置、离心取沉淀(梅花参粗多糖)。所得沉淀溶于5L水，加入醋酸钾使其终浓度为lmol/L， 并加入乙醇至40% (v/v)，静置、离心去沉淀，取上清液，继续加入乙醇至50% (v/v)，静置、 离心取沉淀。沉淀溶于水中，用截留分子量为3kDa的膜包超滤，截留产物浓缩，冷冻干燥， 即得到梅花参岩藻聚糖硫酸酯（FUC)约35g。
[0026]【实施例2】低聚岩藻聚糖硫酸酯的制备
[0027] 过氧化氢氧化降解梅花参岩藻聚糖硫酸酯：取实施例1中制备的FUC1. 0g，三水合 乙酸钠2. 72g和氯化钠1. 17g溶于38mL水中，加入2mL浓度为80mmol/L的乙酸铜溶液，搅 拌混匀。35°C水浴搅拌条件下，控制反应pH7. 5,以5mL/h速率滴加10% (v/v)的H202降解 反应3小时。加入0.lgNa2EDTA终止反应。反应液减压浓缩，加入2. 5倍体积95%乙醇沉 淀，静置、离心取沉淀。沉淀溶于水中，以截留分子量为l〇〇〇Da的透析袋透析，冷冻干燥，即 得低聚梅花参岩藻聚糖硫酸酯（dFUC-1) 0. 68g。
[0028]【实施例3】低聚岩藻聚糖硫酸酯的制备
[0029] 过氧化氢氧化降解梅花参岩藻聚糖硫酸酯：取实施例1中制备的FUC1. 0g，按照实 施例2的方法进行降解，H202降解反应6小时。后处理方法同实施例2,最后获得低聚梅花 参岩藻聚糖硫酸酯（dFUC-2) 0. 47g。
[0030]【实施例4】低聚岩藻聚糖硫酸酯的制备
[0031] 过氧化氢氧化降解梅花参岩藻聚糖硫酸酯：取实施例1中制备的FUC1. 0g，按照实 施例2的方法进行降解，45°C水浴搅拌降解反应2小时。后处理方法同实施例2,最后获得 低聚梅花参岩藻聚糖硫酸酯dFUC-3为0. 65g。
[0032]【实施例5】低聚岩藻聚糖硫酸酯的制备
[0033] 过氧化氢氧化降解梅花参岩藻聚糖硫酸酯：取实施例1中制备的FUC1. 0g，按照实 施例2的方法进行降解，45°C水浴搅拌降解反应4小时。后处理方法同实施例2,最后获得 低聚梅花参岩藻聚糖硫酸酯dFUC-4为0. 49g。
[0034]【实施例6】低聚岩藻聚糖硫酸酯的制备
[0035] 酸降解梅花参岩藻聚糖硫酸酯：取实施例1中制备的FUC1.0g，溶于 100mL0. 01mol/LHC1中，60°C水浴降解反应2小时。冷却，加氢氧化钠调至中性终止反应。 反应液减压浓缩，以截留分子量为l〇〇〇Da的透析袋透析，冷冻干燥，即得低聚梅花参岩藻 聚糖硫酸酯（dFUC-5)0.79g。
[0036]【实施例7】低聚岩藻聚糖硫酸酯的制备
[0037] 酸降解梅花参岩藻聚糖硫酸酯：取实施例1中制备的FUC1. 0g，按照实施例6的方 法进行降解，降解反应4小时。后处理方法同实施例6,最后获得低聚梅花参岩藻聚糖硫酸 酯dFUC-6 为 0? 81g。
[0038]【实施例8】低聚岩藻聚糖硫酸酯的制备
[0039] 酸降解梅花参岩藻聚糖硫酸酯：取实施例1中制备的FUC1. 0g，按照实施例6的方 法进行降解，降解反应6小时。后处理方法同实施例6,最后获得低聚梅花参岩藻聚糖硫酸 酯dFUC-7 为 0. 74g。
[0040]【实施例9】低聚岩藻聚糖硫酸酯的制备
[0041] 酸降解梅花参岩藻聚糖硫酸酯：取实施例1中制备的FUC1. 0g，溶于 100mL0. 03mol/LHC1中，60°C水浴降解反应2小时。冷却，加氢氧化钠调至中性终止反应。 反应液减压浓缩，以截留分子量为l〇〇〇Da的透析袋透析，冷冻干燥，即得低聚梅花参岩藻 聚糖硫酸酯（dFUC-8)0. 76g。
[0042]【实施例10】低聚岩藻聚糖硫酸酯的制备
[0043] 酸降解梅花参岩藻聚糖硫酸酯：取实施例1中制备的FUC1.0g，按照实施例9的方 法进行降解，降解反应4小时。后处理方法同实施例9,最后获得低聚梅花参岩藻聚糖硫酸 酯dFUC-9为0? 68g。
[0044]【实施例11】低聚岩藻聚糖硫酸酯的制备
[0045] 酸降解梅花参岩藻聚糖硫酸酯：取实施例1中制备的FUC1. 0g，按照实施例9的方 法进行降解，降解反应6小时。后处理方法同实施例9,最后获得低聚梅花参岩藻聚糖硫酸 酯dFUC-10 为 0? 65g。
[0046]【实施例12】岩藻聚糖硫酸酯的化学组成分析
[0047] 分子量的测定方法采用高效凝胶渗透色谱（HPGPC)法；岩藻糖含量测定方法参照 文献（Z.Dische.MethodsBiochem.Anal.，2 (1955) 313-358.);硫酸根含量测定方法参照文 献（Y.Kawai,N.Seno,K.Anno.Anal.Biochem, 32 (1969) 314-321.);单糖组成分析采用PMP 柱前衍生化HPLC法测定。结果如表1。
[0048]表1岩藻聚糖硫酸酯的化学组成
[0049]
【主权项】
1. 一种制备低聚岩藻聚糖硫酸酯的方法，包括以下步骤： (1) 以干燥棘皮动物为原料，以碱解、酶解提取获上清液； (2) 调节上清液pH值沉淀蛋白质，离心、盐析、醇沉获得粗多糖； (3) 经乙醇分级沉淀、超滤，获得岩藻聚糖硫酸酯； (4) 采用元素周期表第四周期过渡金属离子形成的催化剂催化的过氧化物降解或经酸 降解获得低聚岩藻聚糖硫酸酯； 其中，所述低聚岩藻聚糖硫酸酯的重均分子量为8-140kDa，其结构特征为至少包括质 量百分比为40%-60%的岩藻糖和20%-40%的硫酸酯基。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1所述碱解的条件为：加入6-10倍体 积量的〇? 1~lmol/LNaOH或KOH溶液，30°C~60°C下搅拌提取1~5小时。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1所述酶解的条件为：加入浓度0. 1~ 2%的木瓜蛋白酶、胰酶或胃蛋白酶。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2所述上清液pH值为2~4 ;盐析条件 为0. 5~2mol/L醋酸钾或醋酸钠；醇沉的乙醇质量浓度为40%~80%。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3所述乙醇分级沉淀的乙醇质量浓度为 45% ~80%。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4所述元素周期表第四周期过渡金属离 子形成的催化剂为选自Cu+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Cr3+、Cr2072'Mn2+、Zn2+、Ni2+形成的无机盐或有 机盐，或其组合。
7. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述金属离子为Cu2+。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4所述过氧化物为选自过氧乙酸、过氧 化氢、过硫酸钠。
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4所述酸降解为选自浓度0. 005~ 0.lmol/L的冰醋酸、柠檬酸、盐酸、硫酸；反应温度为40~80°C;反应时间为30分钟~8小 时。
10. 如权利要求1所述的方法，其中所述低聚岩藻聚糖硫酸酯还包括葡萄糖、半乳糖和 氨基半乳糖，其与岩藻糖的摩尔百分比为：（0.01~0.04) : (0~0.03) : (0~0.02) :1。
11. 一种由权利要求1所述方法制备而成的低聚岩藻聚糖硫酸酯及其药学上可接受的 盐，所述药学上可接受的盐为选自钠盐、钾盐和钙盐。
12. 如权利要求10所述的低聚岩藻聚糖硫酸酯在预防和/或治疗抗血栓药物中的应 用。
【专利摘要】本发明公开了一种制备低聚岩藻聚糖硫酸酯的方法，包括以干燥棘皮动物为原料，以碱解、酶解提取获上清液；调节上清液pH值沉淀蛋白质，离心、盐析、乙醇沉淀获得粗多糖；经乙醇分级沉淀、超滤，获得岩藻聚糖硫酸酯；采用元素周期表第四周期过渡金属离子形成的催化剂催化的过氧化物降解或经酸降解获得低聚岩藻聚糖硫酸酯；其中，所述低聚岩藻聚糖硫酸酯的重均分子量为8-140kDa，其结构特征为至少包括40%-60%的岩藻糖的20%-40%的硫酸酯基。
【IPC分类】A61K31-715, A61P7-02, C08B37-00
【公开号】CN104710539
【申请号】CN201310695032
【发明人】王宇, 陈艳萍, 谭道鹏, 冯贻东, 严启新, 冯汉林
【申请人】深圳海王药业有限公司
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2013年12月17日