专利名称：：高分子岩藻依聚糖、其制备方法及化妆品组合物的制作方法
技术领域：
：,[平成18年2月22日检索]，internet〈http://www.rike-vita.co.jp/prouse/health/mekabufukoidan.html>
发明内容发明要解决的问题05本发明的课题在于提供制备预计可作为化妆品或皮肤科领域的药剂的高分子量岩藻依聚糖的制备方法和含有高分子量岩藻依聚糖的化妆品等。06I本发明人为了解决上述问题进行了积极的研究，其结果是用pH6.0以上的中性-碱性热水提取枝管藻属(Cladosiphon)的海蕴，通过将最终的pH调整成6.5以上获得的重量平均分子量为1,000,000-2，000,000的岩藻依聚糖。进而发现这样获得的岩藻依聚糖可以长期稳定地保存，从而完成本发明。也就是说，第1发明为一种重量平均分子量为1，000,000-2,000，000并且稳定的岩藻依聚糖的制备方法，其特征在于通过用pH6.0以上的热7jc提取枝管藻属(Cladosiphon)的海蕴藻体，维持在pH6.5以上，进行除去低分子化合物的操作，并且将最终pH值调整成6.5以上来获得。<比较例2〉加水分解岩藻依聚糖水溶液及其乙醇沉淀物的制备用2规定的硫酸将实施例1获得的100g高分子量岩藻依聚糖水溶液调整至pH=5,在各温度，时间进行加热处理(7(TC下1小时，7(TC下2小时，9(TC下1小时)，获得了加水分解岩藻依聚糖水溶液。以下将这些加水分解岩藻依聚糖水溶液分别称为加水分解岩藻依聚糖水溶液(7tTC,1小时)，加水分解岩藻依聚糖水溶液(7(TC,2小时)，加水分解岩藻依聚糖水溶液(9(TC,l小时)。对100ml这些加水分解岩藻依聚糖水溶液进行同样的乙醇沉淀，获得加水分解岩藻依聚糖的乙醇沉淀物。以下将这些加水分解岩藻依聚糖的乙醇沉淀物分别称为"加水分解岩藻依聚糖(70'C,l小时)"，"加水分解岩藻依聚糖(70'C，2小时)","加水分解岩藻依聚糖(90'C,1小时)，'。[24<实施例3〉重量平均分子量的测定将实施例2获得的高分子量岩藻依聚糖和比较例2获得的加水分解岩藻依聚糖的各乙醇沉淀物分別溶解于浓度为Q.lmol/L(升)的氯化钠水溶液，制成0.05重量％的溶液后，施加到高效液相色谱(HPLC)(柱SB-806HQ(Shodex制)，柱温度室温(25'C),洗脱液浓度为0.1mol/L(升)的氯化钠水溶液，流速1.0ml/min，检测器RI;f全测器)上，用多角度光散乱检测器(DAWNEOS(注册商标第4377194号)Wyatt制)分析各岩藻依聚糖的重量平均分子量(Mw)。其结果示于表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>[371在15,30和45分钟后，高分子量岩藻依聚糖水溶液与纯化水相比均显示出具有保湿性。[381<实施例8〉透明质酸酶抑制活性的测定按照专利文献13中记载的方法，用牛睾丸来源的透明质酸酶(Sigma,TypeIV-S)测定由化合物48/80产生的非活性型透明质酸酶的活性化阶段的抑制活性。也就是说，将实施例2中获得的高分子量岩藻依聚糖的乙醇沉淀物和比较例2的加水分解岩藻依聚糖(9(TC,1小时)的乙醇沉淀物(加氷分解岩藻依聚糖(9(TC,1小时))分别溶于0.2ml浓度为0.lmot/L(升)的醋酸緩沖液(pH4.0)中，装入试管中，加入溶解于0.lml相同緩冲液中的透明质酸酶(IOO单位)，于37'C温育20分钟。然后，加入溶解于0.2ml相同缓冲液中的化合物48/80(0.lmg),再于37'C温育20分钟。在其中加入溶解于0.5ral相同緩冲液中的透明质酸钠盐(O.4mg),于37'C温育40分钟后，加入0.2ml浓度为0.4mol/L(升)的氢氧化钠水溶液，然后置于冰上冷4卩，加入0.2ml正硼酸溶液(将4.5g四硼酸鈣4水合物溶于水中形成100ml溶液)(pH9.1)，煮沸3分钟。置于冰上冷却后，加入6mlp-二曱氨基笨曱醛试剂，于37'C温育20分钟后，测定585nm处的吸光度。用下式计算抑制率。根据由各浓度的抑制率制成的透明质酸酶的抑制曲线求出50%抑制浓度(IC50)。[39(数1)抑制率—A-B)/Ax100(%)[40A:对照(使用代替岩藻依聚糖的醋酸緩冲液)的吸光度B:岩藻依聚糖溶液的吸光度[41测定结果示于表6。[42表6<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>[43!根据这些结果，发现高分子量岩藻依聚糖的透明质酸酶抑制活性比加水分解岩藻依聚糖强l.6倍。44<实施例9>保存稳定性试验(加速试样)对于实施例5制备的高分子量岩藻依聚糖的化妆水，评价其在40'C。2000Lux(勒克斯)的照明下保存4周的稳定性。用E型粘度计(EHD型)，圆锥3°，20rpm的旋转数测定粘度。通过目视评价外观。其结果示于表7。45表7<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>[46没有发现4(TC，保存4周后粘度降低，外观发生变化，从而可知保存稳定性优异。[47<实施例10>保湿性的评价(2)(与实施例7不同的另一个实验)用肥皂清洗受试者的前腕内側部。干燥后，于21。C，相对湿度50°/下调节后，在两腕的平均4个试验区(2个试验区/腕)上的每一个试验区上画直径为2cm的圓，在圆的内侧涂布平均10nL通过将蒸馏水，高分子量岩藻依聚糖水溶液(实施例1),加水分解岩藻依聚糖水溶液(70C，1小时)，加水分解岩藻依聚糖水溶液(7(TC,2小时)，加水分解岩藻依聚糖水溶液(90°C,1小时)的各乙醇沉淀物溶解于純化水中调制的1重量°/。的水溶液。处理200分钟后于上述环境下稳定，用CORNEOMETERCM825(CKelectronicGmbH)测量皮肤水分，计算4区的平均值。以纯化水涂布区的数值为1,计算相对皮肤水分。其结果示于表8。[48表8<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>[49高分子量岩藻依聚糖与纯化水，加水分解岩藻依聚糖相比，显示出显著的高保湿性。50<实施例u〉保水性评价将平均10liL通过将蒸馏水，高分子量岩藻依聚糖水溶液(实施例i),加水分解岩藻依聚糖水溶液(70。C,l小时)，加水分解岩藻依聚糖水溶液(7(TC,2小时)，加水分解岩藻依聚糖水溶液(90。C,1小时)的各乙醇沉淀物溶解于纯化水中调制的0.5重量％的水溶液用滤纸处理，于21'C，相对湿度50°/。的环境下，用电子天平测定每一份的重量，求出水分蒸发量。通过10分钟后的测量计算水分蒸发速度，求出纯化水的蒸发速度为1时的相对蒸发速度。其结果示于表9。[51表9<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>521<实施例12〉美容美发溶液的制备用实施例1制备的高分子量岩藻依聚糖水溶液(干燥残渣的重量1.2%),实施例2制备的加水分解岩藻依聚糖水溶液(90'C，1小时)，纯化水，乙醇制备美容美发溶液。各美容美发溶液的组成示于表10。[53表10美容美发溶液岩藻依聚糖水溶液纯化水乙醇A206020B206020注表中的数值表示岩藻依聚糖水溶液，純化水和乙醇的重量比在美容美发溶液A中，岩藻依聚糖水溶液使用高分子量岩藻依聚糖水溶液(实施例1)，在美容美发溶液B中，岩藻依聚糖水溶液使用加水分解岩藻依聚糖水溶液(90'C,1小时)。54j<实施例13〉采用损伤人毛的感观评价通过用市售的漂白剂处理5次人毛黑发(匕'工D，少夕7制，10g)制备损伤人毛。清洗，干燥后，通过对2ml实施例12的美容美发溶液A进行喷射处理，使之干燥。干燥后，比较与美容美发溶液B的指尖的光滑，潮湿感，柔软感。其结果示于表ll。并且，优于比较例2时为0，同等时为厶，比其差时为x。[55J表i1试样名光滑潮湿感柔软感美容美发溶液AOo〇美容美发溶液B△△〇[56<实施例14>细胞活化评价将人表皮纤维母细胞(NB1RGB抹)以5.0x103细胞/孔接种于96孔板上，在DMEM培养基(牛血清1W上培养48小时。将培养基换成含有预定浓度的实施例1中制备的高分子量岩藻依聚糖水溶液(干燥残渣的重量1.2W，实施例2中制备的加水分解岩藻依聚糖水溶液(70'C,1小时)，加水分解岩藻依聚糖水溶液(70'C，2小时)的各乙醇沉淀物的DMEM培养基后，再培养48小时，提供给WST-1测试。以与阴性对照(不添加岩藻依聚糖的DMEM培养基(牛血清1%))的值作为100°/。的相对值表示细胞活化活性。均连续实施两次。其结果示于表12中。57表12<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>[581表中的数值表示以与阴性对照(DMEM培养基(牛血清1%))的值作为100%的细胞活化活性的相对值。[591<实施例15>岩藻依聚糖的构成成分用曱酸(135'C，6小时)，接着用2M三氟醋酸(U0。C,6小时)对实施例2中获得的高分子量岩藻4衣聚糖沉淀物进行加水分解，用HPLC(柱Cosmosi1Sugar-D，六力，4亍X夕制，溶剂乙腈10mM磷酸緩冲液=75:25,流速=1.OmL/rain,RI检测器)分析。其结果表明，主要构成糖为岩藻糖，还含有葡糖醛酸。而且，用口^;/》酸法分析高分子量岩藻依聚糖沉淀物，通过溶解于重水中于60'CNMR(500MHz,日本电子制)测定硫酸基含量，根据1.3ppm附近的岩藻糖的甲基峰和2.2ppm的乙酰基峰的面积比求出乙酰基含有比。岩藻糖为1.0时的葡糖醛酸和乙酰基含有比示于表13。60表13构成分子比<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>[611而对于沉淀中的硫酸基，测得其含量为16.9重量％。权利要求1.重量平均分子量为1,000,000-2,000,000的岩藻依聚糖的制备方法，其包括用pH6.0以上的热水提取枝管藻属(Cladosiphon)的海蕴藻体的步骤，通过将pH值维持在6.5以上除去低分子化合物的步骤，以及将最终pH值调整成6.5以上的步骤。2.通过包括用pH6.0以上的热水提取枝管藻属(Cladosiphon)的海蕴藻体的步骤，将pH值維持在6.5以上除去低分子化合物的步骤，以及将最终pH值调整成6.5以上的步骤的制备方法获得的重量平均分子量为1,000,000-2，000,000的岩藻依聚糖。3.重量平均分子量为1,000,000-2,000,000的岩藻依聚糖。4.权利要求2或权利要求3中记载的岩藻依聚糖，其中，用C型粘度计于20rpm,25'C下测得干燥残渣重量为1.0-2.0重量y。的水溶液的粘度为600-1500mPa.s。5.含有权利要求2-4中任一项记栽的岩藻依聚糖的岩藻依聚糖含有组合物。6.根据权利要求5中记载的岩藻依聚糖含有组合物，所述岩藻依聚糖含有组合物为化妆品，皮肤细胞活化剂或抗过敏剂。全文摘要本发明提供一种预计作为化妆品和皮肤科领域的药剂的高分子量岩藻依聚糖的制备方法以及含有高分子量岩藻依聚糖的组合物。用pH6.0以上的中性-碱性热水提取枝管藻属(Cladosiphon)的海蕴，通过超滤除去低分子化合物，最后将pH调整成6.5以上，从而获得重量平均分子量为1,000,000-2,000,000的岩藻依聚糖含有物，该含有物可作为有效的化妆品和皮肤科领域药剂，且保存稳定性优异。文档编号A61K8/73GK101098894SQ200680001708公开日2008年1月2日申请日期2006年3月1日优先权日2005年3月1日发明者中本泰,秦野耕司,金築祐申请人:宇部兴产株式会社