性研宄表明，Cu3BiS3空心纳米球显示可以忽略的毒性，如图图6、图9中的a、b部分所不；
实施例4
1.将实施例1制得的聚乙二醇化的Cu3BiS3空心纳米球重新分散于高纯水中，浓度为Img/ml，取其2 ml加入到石英比色皿(容量3 ml)中，磁子搅拌，用测温仪测得其初始温度为22 0C ；
2.固定980nm激光器到石英比色皿的距离为5 cm，调节激光器电流大小，控制输出功率为1.2 Wcm_2，间隔30 s读取测温仪温度示数，记录温度，300 s后测得末温为52 °C，即5min中温度升高了 30 0C，如图7所示，说明Cu3BiS3S心纳米球可以有效的将近红外光转化为热，具有很好的光热转化性能 3.取2 ml高纯水加入同等容量石英比色皿中，磁子搅拌，用测温仪测得初始温度为22V，同样固定980 nm激光器到石英比色皿的距离为5cm，调节激光器电流大小，控制输出功率为1.2 Wcm_2，间隔30s读取测温仪温度示数，记录温度，300 s后测得末温为25 °C，即5min中温度升高了 3 °C，如图7所示，结果表明没有Cu3BiS3空心纳米球存在时，水吸收红外光仅产生有限的热。
[0024]实施例5
1)用96孔细胞培养板培养HeLa细胞，保证每个孔的细胞数为5X13个，用含胎牛血清培养基(DMEM)在0)2含量5%的37 °0恒温细胞培养箱中培养24小时；
2)24小时后吸掉培养液，并用PBS冲洗一次HeLa细胞，洗掉已凋零死亡的HeLa细胞；加入无血清DMEM培养基，在0)2含量5%的37 °0恒温细胞培养箱中培养12小时；
3)12小时后吸掉培养液，用含胎牛血清DMEM培养基分散实施例1中制得的Cu3BiS3空心纳米球，配成浓度为I mg/ml的Cu3BiS3S心纳米球培养基溶液，用DMEM稀释成一系列浓度的溶液(0.1,0.5，1，5，10，25 μ g/ml )，并用这一系列浓度的溶液代替细胞培养基进行HeLa细胞培养，每个浓度都设置8个副孔，同时另外设置8个孔位阴性对照组(加不含Cu3BiS3空心纳米球的胎牛血清培养基，随后其余实验条件一致)在CO 2含量5%的37 °〇恒温细胞培养箱中培养24小时；
4)取出96孔板后，固定980nm激光器到孔液面距离为5 cm，调节电流大小控制激光器输出功率为0.72 WcnT2，从上往下照射每个孔的时间为5 min ；
5)照射结束后每个孔中加入20ul (5 mg/ml) 3- (4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)，随后放入0)2含量5%的37 °0恒温细胞培养箱中培养4小时；
4小时后，出现蓝色大颗粒结晶，加入200 μ I DMS0，放到低速摇床上震荡10 min，用酶标仪测得490 nm下的光学密度值。光学密度值分析结果(如图8所示)和显微镜观察(如图9中的c部分所示)表明，5 μ g/mL浓度的Cu3BiS3S心纳米球即可以有效消融癌细胞。
[0025]实施例6
1)2 mg DOX分散到20 ml超纯水中，搅拌溶解后，紫外可见分光光度计测得480 nm处最强吸光度值。
[0026]2) 10 mg Cu3BiS3空心纳米球分散到20 ml的DOX水溶液中(0.1 mg/ml)，室温下暗处搅拌48小时，吸附平衡后离心(1000 rpm) 10 min，并用超纯水洗两遍，洗去未吸附的D0X,收集上清液，用紫外可见分光光度计测得480 nm处最强吸光度值，剩余固体粉末放于60 0C的真空干燥箱干燥6小时。
[0027]3)取步骤2)中所得的固体粉末(Cu3BiS3-DOX)分别分散到2 ml PBS (pH =5)和2 ml PBS (pH= 7)溶液中，形成两种浓度为I mg/ml的溶液。在37 °C的环境温度下搅拌，间隔I小时后两种溶液各用980 nm激光器(输出功率为0.72 WcnT2)照射5 min，各取I ml上诉照射后的溶液离心取上清液用紫外可见分光光度计测其480 nm吸光度值，同时离心后的粉末用等PH等体积的新PBS溶液分散补回原来的2 ml溶液中，重复上诉操作继续进行药物释放研宄5小时。如图10所示，样品在红外光辐照下，特别是pH = 5时，显示很好的释放性能。
[0028]实施例7
1)10 mg Cu3BiS3空心纳米球分散到20 ml (0.1 mg/ml)的DOX溶液中，室温下暗处搅拌48小时，吸附平衡后离心(1000 rpm) 10 min，并用高纯水洗两遍，洗去未吸附的DOX，剩余黑色固体粉末放于60 °C的真空干燥箱干燥6小时。
[0029]2)取步骤I)所得的黑色固体粉末2 mg分散到DMEM培养基中(I mg/ml)，并用DMEM稀释成一系列浓度的溶液(0.1,0.5，1，5，10，25 μ g/ml),替代细胞培养基进行HeLa细胞培养(5 X 13个/孔，经24小时培养)，每个浓度都设置8个副孔，同时另外设置8个孔为阴性对照组(纯胎牛血清培养基，随后其余实验条件一致)在CO2含量5%的37 °C恒温细胞培养箱中培养24小时；
3)取出96孔板后，固定980nm激光器到孔液面距离为5 cm，调节电流大小控制激光器输出功率为0.72 WcnT2，从上往下照射每个孔的时间为5 min ；
4)照射结束后每个孔中加入20ul (5 mg/ml) 3- (4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)，随后放入0)2含量5%的37 °0恒温细胞培养箱中培养4小时；
5)4小时后，出现蓝色大颗粒结晶，加入200 μ I DMS0，放到低速摇床上震荡10 min,用酶标仪测得490 nm下的光学密度值。
[0030]如图10所示，在光热及药物协同作用下，样品显示最佳的杀死细胞功能。
【主权项】
1.一种聚乙二醇化的Cu 3BiS3空心纳米球的制备方法，其特征在于:包括如下步骤:I)制备A混合溶液:将氯化铜CuCl2、五水硝酸铋Bi (NO3) 3.5Η20，溶于乙二醇中，搅拌I小时后得到 A 混合溶液，CuCl2、Bi(N03)3*5H20、乙二醇的比例为 0.45 mmol: 0.15 mmol:55 ml;制备B混合溶液:将L-半胱氨酸、PEG(Mn=2000)，溶于乙二醇，搅拌I小时后得到B混合溶液；L-半胱氨酸、PEG、乙二醇的比例为0.6 mmol:4 mL:5 mL ； CuCl2、Bi (NO3) 3.5Η20和L-半胱氨酸的摩尔比为3:1:4 ; 2)将步骤I)得到的A混合溶液在200 °C条件下油浴回流反应I h，得到A反应液；将步骤I)得到的B混合溶液注入A反应液中，搅拌I小时后转移到高压釜中，在200 °C条件下反应I h，冷却，离心，洗涤，干燥，即得聚乙二醇化的Cu3BiS3空心纳米球。
2.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化的Cu3BiS3S心纳米球的制备方法，其特征在于:所述步骤I)中B混合溶液的PEG分子量为2000，用量为4mL。
3.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化的Cu3BiS3e心纳米球的制备方法，其特征在于:所述步骤2)中高压釜为150 mL的聚四氟乙烯不锈钢反应釜。
4.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化的Cu3BiS3S心纳米球的制备方法，其特征在于:所述步骤2)中洗涤过程采用为水、乙醇各洗涤3-5次。
5.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇化的Cu3BiS3S心纳米球的制备方法，其特征在于:制得的所述Cu3BiS3空心纳米球应用于红外光激发的药物传递、热疗、热疗协同化疗杀死癌细胞。
【专利摘要】本发明公开了一种聚乙二醇化的Cu3BiS3空心纳米球的制备方法，包括如下步骤：1）制备A混合溶液：将氯化铜CuCl2、五水硝酸铋Bi(NO3)3?5H2O，溶于乙二醇中，搅拌1小时后得到A混合溶液，CuCl2、Bi(NO3)3?5H2O、乙二醇的比例为0.45mmol:0.15mmol:55ml;制备B混合溶液：将L-半胱氨酸、PEG（Mn=2000），溶于乙二醇，搅拌1小时后得到B混合溶液；L-半胱氨酸、PEG、乙二醇的比例为0.6mmol：4mL:5mL；CuCl2、Bi(NO3)3?5H2O和L-半胱氨酸的摩尔比为3:1:4；2）将步骤1）得到的A混合溶液在200℃条件下油浴回流反应1h，得到A反应液；将步骤1）得到的B混合溶液注入A反应液中，搅拌1小时后转移到高压釜中，在200℃条件下反应1h，冷却，离心，洗涤，干燥，即得聚乙二醇化的Cu3BiS3空心纳米球。
【IPC分类】C08L71-08, A61K41-00, B82Y30-00, C08K7-24, A61P35-00, C01G3-12, A61K47-04, C08J3-12, C01G29-00, C08K3-30, B82Y40-00
【公开号】CN104710632
【申请号】CN201410488943
【发明人】周淑美, 马德琨, 黄少铭
【申请人】温州大学
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2014年9月23日