n，离也 lOmin ; (5) 吸取上清于新的1. 5血离也管中，加入600 y L的异丙醇，混合均匀，室温静置 15min，4°C，12000r/min，离也 15min,弃上清； (6) 加入1血75%的无水己醇（750 y L无水己醇+250 y L DEPC水）漂洗沉淀，4 °C， 12000;r/min，离也 5min,弃上清； (7) 加入1血无水己醇，漂洗沉淀，4°C，12000r/min，离也5min，弃上清，室温干燥 lOmin ； (8) 加入40 y L的DEPC水溶解RNA，置于-8(TC冰箱保存备用。
[00对 2. 3 RNA质量检测 (1)琼脂糖凝胶电泳；1%琼脂糖凝胶电泳，150V电压15分钟。紫外透射光下观察并拍 照。
[0036] 琼脂糖凝胶电泳结果见图1 : 猫：样本1、样本2提取的RNA电泳分别为11号、12号条带） 结果说明；28S和18S核糖体RNA条带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种 类型)。在加样孔位于图片上方的看图模式下，上面一条带(真核28S，原核23S)的密度大约 是下面一条带(真核18S，原核16S)的2倍。下方还有可能观察到一个更小稍微扩散的带， 它由低分子量的RNA (tRNA和5S核糖体RNA等）组成。在28S和18S核糖体带之间一般 可W看到一片弥散的邸染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。
[0037] (2) NanoDrop 2000 检测 RNA 浓度及 0D 值： 取1 y 1RNA样品置于nano化op微量分析仪基座，定量检测波长在260、280的0D值，验 证RNA纯度。0D (260/280)读数在1. 80-2. 00之间为较纯的样品。对RNA浓度及总量要 求；RNA 浓度> 200 ng/ y 1 ;RNA 需求量> 10 y g。
[0038] 结果如下： 样本 1 ;0D (260/280)读数 1. 95, RNA 浓度 40化g/y 1 ; 样本 2 ;0D (260/280)读数 1. 90, RNA 浓度 38化g/y 1 ; (3) Agilent 2100 芯片检测： 按照RNA 6000 Nano芯片试剂盒操作。分别取样本1、样本2的9 y 1总RNA样本与染 料混合后加入电泳芯片的注胶孔。往Ladder孔中加入lyl Ladder,数字标记的样品孔中 各加入lul样本。样本1、样本2的RNA样品完整性检测结果见图2、图3: 结果说明；图中每个峰的集中度，代表样品中RNA完整度，峰越集中代表样品RNA降解 率越低。rRNA Ratio[28s/18s]的读数，代表28S与18S的浓度比例。RIN值表示RNA样品 的完整度，数值在1-10,数值越高代表RNA完整性越好。一般情况下，RIN值>6. 5为合格， RIN值《6. 5为不合格。物种类型、样品粘稠度及28S与18S、5S的比例关系等都会影响检 测数据结果，甚至会导致仪器报错。
[0039] 2. 4逆转录合成cDNA 用RT-PCR试剂盒，W 20y 1总反应体积进行逆转录。按W下体系加入：
【主权项】
1. 检测血清中GRP78 mRNA转录水平的RT-PCR引物，其特征在于： 引物 F:5' - CCCGTCCAGAAAGTGTTG -3' ； 引物 R :5' - CAGCACCATACGCTACAG -3'。
2. 检测血清中GRP78 mRNA转录水平用于评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的 RT-PCR试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的RT-PCR引物。
3. 根据权利要求2所述的RT-PCR试剂盒，其特征在于还包含内参引物，所述内参引物 如下： 引物 F :5' -CACCCACTCCTCCACCTTTG-3' ； 引物 R :5' -CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'。
4. 根据权利要求2所述的RT-PCR试剂盒，其特征在于还包含RNA提取试剂、逆转录试 剂和PCR反应液； 所述RNA提取试剂的组分及浓度如下：Trizol试剂355~800ml、氯仿200~400 μ L、 异丙醇 600 ~1000 μ L、无水乙醇 L 75 ~5. OOmL、DEPC 水 290 ~1000 μ L ; 所述逆转录试剂组分及浓度如下：150~250U/μ L逆转录酶2 μ L、4~6 X逆转录缓 冲液 4μ L、12 ~50 mmol/L dNTPs 4μ L、0. 1 ~I. 2mol/L DTT 2μ L、35 ~45U/y L RNA 酶 抑制剂0. 5 μ L ; 所述PCR反应液组分及浓度如下：Syber Green I荧光核酸染料25 μ L、DNA聚合酶 100U/ml、dNTPs 0.2 mmol/L、氯化镁6 mmol/L、三轻甲基氨基甲烧盐酸盐16. 5 mmol/L、氯 化钾 89. 3 mmol/L、DEPC 水 50 μ L ~60 μ L。
5. 根据权利要求4所述的RT-PCR试剂盒，其特征在于所述Trizol试剂具体为：重蒸 苯酚200mL、8-羟基喹啉0. 2g、β -巯基乙醇I. 2g /二硫苏糖醇0. 5g、异硫氢酸胍100g 、蒸馏水118mL、0. 75M柠檬酸钠7. 04mL、10%十二烷基肌氨酸钠10. 56mL和2M醋酸钠 20mL。
6. 根据权利要求2所述的RT-PCR试剂盒，其特征在于逆转录反应体系如下： 引物F IuL, 引物R IuL, RNA 模板 2 μ L、 逆转录酶 2yL、 5 X逆转录缓冲液 4yL、 25mM dNTPs 4 μ L、 0.1 M DTT 2μ L、 RNA酶抑制剂 0. 5 μ L DEPC水余量 总体积 20 μ L。
7. 根据权利要求2所述的RT-PCR试剂盒，其特征在于扩增体系如下： 引物F IuL, 引物R IuL, cDNA 模板 2 μ L、 SYBR Green I荧光核酸染料 2 μ L DEPC水 余量 总体积 50 μ L。
8.通过检测血清中GRP78 mRNA转录水平来评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的方 法，包括以下步骤： 血清总RNA的提取 收集评估对象的清晨空腹外周静脉血5ml，置于冷冻离心机中，4°C下调整转速 2500-3000 r/min，离心8-lOmin后用无菌吸管吸取血清2 ml~3ml ; 将上述血清加入含有ImL Trizol试剂的匀浆管中，于匀浆机匀浆20sec，立即放于冰 上； 置于超净台中，温育5min，12000r/min，离心10min ; 吸上清于新的I. 5mL离心管中，加入200 μ L的氯仿，摇匀，室温静置2min，4°C，12000r/ min,离心 IOmin ; 吸取上清于新的I. 5mL离心管中，加入600 μ L的异丙醇，混合均匀，室温静置15min， 4°C，12000r/min，离心 15min，弃上清； 加入lmL75%的无水乙醇漂洗沉淀，4°C，12000r/min，离心5min，弃上清；所述75%的无 水乙醇的组成为750 μ L无水乙醇+250 μ L DEPC水； 加入ImL无水乙醇，漂洗沉淀，4°C，12000r/min，离心5min，弃上清，室温干燥IOmin ; 加入40 μ L的DEPC水溶解RNA，置于-80°C冰箱保存备用； 逆转录合成cDNA 采用权利要求6所述的RT-PCR试剂盒进行逆转录，反应程序：42°C，50min ;85°C， 5min ;反应结束后离心,置于-20°C保存； Real-time PCR 扩增 采用权利要求7所述RT-PCR试剂盒进行扩增，反应程序如下：95°C，IOmin ;95°C，15 Sec ; 60°C，Imin ;95°C，15 Sec ;60°C，15 Sec ; 验证目的基因表达 分析统计GRP78 mRNA的相对表达量，采用SDS 2. 3软件分析结果，Ct为每个反应管内 的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，采用比较Ct值法计算样本中GRP78 mRNA 相对表达量；计算2~ (- Λ Ct)值表示样品中目的基因初始mRNA相对表达量，Λ Ct是同一 个样本中目的基因 Ct值减去内参Ct值；按2~ (- Λ Ct)换算成基因表达量；以样本2的 2~ (- Λ Ct)值校正为1作为参照，计算出目的基因的相对表达量；使用SPSS19. 0统计软件， 计数数据以均数土标准差Cr = S)表示；以产< 0. 05为差异有统计学意义，以产< 0. 01为 差异有显著统计学意义。
【专利摘要】本发明涉及一种RT-PCR试剂盒及利用该试剂盒评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的方法。属于实时荧光定量逆转录聚合酶链反应试剂盒开发与人体病理学相结合的技术领域。检测血清中GPR78 mRNA转录水平的RT-PCR引物：引物F：5’-CCCGTCCAGAAAGTGTTG-3’；引物R：5’- CAGCACCATACGCTACAG-3’。本发明建立了利用特异性引物检测外周静脉血清GRP78 mRNA的方法；由于本方法采用了定量PCR扩增技术，使得检测GRP78 mRNA的敏感性大大提高，能保证在极少的标本中获得足够的信息。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104630351
【申请号】CN201510027159
【发明人】冯文明, 崔戈, 鲍鹰, 郭慧慧, 薛涛, 王翔
【申请人】湖州市第一人民医院
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月20日