计量图
[0074] 实施例3、MicroRNA26b-3p可以负调控ESRl的表达
[0075] I. RT-PCR 检测 ESRlmRNA 的表达水平
[0076] 利用RNAi so Reagent (TAKALA)提取上述获得的四组细胞的总RNA，逆转录为 cDNA。设计引物，检测ESRlmRNA表达水平。GAPDH作为检测用内参。以nc-hUMSC、innc-hUMSC 作为对照。
[0077] 引物序列如下：
[0078] ESRl的引物如下：
[0079] 正向引物：5' ATGAAAGGGATACGAAAAGACCG3'（SEQ ID NO: 10)
[0080] 反向引物：5，TTGGCAGCTCTCATGTCTCC3,（SEQ ID N0:11)
[0081] GAPDH的引物如下：
[0082] 正向引物：5'GGCCTCCAAGGAGTAAGACC3'（SEQ ID N0:12)
[0083] 反向引物：5'AGGGGTCTACATGGCAACTG3'（SEQ ID N0:13)
[0084] 结果如图3所示，可见ov26b-hUMSC中ESRl的mRNA表达降低而in26b-hUMSC中 增加。
[0085] 2. western-blot检测ESRl蛋白的表达水平
[0086] (1)去上述RNAiso Reagent(TAKALA)抽提总RNA后的样品来抽提其中的总蛋白， 操作流程参照相应说明书。
[0087] (2)用1% SDS溶解蛋白，加入适量的4XLoading Buffer后，在EP管中煮沸 IOmin.
[0088] (3)待样品恢复到室温后上样。
[0089] (4)电泳、转膜。
[0090] (5)浸没于5%脱脂奶粉封闭液中室温缓慢摇荡一小时。一抗4°C孵育过夜。
[0091] (6)根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择辣根过氧化物酶（HRP)标 记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000)，室温轻摇一小时。
[0092] (7)洗绦，使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法。
[0093] 实验结果如图3图A结果显示同对照组nc-hUMSC相比，ov26b-hUMSC组ESRl的 mRNA表达量显著降低；图B结果显示in26b-hUMSC组相对innc-hUMSC，ESRl的mRNA表达量 显著升高；图C为上述处理过的人脐带来源间充质干细胞中ESRl蛋白水平的表达量变化。 图3结果说明MicroRNA26b-3p可以在ESRlmRNA及蛋白同时抑制ESRl的表达。
[0094] 实施例4 :293T中双荧光素酶报告基因系统检测MicroRNA26b-3p与ESRl的靶向 结合
[0095] 1.准备质粒以下两种质粒，如下：
[0096] (l)pRL-TK质粒，作为拉平转染影响的内参质粒
[0097] (2)构建pMIR-R印ort质粒中带有ESR1CDS序列中MicroRNA26b-3p靶向结合附近 各300bp片段的重组载体（简称为pMIR-ESRl)
[0098] (3)将上述两种质粒摇菌并去内毒素抽提试剂盒（购自Axygen公司）抽提，用于 转染细胞。
[0099] 2.准备细胞
[0100] 实验采用易繁殖同时转染效率高的工具细胞HEK-293T，以每孔IxlO4个细胞每ml 的密度铺余96孔板中，设2个复孔。待细胞70-80%融合度时，按上述方法进行转染。
[0101] 3.双荧光素酶报告基因实验
[0102] 试剂盒购自promega公司，并严格按照相应说明书来进行实验。测定完成后，将 Excel表格拷出并进行实验结果整理。
[0103] 实验结果如图4所示，ov26b组荧光素酶降解的底物减少，说明pMIR-ESRl表达量 下降，也说明MicroRNA26b-3p可以通过DNA碱基配对ESRl，而in26b组没有预期中的升高， 可能是与293T中MicroRNA26b-3p的本地表达量不高。图4结果显示MicroRNA26b-3p可 以通过碱基互补结合ESRlmRNA,从而抑制ESRl的表达.
[0104] 实施例5 :ov26b-hUMSC、in26b-hUMSC分别加入E2、F后观察细胞增殖状态
[0105] 将过表达 MicroRNA26b_3p mimicus、Inhibitor 及加入激动剂 17-β-Estradiol、 抑制剂Fulvestrant后的hUMSC置于倒置显微镜下观察并拍照记录。
[0106] 实验结果如图5所示，相对于不做任何处理组（blank组），100X明视野下 〇V26b-hUMSC、in26b-hUMSC的细胞数目分别减少、升高，而在加入相应E2及F后，细胞数量 分别有所增加及减少。更加说明，Micr 〇RNA26b-3p是通过ESRl来起到调控hUMSC细胞增 殖。
[0107] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述 实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的 变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【主权项】
1. Micr〇RNA26b-3p在制备促进人脐带来源间充质干细胞增殖的试剂中的应用，其特征 在于，所述的促进人脐带来源间充质干细胞增殖的试剂是能够抑制或下调MicroRNA26b-3p 表达量的试剂。 2. Micr〇RNA26b-3p抑制剂在制备促进人脐带来源间充质干细胞增殖的试剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的Micr〇RNA26b-3p抑制剂在制备促进人脐带来源间充质干细 胞增殖的试剂中的应用，其特征在于，所述的促进人脐带来源间充质干细胞增殖的试剂是 能够抑制或下调MicroRNA26b-3p表达量的试剂。
4.根据权利要求2所述的MicroRNA26b-3p抑制剂在制备促进人脐带来源间充质干细 胞增殖的试剂中的应用，其特征在于，所述的能够抑制或下调MicroRNA26b-3p表达量的试 剂，包括以下任一： A) MicroRNA26b-3p抑制剂； B)含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组载体； C)含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组病毒； D) 含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组病毒载体。
5.根据权利要求2所述的Micr〇RNA26b-3p抑制剂在制备促进人脐带来源间充质干细 胞增殖的试剂中的应用，其特征在于，所述的MicroRNA26b-3p抑制剂的序列如SEQIDNO:2 所示。
6. -种促进人脐带来源间充质干细胞增殖的方法，其特征在于，该方法包括：构建一 种Micr〇RNA26b-3p低表达的人脐带来源间充质干细胞。
7. 根据权利要求6所述的一种促进人脐带来源间充质干细胞增殖的方法，其特征在 于，该方法包括I)和III)、或者II)和III): I )人工合成MicroRNA26b-3p的抑制体，经脂质体转染，获得MicroRNA26b-3p低表达 的的人脐带来源间充质干细胞； II )构建含有Micr〇RNA26b-3p抑制体的编码基因的重组载体、构建含有 MicroRNA26b-3p抑制体的编码基因的重组病毒，或构建含有MicroRNA26b-3p抑制体的编 码基因的重组病毒载体； 将获得的重组载体、重组病毒，或重组病毒载体转染人脐带来源间充质干细胞，获得Micr〇RNA26b-3p低表达的人脐带来源间充质干细胞； III)步骤I)或II)得到的MicroRNA26b-3p低表达的人脐带来源间充质干细胞，放入 37°C5%二氧化碳培养箱静置培养，所用培养基同未做处理的人脐带来源间充质干细胞，均 为1〇%胎牛血清，高糖〇1^皿。 8. MicroRNA26b-3p抑制剂在制备组织工程细胞中的应用，所述的组织工程细胞是由一 种MicroRNA26b-3p低表达的人脐带来源间充质干细胞制备得到的。
9. 一种如权利要求6或7所述的促进人脐带来源间充质干细胞增殖的方法在制备组织 工程细胞中的应用，所述的组织工程细胞是由一种Micr〇RNA26b-3p低表达的人脐带来源 间充质干细胞制备得到的。
10. -种具有促进人脐带来源间充质干细胞增殖的试剂，其特征在于，所述的试剂中活 性成分为以下任一： A)MicroRNA26b-3p抑制剂； B) 含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组载体； C) 含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组病毒； D) 含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组病毒载体。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，本发明提供了MicroRNA26b-3p抑制剂在制备促进人脐带来源间充质干细胞增殖的试剂中的应用，所述试剂包括但不限于：1)MicroRNA26b-3p抑制剂；2)含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组载体；3)含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组病毒；4)含有MicroRNA26b-3p抑制剂编码基因的重组病毒载体。本发明实验证明，MicroRNA26b-3p抑制剂可以增加雌激素受体的表达，显著提高人脐带来源间充质干细胞的增殖速度。本发明为人脐带来源间充质干细胞快速增殖以及更快获得再生医学中间充质干细胞的临床应用的细胞提供了新的思路和方式。
【IPC分类】C12N15-86, C12N15-88, C12N15-113, C12N5-10, C12N15-85
【公开号】CN104726500
【申请号】CN201510107949
【发明人】刘厚奇, 王巧玲, 徐辰, 王越, 仵敏娟
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月12日