030] 本发明的第四方面，提供了一种具有促进人脐带来源间充质干细胞增殖的产品 (试剂），所述的活性成分为以下任一：
[0031] A)MicroRNA26b-3p 抑制剂；
[0032] B)含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组载体；
[0033] C)含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组病毒；
[0034] D)含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组病毒载体。
[0035] 本发明经实验证明，MicroRNA26b-3p抑制剂过表达后，可抑制ESRl的表达。ESR1， Estrogen receptora，可以介导17β-雌二醇的促细胞增殖生物学效应。本发明中过表 达Micr〇RNA26b-3p抑制剂后，通过抑制ESRl的表达，可显著促进人脐带来源间充质干 细胞的增殖。因此说明，Micr 〇RNA26b-3p抑制剂与人脐带来源间充质干细胞增殖有关， Micr〇RNA26b-3p抑制剂可用于制备人脐带来源间充质干细胞、促进人脐带来源间充质干细 胞增殖。本发明克服人脐带来源间充质干细胞体外培养中增殖缓慢的缺陷，使人脐带来源 间充质干细胞可以大量地、低成本地在再生医学中得到广泛的临床。
【附图说明】
[0036] 图 1 为 RT-PCR 检测 MicroRNA26b_3p mimicus 及 Inhibitor 的过表达效率；其 中A为人脐带来源间充质干细胞过表达MicroRNA26b_3p mimicus(简称为ov26b_hUMSC) 中MicroRNA26b-3p的表达量；B为人脐带来源间充质干细胞过表达MicroRNA26b-3p Inhibitor (简称为 in26b-hUMSC)中 MicroRNA26b-3p 的表达量。
[0037] 图2为免疫荧光显微镜下观察ov26b-hUMSC、in26b-hUMSC中EdU掺入率情况；其 中A为ov26b-hUMSC掺入率下降；B为in26b-hUMSC升高；C为对照组EdU掺入情况；ABC分 别有三幅图，从左至右分别为100倍视野下染核DAPI、EdU、DAPI与EdU合并的荧光图；D为 ov26b-hUMSC、in26b-hUMSC及对照组nc组中EdU的掺入率的计量图。
[0038] 图 3 为 RT-PCR 和 western-blot 检测 ov26b-hUMSC、in26b-hUMSC 中 ESRl 的表达； 其中A为ov26b-hUMSC中ESRlmRNA表达量下降；B为in26b-hUMSC中ESRlmRNA表达量上 升；C 为 ov26b-hUMSC 及 in26b-hUMSCwestern-blot 中的观察结果，变化趋势同 RT-PCR。
[0039] 图4为293T细胞双荧光素酶报告基因实验来检测MicroRNA26b-3p与ESRl的靶 向结合作用。结果显示〇v26b组的荧光素酶活性下降而in26b则升高。
[0040] 图5为明视野下观察在ov26b-hUMSC、in26b-hUMSC分别加入ESRl受体的激动剂 17-β-EstradioK简称为E2)及抑制剂FulvestranU简称为F)后的细胞生长状态；其 中图 A 为过表达 MicroRNA26b_3pmimicus ;Β 为过表达 MicroRNA26b_3p mimicus24h 后加 入激动剂17-0_Estradiol ;C为不做什么处理的空白对照组；D为过表达MicroRNA26b-3p Inhibitor ;E 为过表达 MicroRNA26b_3p Inhibitor24h 后加入抑制剂 Fulvestrant。
【具体实施方式】
[0041] 现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0042] 本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或 按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0043] 实施例中所用的人脐带来源间充质干细胞（hUMSC)来源：取自经过书面同意 的足月产脐带，采用组织分离爬片法分离而来。（Drela Kl, Sarnowska Al, Siedlecka P，et al. Low oxygen atmosphere facilitates proliferation and maintains undifferentiated state of umbilical cord mesenchymal stem cells in an hypoxia inducible factor-dependent manner[J]. Cytotherapyj 2014, 16(7):881-92.)
[0044] 实施例1 :人脐带来源间充质干细胞过表达MicroRNA26b-3p mimicus及 Inhibitor
[0045] -、复苏人脐带来源间充质干细胞
[0046] 从液氮储存罐中取出hUMSC，置于37°C水浴锅中摇晃直至溶解。1000 rpm条件下离 心5min，弃上清，加入含FBS的DMEM(L)培养液Iml悬浮细胞，并转移至T25培养瓶中，加 培养液至5ml。置于37°C，5% CO2培养箱中孵育，每3天换一次培养液。
[0047] 二、细胞转染
[0048] 1.转染MicroRNA26b_3p mimicus及Inhibitor。（购自上海吉玛基因化学技术有 限公司，为能上调或下调hUMSC中MiciORNA26b-3p表达量的RNA小片段），转染试剂采用 Invitrogen公司的Lip〇fectamineK RNAimax Reagent，根据该公司指南转染细胞。
[0049] MicroRNA26b_3p 模拟物（mimicus)序列为：
[0050] 正义链（sense) :CCUGUUCUCCAUUACUUGGCUC(SEQ ID ΝΟ:1)
[0051] 反义链（antisense)GCCAAGUAAUGGAGAACAG⑶U(SEQIDNO:3)
[0052] MicroRNA26b_3p 抑制剂（inhibitor)序列为：
[0053] GAGCCAAGUAAUGGAGAACAGG(SEQ ID NO :2)
[0054] I).将生长良好的从步骤一得到的hUMSC于转染前一天接种到12孔板中（正常培 养，37度，5% C02培养箱），转染时细胞密度在50%左右。
[0055] 2) ·根据 Invitrogen 公司提供的 Lip〇fectamineK RNAimax Reagent 操作步骤转 染hUMSC。
[0056] 3) · 37 度，5% C02 培养箱继续培养 48 小时后，得到 ov26b-hUMSC 及 in26b-hUMSC， 以及其对照组 nc-hUMSC、innc-hUMSC〇
[0057] 2. RT-PCR 检测细胞中 MicroRNA26b-3p 的表达，
[0058] 利用RNAiso Reagent (TAKALA)提取上述获得的四组细胞的总RNA，并以总RNA为 模板，Micr〇RNA26b-3p引物（杰李公司合成），进行QRT-PCR，以U6为内参（杰李公司合 成），以nc-hUMSC、innc-hUMSC作为对照。结果如图1所示。
[0059] 实验结果显示，ov26b-hUMSC的相对表达率为20，nc-hUMSC的相对表达率 为I ; in26b-hUMSC的相对表达率为0. 25，innc-hUMSC的相对表达率为1。可以看出 MicroRNA26b-3p 在 ov26b-hUMSC 表达量上升而 in26b-hUMSC 中下降。
[0060] 引物序列如下：
[0061] U6的引物：
[0062] U6 的逆转录引物：5'AACGCTTCACGAATTTGCGT3'（SEQ ID N0:4)
[0063] 通用引物：5'CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3'（SEQ ID N0:5)
[0064] 正向引物：5'GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3'（SEQ ID N0:6)
[0065] MicroRNA221-3p 的引物：
[0066] MicroRNA26b-3p 的逆转录引物：
[0067] 5'GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGGAATTGCACTGGATACGACGAG CC3'（SEQ ID NO :7)
[0068] 通用引物：5, CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3,（SEQ ID N0:8)
[0069] 正向引物：5，GGCCTGTTCTCCATTACTTGG3,（SEQ ID N0:9)
[0070] 实施例2 :利用EdU掺入实验研宄ov26b-hUMSC及in26b-hUMSC的增殖特性
[0071] 取生长状态良好的hUMSC铺于48孔中，待细胞长至50%聚合度时，按上述方法转 染hUMSC后，培养箱孵育48小时后，用EdU试剂盒来检测细胞的增殖，其中EdU试剂盒购自 锐博生物科技有限公司，所有步骤严格按照此产品的说明书进行。
[0072] 荧光显微镜下观察，实验结果如图2所示。
[0073] 实验结果显示，相对于图C对照组（nc组）的EdU掺入荧光量，图A结果显示 ov26b-hUMSC EdU掺入率明显减少，图B结果显示in26b-hUMSCEdU掺入率明显升高。图D 为ov26b-hUMSC、in26b-hUMSC及对照组nc组中EdU的掺入率的