一种利用基因工程蓝藻生产三碳化合物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用基因工程蓝藻生产三碳化合物的方法，尤其涉及一种利用基 因工程蓝藻直接转化CO 2生产三碳化合物的方法。
【背景技术】
[0002] 三碳化合物，如二羟基丙酮、3-羟基丙酸、1，3-丙二醇、d-甘油酸和羟基丙酮酸 等，在化工、材料、医药和纺织等工业中具有广泛的用途，可作为化学合成和生物催化的原 料用于生产各种化学品和燃料等高值产物。二羟基丙酮广泛用于化妆品工业中，其在化学 品和生物材料合成中也有着广泛的应用；3-羟基丙酸是美国能源部筛选的最具前景的12 种平台化合物之一，可用于合成丙烯酸、丙二酸等多种化学品，其自聚物聚3-羟基丙酸是 一种新型的生物降解性塑料；1，3-丙二醇可用于多种药物、医药中间体和聚合物（如聚对 苯二甲酸丙二醇酯，又称PTT)的合成，市场需求量大；d-甘油酸是在植物中发现的一种生 物活性物质，其与其的衍生物具有重要的药用价值，d-甘油酸同时也可用作表面活性剂和 聚合单体。基于可持续发展的需求，生物转化可再生生物质资源生产三碳化合物受到越来 越多的关注。但是，生物质资源的收集、处理、分解等过程耗时且成本高。
[0003] 蓝藻（Cyanobacteria)又称蓝细菌，是可以进行光合作用的原核生物，其分布十 分广泛，大多数为淡水产，少数海产。蓝藻生长快速，具有高效的〇) 2固定效率，且遗传背景 简单，易于进行遗传操作，部分蓝藻已具有成熟的遗传操作体系。目前已有基因工程改造蓝 藻生产乳酸、丙酮、丁醇、乙醇和氢气等化学品和燃料的报道。但是，目前还没有使用基因工 程蓝藻直接转化〇) 2生产重要三碳化合物如二羟基丙酮、3-羟基丙酸、1，3-丙二醇、d-甘油 酸和羟基丙酮酸的相关报道。
[0004] 因此，本领域的技术人员致力于开发一种利用基因工程蓝藻直接转化CO2生产三 碳化合物的方法。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种利用基因工程蓝藻直接转化CO2生产三 碳化合物的方法。本发明所述的方法避免了生物质资源高成本的收集、处理和分解过程，直 接使用廉价原料〇) 2作为碳源，可以减少大气中CO 2的排放，具有重要的应用价值。
[0006] 本发明提供的一种利用基因工程蓝藻生产三碳化合物的方法，具体为，将三碳化 合物合成途径的相关基因转化到蓝藻中，制得基因工程蓝藻，扩大培养基因工程蓝藻生产 三碳化合物。
[0007] 进一步地，上述三碳化合物包括二羟基丙酮、3-羟基丙酸、1，3-丙二醇、D-甘油酸 和羟基丙酮酸。
[0008] 进一步地，上述三碳化合物为二羟基丙酮，对应的所述基因工程蓝藻中携带有甘 油-3-磷酸酶的编码基因和甘油脱氢酶的编码基因；
[0009] 或者上述三碳化合物为3-羟基丙酸，对应的所述基因工程蓝藻中携带有甘 油-3-磷酸酶的编码基因、甘油脱水酶的编码基因和醛脱氢酶的编码基因；
[0010] 或者上述三碳化合物为1，3_丙二醇，对应的所述基因工程蓝藻中携带有甘 油-3-磷酸酶的编码基因、甘油脱水酶的编码基因和醇脱氢酶的编码基因；
[0011] 或者上述三碳化合物为d-甘油酸，对应的所述基因工程蓝藻中携带有甘油-3-磷 酸酶的编码基因、醛醇氧化酶的编码基因和过氧化氢酶的编码基因；
[0012] 或者上述三碳化合物为羟基丙酮酸，对应的所述基因工程蓝藻中携带有甘 油-3-磷酸酶的编码基因、醛醇氧化酶的编码基因、过氧化氢酶的编码基因和甘油酸氧化 酶的编码基因。
[0013] 其中，在基因工程蓝藻中，各个基因是串联表达，且串联结构含有启动子，优选地， 启动子为Ptrc启动子，序列如SEQ ID NO. 9。
[0014] 进一步地，甘油-3-磷酸酶的编码基因能够与SEQ ID NO. 1的核苷酸序列杂交，并 且编码具有甘油-3-磷酸酶活性的蛋白质，其中上述甘油-3-磷酸酶的编码基因来源于酿 酒酵母；
[0015] 甘油脱氢酶的编码基因能够与SEQ ID NO. 2的核苷酸序列杂交，并且编码具有甘 油脱氢酶活性的蛋白质，其中所述甘油脱氢酶的编码基因来源于肺炎克雷伯氏菌；
[0016] 甘油脱水酶的编码基因能够与SEQ ID NO. 3的核苷酸序列杂交，并且编码具有甘 油脱水酶活性的蛋白质，其中所述甘油脱水酶的编码基因来源于丁酸梭菌；
[0017] 醛脱氢酶的编码基因能够与SEQ ID NO. 4的核苷酸序列杂交，并且编码具有醛脱 氢酶活性的蛋白质，其中所述醛脱氢酶的编码基因来源于大肠杆菌；
[0018] 醇脱氢酶的编码基因能够与SEQ ID NO. 5的核苷酸序列杂交，并且编码具有醇脱 氢酶活性的蛋白质，其中所述醇脱氢酶的编码基因来源于大肠杆菌；
[0019] 醛醇氧化酶的编码基因能够与SEQ ID NO. 6的核苷酸序列杂交，并且编码具有醛 醇氧化酶活性的蛋白质，其中所述醛醇氧化酶的编码基因来源于链霉菌；
[0020] 过氧化氢酶的编码基因能够与SEQ ID NO. 7的核苷酸序列杂交，并且编码具有过 氧化氢酶活性的蛋白质，其中所述过氧化氢酶的编码基因来源于大肠杆菌；
[0021] 甘油酸氧化酶的编码基因能够与SEQ ID NO. 8的核苷酸序列杂交，并且编码具有 甘油酸氧化酶活性的蛋白质，其中所述甘油酸氧化酶的编码基因来源于假单胞菌。
[0022] 进一步地，蓝藻选自聚球藻属、集胞藻属、念珠藻属、隐球藻属、鱼腥藻属、球藻属、 颤藻属、阿格藻属、双歧藻属和鞭枝藻属中的一种，优选为聚球藻属，最优选为细长聚球藻 PCC 7942。
[0023] 进一步地，本发明提供的一种利用基因工程蓝藻生产三碳化合物的方法，包括以 下步骤：
[0024] 1)将要转化到蓝藻中的基因与Ptrc启动子一同连接到重组质粒，将重组质粒转 化到蓝藻中，制得基因工程蓝藻；
[0025] 2)将步骤（1)中的基因工程蓝藻接种到BGll液体培养基中，30°C光照培养7-10 天，制得种子；
[0026] 3)将步骤⑵中制得的种子接种到新鲜BGll液体培养基中进行扩大培养，30°C光 照培养2-3天至OD 73tol达到0. 5-0. 6,加入IPTG诱导基因表达，继续光照培养10-20天，得 到含有相应产物的培养液；
[0027] 4)将步骤⑶中制得的培养液收集，12, OOOXg离心5分钟，取上清，使用液相色 谱仪检测样品的含量。
[0028] 进一步地，上述步骤⑴~⑶中上述的BGll培养基配方为：
[0029] BGll 母液：梓檬酸铁铵溶液（6g/L) :Na2C03溶液（20g/L) :K2HP04溶液（30. 5g/L): 蒸馈水的体积比为：1〇 :1 :1 :1 :987,配制完成后121 C灭囷20分钟；
[0030] 进一步地，上述 BGll 母液的配方是：149. 6g NaNO3, 7. 5g MgSO4 · 7H20, 3. 6g CaCl2 ·2Η20,0. 6g 柠檬酸，I. 12mL 0. 25M NaEDTA 溶液（pH 8. 0)，IOOmL 微量元素溶液，蒸馏 水定容至1L。
[0031] 进一步地，BGll 微量元素溶液的配方是：2. 86g H3BO3,1. 81g MnCl2 · 7Η20,0· 22g ZnSO4 · 7Η20,0· 39g Na2MoO4 · 2Η20,0· 079g CuSO4 · 5Η20,0· 049g Co(NO3)2 · 6H20,蒸馏水定 容至1L。
[0032] 进一步地，上述步骤（I) (2) (3)中所述的光照培养为100 μΕ ·πΓ2光强度下连 续光照，并连续通入5%体积比CO2气体。
[0033] 进一步地，上述步骤（3)中，IPTG的终浓度为0. 1-2. OmM，优选的，IPTG终浓度为 ImM0
[0034] 进一步地，上述步骤⑷中，所用液相色谱仪的型号为Agilent 1200系列 Hewlett - Packard，检测器为紫外检测器和示差折光检测器，紫外检测器的检测波长为 210nm。使用的液相色谱柱为 Bio-Rad Aminex HPX-87H column(300X7. 8mm)。流动相为 5mM H2SO4，检测器温度和柱温箱温度均为55°C，流速为0. 5mL/min。
[0035] 本发明对蓝藻进行基因工程改造，将三碳化合物合成途径的相关基因转化到蓝藻 中，获得的基因工程蓝藻可以直接利用太阳能和CO 2生产三碳化合物如二羟基丙酮、3-羟基 丙酸、1，3-丙二醇、d-甘油酸和羟基丙酮酸，避免了生物质资源的消耗，节约了原料成本。 这些三碳化合物可作为平台化合物，用于多种化学品、燃料和生物材料的合成。因此，该方 法具有广阔的应用前景。
[0036] 以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以 充分地了解本发明的目的、特征和效果。
【附图说明】
[0037] 图1是本发明实施例1中pAM-YW2质粒的构建和实施例2中pAM-YW3质粒的构建 的不意图；
[0038] 图2是本发明实施例4中利用基因工程蓝藻转化CO2生产二羟基丙酮的浓度随诱 导天数变化图；
[0039] 图3是本发明实施例5中在不同条件