告基因检测按照P1mega公司双萤光素酶报告基因检测试剂盒进行操作:
I)去除培养孔中的培养基，用PBS溶液洗涤细胞I次，然后用一次性注射器小心去除PBS溶液，每个培养孔中加入100 UL I XPLB溶液，室温下震荡15 min。
[0015]2)提前将20 UL LARII溶液加入到报告基因检测试管底部中，转移震荡后的裂解产物100 μ L LARII液体内，用枪吹打6-7下后，用化学发光检测萤光素酶活性，再迅速加入100 uL Stop & GloReagent,涡旋3秒后混匀后进行海肾萤光素酶活性检测。
[0016]所诉步骤2)和步骤3)中的报告基因检测结果按照RLU (相对荧光强度)来表示:每孔的萤光素酶活性值用海肾萤光素酶的活性进行校正，故最后每样品孔校正酶活性为:RLU (相对荧光强度)=萤火虫萤光素酶活性值/海肾萤光素酶的活性值。以空白组的RLU作为基础表达(统计时以I表示)，其他待测物的RLU与其相比，以RLU的大小表示PXR活性的闻低。
[0017]采用本发明可以快速、方便地筛选具有调控PXR活性的化学合成物、天然药物或食物成分。
【附图说明】
[0018]图1是不同浓度的阳性激动剂Rif对相对荧光强度的作用图；图2是不同核受体激动剂对相对荧光强度的作用图。
具体实施方案
[0019]下面实施例是对本发明的进一步说明