蓝藻的筛选
[0088] 1)蓝藻菌株转化
[0089] 将细长聚球藻PCC 7942培养至OD73tlmi为0. 4-0. 8,取IOmL蓝藻培养液，5, OOOXg 离心5分钟，去除上清收集菌体；用无菌的IOmM NaCl洗涤一次，用5mL新鲜的BGll培养基 将菌体重悬；取500 yL蓝藻重悬液至I. 5mL离心管中，加入终浓度为100ng/mL的重组质 粒，混匀后，30°C避光培养12-18小时；将蓝藻重悬液与重组质粒DNA的混合物涂布于BGll 固体培养基（含有壮观霉素20 μ g/mL)，30°C、100 μ E ·πΓ2的光照强度下培养10-14天， 至BGll固体培养基上出现单菌落。
[0090] 2)基因工程蓝藻的筛选
[0091] 将BGll固体培养基上生长出的蓝藻转化子单菌落，挑取至5mL BGll液体培养基 中（含有壮观霉素20 μ g/mL)，30°C、100 μ E · S4 ·πΓ2的光照强度下培养10-14天。提取蓝 藻转化子的基因组DNA，使用相应的引物，利用PCR的方法从蓝藻转化子基因组DNA中扩增 重组质粒引入的基因片段，能扩增出目的基因片段的蓝藻转化子，为正确的基因工程蓝藻。
[0092] 实施例4 :利用基因工程蓝藻转化0)2生产二羟基丙酮
[0093] 1)基因工程蓝藻YW2的构建
[0094] 按照实施例4的方法，将重组质粒pAM-YW2转化至细长聚球藻PCC 7942,获得基因 工程蓝藻YW2。
[0095] 2)利用基因工程蓝藻转化0)2生产二羟基丙酮
[0096] 将基因工程蓝藻YW2接种到BGll液体培养基中，30°C光照培养7-10天，制得种 子；将种子接种到新鲜BGll液体培养基中进行扩大培养，30°C光照培养2-3天至OD 73cJi 到0. 5-0. 6,加入ImM IPTG诱导基因表达，继续光照培养16天，得到含有二羟基丙酮的培养 液。将培养液收集，使用液相色谱仪检测培养液中二羟基丙酮的产量，可达到78. 6mg/L，如 图2所示。
[0097] 实施例5 :利用基因工程蓝藻转化CO2生产3-羟基丙酸
[0098] 1)基因工程蓝藻YW3的构建
[0099] 按照实施例4的方法，将重组质粒pAM-YW3转化至细长聚球藻PCC 7942,获得基因 工程蓝藻YW3。
[0100] 2)利用基因工程蓝藻转化CO2生产3-羟基丙酸
[0101] 将基因工程蓝藻YW3接种到BGll液体培养基中，30°C光照培养7-10天，制得种 子；将种子接种到新鲜BGll液体培养基中进行扩大培养，30°C光照培养4-6天至OD 73cJi 到1. 〇,离心收集菌体，使用新鲜的BGll培养基或去除氮源和磷源的BGll培养基重悬菌体 至OD73tlmi为5. 0,加入ImM IPTG诱导基因表达，使用如图3中所示的光照或黑暗、有氧或无 氧的条件培养8天，得到含有3-羟基丙酸的培养液。将培养液收集，使用液相色谱仪检测 培养液中3-羟基丙酸的产量。当基因工程蓝藻YW3使用去除氮源和磷源的BGll培养基、 黑暗和无氧的培养条件时，可生产最高浓度的3-羟基丙酸31. 7mg/L，如图3所示。所生产 的3-羟基丙酸，使用液相色谱仪和液质联用仪进行了验证，如图4所示。
[0102] 其中，所使用的去除氮源和磷源的BGll培养基为：不添加 K2HPOjP NaNO 3的BGll 培养基。
[0103] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创 造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员 依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术 方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种利用基因工程蓝藻生产三碳化合物的方法，其特征在于，将三碳化合物合成途 径的相关基因转化到蓝藻中，制得基因工程蓝藻，通过扩大培养基因工程蓝藻生产三碳化 合物。
2. 根据权利要求1所述的一种利用基因工程蓝藻生产三碳化合物的方法，其特征在 于，所述三碳化合物包括二羟基丙酮、3-羟基丙酸、1，3-丙二醇、D-甘油酸和羟基丙酮酸。
3. 根据权利要求2所述的一种利用基因工程蓝藻生产三碳化合物的方法，其特征在 于： 所述三碳化合物为二羟基丙酮，对应的所述基因工程蓝藻中携带有甘油-3-磷酸酶的 编码基因和甘油脱氢酶的编码基因； 或者所述三碳化合物为3-羟基丙酸，对应的所述基因工程蓝藻中携带有甘油-3-磷酸 酶的编码基因、甘油脱水酶的编码基因和醛脱氢酶的编码基因； 或者所述三碳化合物为1，3-丙二醇，对应的所述基因工程蓝藻中携带有甘油-3-磷酸 酶的编码基因、甘油脱水酶的编码基因和醇脱氢酶的编码基因； 或者所述三碳化合物为d-甘油酸，对应的所述基因工程蓝藻中携带有甘油-3-磷酸酶 的编码基因、醛醇氧化酶的编码基因和过氧化氢酶的编码基因； 或者所述三碳化合物为羟基丙酮酸，对应的所述基因工程蓝藻中携带有甘油-3-磷酸 酶的编码基因、醛醇氧化酶的编码基因、过氧化氢酶的编码基因和甘油酸氧化酶的编码基 因。
4. 根据权利要求3所述的一种利用基因工程蓝藻生产三碳化合物的方法，其特征在 于，在基因工程蓝藻中，各个基因是串联表达，且串联结构含有启动子。
5. 根据权利要求3所述的一种利用基因工程蓝藻生产三碳化合物的方法，其特征在 于： 所述甘油-3-磷酸酶的编码基因能够与SEQIDNO. 1的核苷酸序列杂交，并且编码具 有甘油-3-磷酸酶活性的蛋白质，其中所述甘油-3-磷酸酶的编码基因来源于酿酒酵母； 所述甘油脱氢酶的编码基因能够与SEQIDNO. 2的核苷酸序列杂交，并且编码具有甘 油脱氢酶活性的蛋白质，其中所述甘油脱氢酶的编码基因来源于肺炎克雷伯氏菌； 所述甘油脱水酶的编码基因能够与SEQIDNO. 3的核苷酸序列杂交，并且编码具有甘 油脱水酶活性的蛋白质，其中所述甘油脱水酶的编码基因来源于丁酸梭菌； 所述醛脱氢酶的编码基因能够与SEQIDNO. 4的核苷酸序列杂交，并且编码具有醛脱 氢酶活性的蛋白质，其中所述醛脱氢酶的编码基因来源于大肠杆菌； 所述醇脱氢酶的编码基因能够与SEQIDNO. 5的核苷酸序列杂交，并且编码具有醇脱 氢酶活性的蛋白质，其中所述醇脱氢酶的编码基因来源于大肠杆菌； 所述醛醇氧化酶的编码基因能够与SEQIDNO. 6的核苷酸序列杂交，并且编码具有醛 醇氧化酶活性的蛋白质，其中所述醛醇氧化酶的编码基因来源于链霉菌； 所述过氧化氢酶的编码基因能够与SEQIDNO. 7的核苷酸序列杂交，并且编码具有过 氧化氢酶活性的蛋白质，其中所述过氧化氢酶的编码基因来源于大肠杆菌； 所述甘油酸氧化酶的编码基因能够与SEQIDNO. 8的核苷酸序列杂交，并且编码具有 甘油酸氧化酶活性的蛋白质，其中所述甘油酸氧化酶的编码基因来源于假单胞菌。
6. 根据权利要求1所述的一种利用基因工程蓝藻生产三碳化合物的方法，其特征在 于，所述蓝藻选自聚球藻属、集胞藻属、念珠藻属、隐球藻属、鱼腥藻属、球藻属、颤藻属、阿 格藻属、双歧藻属和鞭枝藻属中的一种。
7. 根据权利要求1所述的一种利用基因工程蓝藻生产三碳化合物的方法，其特征在 于，所述蓝藻为聚球藻属。
8. 根据权利要求1所述的一种利用基因工程蓝藻生产三碳化合物的方法，其特征在 于，包括以下步骤： 1) 将要转化到蓝藻中的基因启动子一同连接到重组质粒，将重组质粒转化到蓝藻中， 制得基因工程蓝藻； 2) 将步骤（1)中的基因工程蓝藻接种到BGll液体培养基中，30°C光照培养7-10天，制 得种子； 3) 将步骤⑵中制得的种子接种到新鲜BGll液体培养基中进行扩大培养，30°C光照培 养2-3天至OD73tol达到0. 5-0. 6,加入IPTG诱导基因表达，继续光照培养10-20天，得到含 有相应产物的培养液。
9. 根据权利要求8所述的一种利用基因工程蓝藻生产三碳化合物的方法，其特征在 于，所述步骤（1) (2) (3)中所述的光照培养为100UE? ?HT2光强度下连续光照，并连续 通入5 %体积比CO2气体。
10. 根据权利要求8所述的一种利用基因工程蓝藻生产三碳化合物的方法，其特征在 于，所述步骤（3)中，IPTG的终浓度为0. 1-2.OmM。
【专利摘要】本发明公开了一种利用基因工程蓝藻直接转化CO2生产三碳化合物的方法，是将三碳化合物合成途径的相关基因转化到蓝藻中，制得基因工程蓝藻，扩大培养基因工程蓝藻生产三碳化合物如二羟基丙酮、3-羟基丙酸、1,3-丙二醇、d-甘油酸和羟基丙酮酸。本发明所述的方法避免了生物质资源高成本的收集、处理和分解过程，直接使用廉价原料CO2作为碳源，生产应用广泛的化学品和燃料，可以减少大气中CO2的排放，具有推广应用价值。
【IPC分类】C12P7-18, C12P7-42, C12P7-28, C12N15-53, C12N15-60, C12N15-74, C12N15-55
【公开号】CN104726505
【申请号】CN201510146093
【发明人】许平, 王钰, 陶飞, 唐鸿志
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月31日