木聚糖酶肠道定向表达载体及其细胞系的制作方法
【专利说明】木聚糖酶肠道定向表达载体及其细胞系
[0001] 一、技术领域 本发明涉木聚糖酶肠道定向表达载体及其细胞系，属于生物技术领域。
[0002] 二、【背景技术】 环境友好型养殖业是畜牧业可持续健康发展的新方向。改革开放以来，随着我国国民 经济的全面、快速发展，人民生活需求水平的不断提高，我国畜牧产业规模化取得了空前的 发展。然而，随着畜牧场规模化、集约化和机械化程度的提高，畜禽粪便已成为一个不可忽 视的污染源。同时，我国是一个养殖大国，饲料产量居世界第二，由于近年来我国养殖业的 快速发展，加剧了人畜争粮矛盾，而且耕地面积日益减少，使粮食问题更加严峻。因此，增加 饲料的营养价值，提高饲料的利用率和转化率，节约粮食资源就显得尤为重要。木聚糖酶作 为一种环保型饲料酶制剂，应用于饲料中提高了饲料的营养价值，突破了饲料资源开发利 用的局限，增强了动物的生产和抗病能力，减少了动物排泄物造成的污染，在发展环境友好 型养殖业中具有重要的意义和价值。
[0003] 木聚糖是一种多聚五碳糖，是植物半纤维的重要组分，广泛存在于植物细胞壁中， 它占植物碳水化合物总量的1/3,在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的生物质资 源。木聚糖可阻止细胞内养分释放、增加食糜黏度、阻碍饲料营养物质与消化液的接触、 增加肠道不动水层厚度，使消化器官代偿性增加，并破坏肠道正常结构和微生态平衡，影 响营养物质的消化吸收，因此木聚糖是一种典型的抗营养因子，因猪消化道内缺乏相应的 内源性消化酶分解饲料中这类抗营养因子，用作猪饲料的玉米、豆柏中的木聚糖难以被有 效利用，被直接排出体外，导致了饲料资源的浪费和严重的环境污染。内切木聚糖酶 (endo-0-XynB)是水解木聚糖的关键酶，目前，国内外已经获得的木聚糖酶产酶微生物主 要来源于自然界中的杆菌、黑曲霉菌、青霉菌属、木霉属以及放线菌属，大部分真菌源木聚 糖酶具有嗜酸性，但细菌来源的最适pH。#均高于5. 5,本发明选择研究来源于黑曲霉属的 木聚糖酶基因，其酶蛋白？!1_在5. 5左右，酶活性在动物胃的酸性环境中较高。
[0004] 基于以上研究进展，利用木聚糖酶分解植物中木聚糖的生物学特性，综合现在的 分子和细胞生物学手段，采用转基因手段在目的动物体细胞中导入具有特殊生物学功能的 外源木聚糖酶（XynB)基因，可望进一步通过转基因体细胞克隆技术途径，获得肠道中稳定 表达和稳定遗传的转XynB基因的猪新品种(系）。
[0005] 抵抗素样分子0 (resistin-like molecule 0 )又称发现于炎症带2 (Found in inflammatory zone 2, FIZZ2)，目前其相关研究主要集中在人类，生物学功能与肠管上 皮细胞分化、细胞增殖、肠道免疫应答紧密相关，是研究肠道疾患及其靶向生物治疗的新靶 标。研究发现，RELMP基因高度表达于肠道组织。而RELMP基因启动子是其高度表达于 肠道的关键，相关研究表明，RELMP基因启动子区包含多个肠上皮特异性转录调控因子。人 和猪同源性非常高，因此猪RELMP基因的生物学功能和启动子结构具有潜在的相似性。本 发明克隆得到猪RELM 0启动子序列，并筛选得到活性最强启动子片段，将其构建成XynB基 因的肠道定向表达载体，并进一步转染体细胞，构建转XynB基因的猪胎儿成纤维细胞系， 解决了转基因猪体内目的基因在肠道内定向表达及其有效发挥其生物学功能的关键技术 问题。
[0006] 三、
【发明内容】
技术问题本发明的目的是提供木聚糖酶肠道定向表达载体及其细胞系，是专用于生命 科学和畜牧科研与生产的环保型的生物制品，可作为开展环境友好型转基因猪研究提供必 要的生物材料及其相关关键技术方法参考。
[0007] 技术方案木聚糖酶肠道定向表达载体，是通过以下方法构建而成的： ⑴以原核载体pRSETA-XynB为模板，根据XynB基因序列，设计PCR引物P1和P2, P1 引物5'端引入通〇 I酶切位点，在酶切位点与起始位点之间引入Kozak序列GCCACC，P2引 物 5' 端引入 J/7/7 I 酶切位点和 Myc-Tag 序列 CAGATCCTCTTCTGAGATGAGITITTGITC : P1: 5' -CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3'XhoI P2:5 ' -GGGGTACCCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCTGAACAGTGATGGA-3'KpnI PCR 扩增条件为：98°C，5min ;98°C，30s ;55°C，30s ;72°C，30s ;32 个循环；72°C，5min， PCR扩增片段大小为678bp ; 将上述PCR终产物与pMD18T连接，得到克隆载体pMD18T-XynB-Myc ; ⑵将上述克隆载体pMD18T-XynB-Myc用限制性内切酶Xho I和Kpn I双酶切，同时用 相同限制性内切酶双酶切pcDNA3. 1 (-)，将酶切回收的XynB-Myc目的片段和pcDNA3. 1 (-) 载体片段由T4 DNA连接酶4°C连接过夜，得到XynB真核表达载体pcDNA3. 1-XynB-Myc ; ⑶根据XynB基因及GFP基因序列，设计PCR反应引物P3 / P4和P5 / P6,引物P3/ P4扩增XynB-Myc，引物P5/P6扩增GFP，P4有部分序列与GFP基因互补，P5有部分序列 与XynB-Myc基因片段互补，P6引物5'端引入终止密码子TAA ; P3: 5' -CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3'XhoI P4: 5' -CCTTGCTCACCATAGATCCTCTTCT-3' P5: 5, -GAAGAGGATCTGATGGTGAGCAAGGG-3' P6: 5' -GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3'KpnI 以pMD18T-XynB-Myc载体为模板，使用引物P3/P4,扩增XynB-Myc片段，大小为682bp ; 以质粒PEGFP-C3为模板，使用引物P5/P6,扩增GFP片段，大小为768bp ; 以上述扩增产物XynB-Myc片段及GFP片段为模板，用引物P3和P6,采用重叠PCR方法 将两种组件融合，得到XynB-Myc-GFP片段，该融合片段的大小为1398bp，扩增程序为98°C， 5min ;98°C，30s ;52°C，30s ;72°C，90s ;32 个循环；72°C，lOmin ; 将上述PCR终产物XynB-myc-GFP片段与pMD18T在4°C条件下连接，获得重组载体 pMD18T-XynB-myc-GFP ； ⑷将中间载体pMD18T-XynB-myc-GFP用限制性内切酶Xho I和Kpn I双酶切， 同时用同样的限制性内切酶双酶切pcDNA3. 1 (-)，将酶切回收的XynB-myc-GFP目的 片段和pcDNA3. 1(_)载体片段采用T4 DNA连接酶4°C连接过夜，获得真核表达载体 pcDNA3. 1(-)-XynB-myc-GFP ； (5)猪RELM0基因启动子区目前未见报道，猪和人基因同源性极高，根据Genebank中 人RELMP基因5'侧翼区序列AF352731，猪RELMP基因cDNA序列NC_010455,按照5'端 递减原则，设计PCR正向引物P7-P12,引物5'端引入Me I酶切位点，反向引物P13,引物 5'端引入通〇1酶切位点，扩增不同长度猪RELMP启动子片段：
【主权项】
1.木聚糖酶肠道定向表达载体，是通过w下方法构建而成的： (1) W原核载体pRSETA-XynB为模板，根据XynB基因序列，设计PCR引物P1和P2, P1 引物5'端引