多种化学促进剂提高微生物异养发酵生产二十二碳六烯酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及利用多种化学促进剂提高异养微生物发酵生 产DHA的方法。
【背景技术】
[0002] DHA即二十二碳六稀酸（Docosahexaenoic Acid, DHA)是人脑发育、成长的重要物 质之一，是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高达20%，在眼睛视网膜 中所占比例最大，约占50%。因此，它对胎儿和婴幼儿的大脑和视网膜的发育，以及成年人脑 功能的维修等方面有着重要的作用。此外，DHA对冠心病、中风、高血压等心血管系统的疾 病、神经失常、老年痴呆症和抑郁症等神经系统的疾病也有积极的影响。DHA作为一种必需 脂肪酸，其增强记忆与思维能力、提高智力等作用更为显著。人群流行病学研宄发现，体内 DHA含量高的人的心理承受力较强，智力发育指数也高。DHA还可用于癌症治疗，抑制发炎 等。据荷兰帝斯曼公司的估计，DHA的全球市场价值约为25-26. 2亿美元，并且以每年15% 以上的速度增长。
[0003] 截止目前为止，深海鱼油一直是市售的DHA的主要来源。但这一主要来源存在诸 多缺点，比如海洋污染造成的对鱼油安全性的担忧，鱼油质量会随着鱼的种类、捕捞季节和 地点的不同而不同，含EPA、易受环境污染、纯化成本高，鱼油的特殊气味也限制了鱼油来源 的DHA作为一种食品添加剂的应用。尤其是考虑到DHA的主要消费者是怀孕妇女和年幼的 孩子，其可能的不利影响更令人担忧；此外，世界渔业资源的逐年萎缩对DHA的可持续性供 应的影响也值得考虑。
[0004] 利用隐甲藻（)发酵生产DHA，与传统鱼油来源相比， 具有一系列优点，如发酵周期短，培养方式简单，微生物生长快，易于大规模培养；多不饱和 脂肪酸含量高，产品质量稳定，氧化稳定性较好，不饱和脂肪酸成分单一，不含EPA或EPA含 量低，易于分离纯化；同时克服了传统的从鱼油中获取DHA受原料、气候、产地、生产周期等 诸多限制因素的影响。因此微生物发酵生产DHA可替代鱼油来源的DHA，具有广泛的应用前 景。
[0005] 隐甲藻是一种原始的真核单细胞微生物，营异养生活，在甲藻门中处于较低等的 地位。隐甲藻的细胞周期可粗划分为细胞生长阶段和稳定时期，其中稳定期是隐甲藻积累 DHA的主要阶段。目前工程培养隐甲藻细胞过程中，油脂产量较低。在不抑制隐甲藻自身生 长的前提下，在培养基中添加各类刺激隐甲藻油脂积累的物质成为改善发酵培养的重要方 向，但是对其代谢机理是不清楚的，这限制了对其的开发应用。
[0006] 植物生长调节剂是一类与植物激素具有相似生理和生物学效应的物质，具有调控 植物生长和发育的功能。作为外源的非营养性化学物质，植物生长调节剂通常可在植物体 内传导至作用部位，以很低的浓度就能促进或抑制其生命过程的某些环节，使之向符合人 类的需要发展。它不仅适用于种植业中几乎所有的高等和低等植物，还可用于食用菌及藻 类的生长，且具有用量少、残毒小的特点。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用多种化学促进剂提高异养 微生物发酵生产DHA的方法。
[0008] 为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是：利用代谢组学分析在一种或两种 化学促进剂刺激下二十二碳六烯酸累积明显的寇氏隐甲藻细胞内代谢物丰度的变化情况。
[0009] 本发明多种化学促进剂提高异养微生物发酵生产二十二碳六烯酸（DHA)的方法的 特征是，以寇氏隐甲藻的异养培养基为基础，在其中添加任一种化学促进剂；所说的异养培 养基的组成为：葡萄糖9 g/L，酵母浸粉2 g/L，海盐25 g/L;所说的化学促进剂也可称 为植物生长调节剂，包括吲哚乙酸（IAA)、萘氧乙酸（ΒΝ0Α)、氯苯甲酸、水杨酸（SA)、脱落酸 (ABA)、乙醇胺，这些化学促进剂在所说的异养培养基中的浓度为：B引哚乙酸（IAA) 2. 5 mg/ 1，萘氧乙酸0^(^)4 11^凡，氯苯甲酸4 11^凡，水杨酸（34)111^凡，脱落酸（41^)2〇11^凡， 乙醇胺2.5 mM; 25 ° C下培养72小时后，提取油脂，使用气质联用仪测定培养物DHA含量， 使用t检验分析添加化学促进剂的样品与对照之间的显著性差异，同时从平行培养物中提 取细胞代谢物，利用代谢组学方法检测分析胞内代谢物的变化情况。
[0010] 在所说的异养培养基中还可添加两种组合的植物生长调节剂，即萘氧乙酸（BNOA) 与乙醇胺和水杨酸（SA)与乙醇胺两种组合；所说的两种组合的植物生长调节剂在异养培 养基中的浓度为：萘氧乙酸（BNOA) 4 mg/L，水杨酸（SA) I mg/L，乙醇胺2. 5 mM。
[0011] 通过基于液质联用仪（LC-MS)的代谢组分析，糖酵解途径、三羧酸循环以及磷酸 戊糖途径中代谢物含量与通过在异样培养基中添加化学促进剂来提高异养微生物胞内DHA 含量有密切联系，在不同种化学促进剂的刺激下，异养微生物胞内DHA含量明显提高的同 时，糖酵解途径和三羧酸循环中的主要代谢物含量均上调，而磷酸戊糖途径中的代谢物含 量则下调；同时，与DHA累积相关的一系列生物标志物包括葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、 果糖-1，6-二磷酸、磷酸二羟丙酮、乙酰-辅酶A、草酰乙酸、甘油醛-3-磷酸、核糖-5-磷 酸、磷酸烯醇式丙酮酸。
[0012] 本发明的有益效果是：使用t检验分析，表明添加化学促进剂的样品与对照之间 存在显著性差异，化学促进剂的添加能有效提高寇氏隐甲藻细胞二十二碳六烯酸（DHA)累 积量，同时，发现了糖酵解途径、三羧酸循环以及磷酸戊糖途径与通过在异样培养基中添加 化学促进剂来提高异养微生物胞内DHA含量有密切联系，并且公开了与DHA积累密切相关 的生物标志物。
【附图说明】
[0013] 图1为分别添加水杨酸（SA)、乙醇胺以及水杨酸（SA)&乙醇胺混合物培养后，使用 油脂抽提以及气质联用仪（GC-MS/MS)的方法测定的寇氏隐甲藻二十二碳六烯酸（DHA)相 对含量对比图〈〇.〇5; # /7〈0.01; /7〈0.001)。值小于0.05表明添加化学促 进剂的样品与对照间存在显著性差异，值越小，差异越大。
[0014] 图2为分别添加萘氧乙酸（ΒΝ0Α)、乙醇胺以及萘氧乙酸（BNOA) &乙醇胺混合物培 养后，使用油脂抽提以及气质联用仪（GC-MS/MS)的方法测定的寇氏隐甲藻二十二碳六烯酸 (DHA)相对含量对比图（* /7〈0.05; # /7〈0.01)。值小于0.05表明添加化学促进剂的 样品与对照间存在显著性差异，值越小，差异越大。
[0015] 图3为添加水杨酸（SAU乙醇胺混合物培养后，使用LC-MS的方法分析寇氏隐甲 藻胞内代谢物的变化情况，图中加大加粗字体为上调代谢物，加大