MicroRNA26b-3p抑制剂在制备人脐带来源间充质干细胞中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种MicroRNA26b-3p抑制剂在制备人脐带 来源间充质干细胞中的应用，也即一种促进人脐带来源间充质干细胞增殖的方法，及其将 该方法应用于制备组织工程细胞。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞（MSC)是残留在成体组织内的干细胞，具有无限扩增及多向分化 能力，由于MSC细胞的方便获取、较低的免疫原性、没有伦理争议以及分泌的营养因子，能 够抑制免疫反应、促进血管形成、营养周边细胞，而有望成为再生医学中一种令人振奋的种 子细胞。在2011年NIH官网的一项数据，列举了 19364例细胞治疗案例，其中206例是 MSC细胞相关的，用于治疗多种临床病变，部分实验已经到达临床试验III期。（Wang S，Qu X, Zhao RC. Clinical applications of mesenchymal stem cells[J]. J Hematol Oncol, 2012,5:19.)但是，人间充质干细胞体内含量少，即使在骨髓中，也只占据单核细胞的 0. 001-0. 01%，体外扩增培养会导致跟细胞增殖阻滞剂相关的衰老，且超过5代后细胞的 部分治疗特性会丧失，目前用于治疗应用的MSC细胞需求量基本都在1.0-2. OX 106MSCs/ kg，这些都极大限制了其在临床治疗中的应用。（Ikebe C, Suzuki K. Mesenchymal Stem Cells for Regenerative Therapy:Optimization of Cell Preparation Protocols[J]. Biomed Res Int，2014,951512.)。间充质干细胞可以从多种组织中分离得到，其中就包括 脐带来源的间充质干细胞，已有许多研宄报道其在伤口愈合、缺血性脑损伤及神经变性性 疾病中取得不错的疗效，加之其取材方便、对人体无伤害是较好的再生治疗细胞，拥有更好 的增殖能力，同其他类型间充质干细胞一样，也面临着有限的增殖能力及体外培养细胞干 性进行性丢失的问题。
[0003] miRNA，是一群内源性的小短、单链非编码RNA分子，大约由22个核苷酸组成，能 够通过非完全性碱基互补与靶mRNA特异性的结合而致靶mRNA降解或抑制蛋白翻译，从 而调控基因的表达（Eulalio A, Huntzinger E, Izaurralde E. Getting to the root of miRNA-mediated gene silencing[J]· Cell, 2008, 132(1) :9-14. )。microRNA 调控了体内 约60%的蛋白编码序列的表达，而且一个microRNA分子可以革El向几个mRNA，且目前越来 越多的证据表明，microRNA在动物及人体内参与调控MSC分化、增殖、存活、迀移等许多生 理过程（Clark EA, Kalomoiris S, Nolta JA, et al. Concise review:MicroRNA function in multipotent mesenchymal stromal cells[J]. Stem Cells, 2014, 32(5):1074-1082)〇 最近研宄报道miR-26b在肝癌、肺癌等许多肿瘤细胞的表达量下调（Liu XX，Li XJ，Zhang B, et al. MicroRNA-26b is underexpressed in human breast cancer and induces cell apoptosis by targeting SLC7A11 [J]· FEBS Lett，2011，585 (9) :1363-7.)，并且 miR-26b 在乳腺癌里可以通过靶向PTGS2、⑶K8等分子抑制癌细胞的增殖（Li J，Kong X，Zhang J, Luo Q,et al.MiRNA~26b inhibits cellular proliferation by targeting CDK8in breast Cancer、MiRNA_26b inhibits proliferation by targeting PTGS2in breast cancer[J]. Cancer Cell Int,2013,13(I):7.)〇
[0004] miR-26b位于宿主基因 CTDSPs的内含子区，经转录生成miR-26b-5p及 miR-26b_3p 两种 microRNA 分子（http://www. mirbase. org/)。虽然 microRNA 与细胞功能 的研宄越来越多，但目前尚无 Micr〇RNA26b-3p与人脐带来源间充质干细胞相关的研宄及 应用的文献报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供Mi cr〇RNA26b-3p抑制剂的新用途，本发明的另一目的 在于提供一种促进人脐带来源间充质干细胞增殖的方法，本发明的第三目的在于提供 MicroRNA26b-3p抑制剂或者利用MicroRNA26b-3p抑制剂促进人脐带来源间充质干细胞增 殖的方法在制备组织工程细胞中的应用。
[0006] 本发明为了克服人脐带来源间充质干细胞体外培养（制备）中增殖缓慢的缺陷， 提高人脐带来源间充质干细胞在再生医学中的临床应用效果，提供了借助MicroRNA-具体 为Micr 〇RNA26b-3p抑制剂促来实现人脐带来源间充质干细胞快速增殖的新方法。
[0007] 本发明所述的MicroRNA26b-3p (MIMAT0004500)，经查找miRBase数据库，其序列 如下：CCUGUUCUCCAUUACUUGGCUC(SEQ ID N0:1)。
[0008] 本发明的第一方面，提供了 MicroRNA26b-3p的新用途，即MicroRNA26b-3p在制备 促进人脐带来源间充质干细胞增殖的试剂中的应用。
[0009] 进一步地，本发明提供了 MicroRNA26b-3p抑制剂在制备促进人脐带来源间充质 干细胞增殖的试剂中的应用。
[0010] 本发明所述的促进人脐带来源间充质干细胞增殖的试剂，是指能够抑制或下调 MicroRNA26b-3p表达量的试剂。
[0011] 所述的能够抑制或下调Micr〇RNA26b-3p表达量的试剂，包括但不限于以下任一：
[0012] A)MicroRNA26b-3p 抑制剂；
[0013] B)含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组载体；
[0014] C)含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组病毒；
[0015] D)含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组病毒载体。
[0016] 在本发明的一个优选实施例中，所述的MicroRNA26b-3p抑制剂，具体序列如下：
[0017] GAGCCAAGUAAUGGAGAACAGG(SEQ ID N0:2)〇
[0018] 本发明所述的促进人脐带来源间充质干细胞增殖，是指体外培养的条件下，通过 质粒转染或慢病毒感染的方式抑制或下调人脐带来源间充质干细胞中的Micr 〇RNA26b-3p 表达量。
[0019] 本发明经实验证明，和阴性对照相比，MicroRNA26b-3p低表达的人脐带来源间充 质干细胞增殖速度加快。
[0020] 本发明的第二方面，提供一种促进人脐带来源间充质干细胞增殖的方法，该方法 包括：构建一种抑制或下调MicroRNA26b-3p表达量（也称为MicroRNA26b-3p低表达）的 人脐带来源间充质干细胞。
[0021] 较佳地，该方法包括I )和III )、或者II )和III):
[0022] I )人工合成MicroRNA26b-3p的抑制体，经脂质体转染，获得MicroRNA26b-3p低 表达的的人脐带来源间充质干细胞；
[0023] II )构建含有MicroRNA26b-3p抑制体的编码基因的重组载体、构建含有 MicroRNA26b-3p抑制体的编码基因的重组病毒，或构建含有MicroRNA26b-3p抑制体的编 码基因的重组病毒载体（简称为GFP-MIR-26b-3p);
[0024] 将获得的重组载体、重组病毒，或重组病毒载体转染人脐带来源间充质干细胞，获 得Micr 〇RNA26b-3p低表达的人脐带来源间充质干细胞；
[0025] III)步骤I )或II )得到的Micr〇RNA26b-3p低表达的人脐带来源间充质干细胞， 放入37°C 5%二氧化碳培养箱静置培养，所用培养基同未做处理的人脐带来源间充质干细 胞，均为10 %胎牛血清，高糖DMEM。
[0026] 本发明在人脐带来源间充质干细胞培养时，采用Edu掺入法（Peng F，Wu H，Zheng Y, et al. The effect of noncoherent red light irradiation on proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]·
[0027] Lasers Med Sci, 2012, 27 (3) :645-53.)测量人脐带来源间充质干细胞的增殖速 度，发现过表达Micr〇RNA26b-3p抑制剂的人脐带来源间充质干细胞，比转染阴性对照的人 脐带来源间充质干细胞，增殖速度显著加快。
[0028] 本发明的第三方面，提供了 Micr〇RNA26b-3p抑制剂在制备组织工程细胞中的应 用，以及或者一种促进人脐带来源间充质干细胞增殖的方法在制备组织工程细胞中的应 用。
[0029] 本发明获得了一种MicroRNA26b-3p低表达的人脐带来源间充质干细胞（也称为 重组人脐带来源间充质干细胞），所述的重组人脐带来源间充质干细胞进一步应用于制备 组织工程细胞。
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